PLoS One: Összehasonlító proteomikai analízise Gyomorrák Stem Cells

absztrakt katalógusa

Rák őssejtek (CSC) felelős a rák kifejlődésének, metasztázis és kiújulás. A mai napig, a specifikus markerek a CSC nem derül fény. A vizsgálat célja az volt, hogy meghatározzák az új biomarkerek gyomor- CSC klinikai diagnosztika proteomikai technológia. CSC-szerű SP sejtek, OCUM-12 /SP sejtek, OCUM-2MD3 /SP-sejtek, és ezek szülő OCUM-12 sejtek és OCUM-2MD3 sejteket használtunk ebben a vizsgálatban. Fehérje lizátumok egyes sejtvonalakból analizáltuk QSTAR Elite folyadék-kromatográfiával, tandem tömegspektrometriás, párosulva izobár címke relatív és abszolút mennyiségi technológia. Candidate fehérjék kimutathatók proteomikai technológia hagyta jóvá immunhisztokémiai vizsgálata 300 gyomorrák. Az eredmények alapján az LC-MS /MS, nyolc fehérjék, beleértve a RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, és KRT18, voltak akár szabályozott mindkét OCUM-12 /SP sejtek és OCUM-2MD3 /SP sejtek összehasonlítva a megfelelő szülő sejteket. RT-PCR elemzés azt mutatta, hogy az expressziós szintje RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1 katalógusa, és a CK18
magas volt OCUM-12 /SP és OCUM-2MD3 /SP, az a kontrollhoz képest a szülő OCUM-12 és OCUM-2MD3. Ezek a fehérjék szignifikáns összefüggést mutatott a fejlett invázió mélysége, nyirokcsomó áttét, távoli áttétek, vagy előrehaladott klinikai stádiumban. RBBP6, DCTPP1, HSPA4 és ALDOA kifejezés különösen szignifikáns összefüggést mutattak a rossz prognózist a 300 gyomorrákos betegek. RBBP6 elhatározta, hogy egy független prognosztikai faktor. A motilitás-stimuláló képességét OCUM-12 /SP sejtek és OCUM-2MD3 /SP sejtek gátolta RBBP6 katalógusa siRNS. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a nyolc fehérjék, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA és KRT18 felhasználásával összehasonlító proteomikai analízis, az volt a közfelfogás, hogy a potenciális CSC markerek gyomorrák. A nyolc jelölt fehérjék, RBBP6 javasolták, hogy egy ígéretes prognosztikai biomarker és terápiás célpontként gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) összehasonlító proteomikai analízise Gyomorrák őssejtek. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10,1371 /journal.pone.0110736 katalógusa

Szerkesztő: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama at Birmingham, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: május 3., 2014; Elfogadva: szeptember 16, 2014; Megjelent: november 7, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Az adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az összes adatot a megállapításokat alátámasztó teljes mértékben hozzáférhető, korlátozás nélkül. Minden lényeges adat a papír és az azt támogató információs fájlokat. Hozzáférési számait protein adatok szerepelnek, mint UniProt /Swiss-Prot 2. táblázatban katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány részben finanszírozza KAKENHI (Grant-in-Aid for Scientific Research, sz. 22390262, 23390329, 26293307 és ), a Nemzeti Rákkutató Központ Kutatási és Fejlesztési Alap (23-a-9), valamint a kiemelt kutatási alap Osaka City University. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Rák őssejtek (CSC) vannak meghatározva, mint egy egyedülálló szubpopuláció tumorokban, hogy rendelkezik a képességét, hogy kezdeményezzen a tumor növekedését és fenntartsa önmegújító [1]. Azt javasolták, hogy ezek a szerek a heterogén Lineage rákos sejtek alkotják a daganat, valamint fontos szerepet játszanak a malignus előrehaladásának karcinóma, mint például a távoli áttétek, kiújulás, és kemorezisztencia [2] - [4]. CSC eredetileg azonosították az akut myeloid leukémia [5], de az utóbbi időben kimutatták, hogy létezik sokféle daganat, például gyomorrák [6]. Az azonosító CSC markerek nyithat új terápiás szempontból alapján szelektíven célozza meg ezt a kis sejtek populációja [7], [8]. Újabban arról számoltak be, hogy a CSC esetleg csinálni kifejezni a saját egyedi markerek, mint például aldehid-dehidrogenáz 1 (ALDH1) [9], a CD44 [10], [11], és a CD133 [12]. Azonban sok a közzétett markerek nem egyedülálló CSC. Mennyiségi fehérje expressziós profil lehetővé teszi a hatékony azonosítását pontos és reprodukálható differenciális expressziós értékek fehérjék [13]. Izobár címkék abszolút és relatív mennyiségi (iTRAQ) kombinált többdimenziós folyadékkromatográfia (LC) és tandem tömegspektrometria (LC-MS /MS) analízis van kialakulóban, mint egy erős módszer a keresést tumor biomarkerek [14]. Mi korábban beszámolt arról, hogy az oldalsó populáció (SP) sejtek képesek önálló megújítására és előállítása nem-SP sejtek, és hogy a rákos sejtek a SP frakciókat rendelkeznek a magas potenciált tumorképző, távoli áttét, [3] és a kemorezisztencia [2]. Ez arra utal, hogy a SP sejtek gyomorrák rendelkeznek rákos őssejt-szerű tulajdonságokkal. Ezért a jelen vizsgálat célja az volt, hogy megvizsgáljuk egy újszerű CSC marker (ek) a gyomorrák összehasonlításával proteomes között szülő-sejtek és az őssejt-szerű SP sejtek már ismert, hogy rendelkeznek egy gazdag CSC lakosság [15].

anyagok és módszerek

Cell Cultures

Két gyomor rákos sejtvonalak, OCUM-2MD3 [16] és OCUM-12 [17], használtuk ebben a vizsgálatban. Ezeket a sejtvonalakat származó diffúz típusú gyomorrák. A tenyészetet feltétel tenyésztünk Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközeg (DMEM; Nikken, Kyoto, Japán) és 10% hővel inaktivált magzati borjúszérummal (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicillinnel és sztreptomicinnel, és 0,5 mM nátrium-piruváttal, és inkubáljuk 37 ° C-on. OCUM-12 /SP és OCUM-2MD3 /SP sejtvonalak voltak SP sejtek hogy értékeltük áramlási citometriás analízissel Hoechst 33342 a szülő sejtvonalak, OCUM-2MD3 és OCUM-12, ill. Válogató végeztünk háromszor létrehozni egy stabil populáció SP dúsított sejtek. Miután a három hónapos inkubációs periódus utáni rendezés, OCUM-12 /SP sejtek (6,5%) és OCUM-2MD3 /SP sejtek (12,2%) a képviselők még nagy százalékban az SP-frakció, míg a szülő OCUM-12 (3,2% ) és OCUM-2MD3 (6,3%) sejtekben (ábra S1). Ezt követően a SP-dúsított sejtek stabil populáció volt az alkalmazott sejtvonalak az elemzést, mivel azt korábban jeleztük [18]. Katalógusa

Az emberi szövetminták és betegtájékoztató

szövetmintából kaptuk 300 betegnél diagnosztizáltak gyomorrák megengedett műveletek Osaka City University. Az 1. táblázat mutatja a klinikai és patológiai jellemzői a 300, gyomor rákos betegeknél. Voltak 208 férfi és 92 nőbeteg, az átlagos életkora 64 év volt (tartomány, 28-85 év) idején működését. A diagnózis megerősítette legalább két ember. Staging szerint határoztuk meg a japán besorolása gyomorrák (14 ^{th kiadás) [19]. Ez a tanulmány által jóváhagyott Osaka City University etikai bizottság (Osaka, Japán). Írásos beleegyezését adta a donor kaptuk használja ezt a mintát a kutatásban. Katalógusa}

Protein azonosítása és mennyiségi meghatározása szerint QSTAR Elite LC-MS /MS katalógusa

A rákos sejtek (60 ug) homogenizáljuk és ezután lizáltuk segítségével akár 100 ul T-PER lízispufferben (Thermo Scientific) vagy 500 | il 9 M karbamidot, 2% CHAPS lízispufferben egy proteáz inhibitor. Ezt követően, a sejt lizátumot ezután ultrahangos kezeléssel. Miután aceton kicsapás, fehérje koncentrációkat mértük BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Reduction, alkilezés, az emésztést, és az azt követő peptid címkézése 50 ug fehérje az egyes minták alkalmazásával hajtottuk végre az AB Sciex iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit (AB Sciex, Concord, ON, Kanada) [20]. A iTRAQ-jelölt mintákat felvisszük egy ICAT kationcserélő patron (AB Sciex). A peptideket eluáltuk hat frakciókat (1 ml KCl-oldat 10, 50, 70, 100, 200, és 350 mm), és a felülúszót minden egyes elpárologtatjuk belül vákuum centrifugában. A mintákat ezután sómentesítjük és koncentráljuk segítségével Sep-Pak Fény C18 patron (Waters Corporation, Milford, MA), bepároljuk, belül egy vákuum-centrifugában, újra szuszpendáljuk 20 | il 0,1% -os (v /v) hangyasavval, és ezt követően visszük QSTAR Elite LC -MS /MS. Mindegyik mintát futtatni 150 percen át. MS /MS adatokat kerestek ellen Swiss Protein adatbázisból (humán) alkalmazásával ProteinPilot szoftver (2.0 verzió, AB Sciex) tripszin beállítva emésztés enzim és metil methanethiosulfinate a cisztein módosítást. Annak érdekében, hogy kiküszöbölhetők a felesleges találatot és összehasonlító mennyiségi, a keresési eredmények tovább feldolgozta ProteinPilot szoftvert a Paragon algoritmus. Ennek következtében a minimális készlet igazolható azonosított fehérjék. Valamennyi jelentett adat volt használva, 95% -os megbízhatósági cut-off határ. Relatív mennyiségi peptidek a kiszámítása az adott arány elosztjuk a iTRAQ riporter intenzitását. Az arányokat a peptidek, amelyek támogatják a létezését egy fehérje átlagoltuk a relatív protein mennyiségi. Ezt követően a ProteinPilot elemzés és találékonyság útvonal analízis (IPA) (Ingenuity rendszer, Mountain View, CA) végeztük. Elvégzése után egy egyszerű t-próba egy, a számított átlagolt fehérje arány, míg 1 érvényességének vizsgálatára a fehérje expressziós változásait, a p-értéket jelentett. Protein arányok a p-érték kevesebb, mint 0,05 megbízhatónak tartották. Meg kell tudni, hogy a 90% -a iTRAQ kísérleti futás végzett korábban, a standard eltéréseket a fehérje arányok, ami abból ered, műszaki variációk, leírták, hogy kevesebb, mint 0,3. Ezért kifejezés változik nagyobb, mint 1,2-szeres vagy kevesebb, mint 0,8-szeres normalizált expressziós szinteket kell tekinteni tartományon kívüli műszaki variabilitás. Mi is végeztünk egy nem-jelzett elemzése, és kimutatható a proteinek jelenlétét csak belül OCUM-12 /SP sejtek és OCUM-2MD3 /SP sejteket, de nem tartozik a szülő-sejtek [21]. Minden egyes mintát kétszer hajtottuk végre. Az alkalmazott LC-MS /MS vizsgálat párosulva iTRAQ technológia számoltak, mint egy megbízható kvantitatív módszer fehérje expressziója, hogy még érzékenyebb, mint a Western-blot, amely típusától függ az alkalmazott antitestek [22].

IPA és kiválasztása jelölt fehérjék katalógusa

az IPA adatbázis elsősorban olyan, a törzskönyvezett ontológia, amely akár 300.000 biológiai cikkek, beleértve a géneket, fehérjéket, molekuláris és sejtszintű folyamatokat. Ezért, az IPA-t alkalmazunk az elemzéshez a fehérje molekuláris funkciók, lokalizáció. Ezen túlmenően, a részletes információkat a funkciók és a celluláris helyszínen az azonosított fehérjék kapunk. Az eredmények alapján a LC /MS és az IPA elemzések, fehérjék, amelyek figyeltek, hogy túlzottan kifejezett SP sejt-vonalak, ha összehasonlítjuk a hozzájuk tartozó gyakorisága expresszió szülő sejt-vonalak, választottunk jelölt biomarkerek SP sejtek gyomorrák. Az azonosító hálózatok kölcsönható fehérjék, valamint a funkciós csoportokat és átjárási generálta IPA, és az elemzés függ a korábban jellemzett szervezetekkel.

kvantitatív, valós idejű reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció (RT-PCR ) hotelben

A gyomorrák sejteket. És a teljes sejtes RNS-t kivontuk az RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNS-t készítünk 2 ug RNS-t random primerek (Invitrogen). Annak meghatározására szeres változásokat minden gén, RT-PCR-t végeztünk az ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), a kereskedelemben kapható génexpressziós vizsgálatokban (Applied Biosystems) a RBBP6 katalógusa ( retinoblasztóma kötő fehérje 6 katalógusa; Hs00544663), HSPA4 katalógusa ( hősokk 70 kDa méretű fehérje 4 katalógusa; Hs00382884), HSPA9 katalógusa ( hősokk 70 kDa fehérje 9 katalógusa; Hs00269818), GLG1 katalógusa (Golgi glikoprotein 1. Hs00939452), DCTPP1 katalógusa ( dCTP pirofoszfa 1 katalógusa; Hs00225433), VPS13A
( vacuolar fehérje válogatás 13 homológ Egy fiatal, Hs00362891), CK18 (keratin 18 katalógusa; Hs028277483), ALDOA (aldoláz Egy fiatal, Hs00605108), CD44 katalógusa (Hs01075862), CD133 katalógusa (Hs01009250) és a Nanog katalógusa (Hs02387400). GAPDH (SIGMA) használunk belső standardként normalizálni mRNS szinteket. A küszöb ciklus (Ct) értékeket kiszámításához használt relatív expressziós közötti arányok kezelt és a kontroll sejteket.

Western-blot-analízis

expressziós szintjének RBBP6 és ALDOA a rákos sejtekben vizsgáltuk az alábbiak szerint. A sejtlizátumokat összegyűjtjük, miután különböző kezelések. Miután a fehérje-koncentráció minden minta-ját, elektroforézis alkalmazásával hajtottuk végre 10% -os Tris /Gly géleken (Life Technologies, Carlsbad, CA). A fehérje kapott sávok átvittük Immobilon-P transzfer membrán (Amersham, Aylesbury, UK). Ezután a membránt helyezünk PBS-T-oldattal, amely az anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), az anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS), és anti-β-aktin (1:300 hígítás; Sigma Aldrich), és hagyjuk reagálni szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük. A szinteket a specifikus fehérjék egyes lizátum mutattunk erősített kemilumineszcenciás felhasználásával ECL plus (Amersham), majd autoradiográfiás vizsgálatot végzünk.

kis interferáló RNS Tervezés

A szekvenciákat RBBP6
kis interferáló RNS (siRNS) vannak kialakítva, a következők szerint: si RBBP6 katalógusa értelemben, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; antiszensz, 5'AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ', és nontargeting siRNS (negatív-siRNS) vásároltunk a Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP és OCUM-2MD3 /SP sejteket állítottunk elő 60% -os összefolyásig hat-lyukú. A transzfekciós keveréket úgy állítjuk elő, 150 | il Opti-MEM-mel, beleértve 9 jil Lipofectamine RNS iMAX Regant (Life Technologies) és 150 | il Opti-MEM-mel, beleértve a 90 pmol siRNS és inkubáljuk 5 percig szobahőmérsékleten. Végül a fenti transzfekciós keveréket adunk, az elkészített hat lyukú étel. Huszonnégy órával a transzfekció után, RT-PCR-t végeztünk.

sebgyógyító Assay

Cancer sejteket 96 lyukú lemezekre (Essen Instruments, Birmingham, UK). Miután a sejtek elérték a félig torkolat, egy seb hoztak létre a sejt monoréteg a 96-lyukú által WoundMaker (Essen Bioscience, MI, USA). Karcos mezők vettünk képen 3 óránként, és követtük nyomon Incucyte Élő-Cell Imaging System és szoftver (Essen Instruments). A mértéke sejt vándorlás elemeztük után 24 órával seb kezelés százalékában seb összefolyása. Az átlag 4 mező számítottuk a minta érték. Katalógusa

Invasion Analitika katalógusa

Mi használtuk chemotaxicell kamrák (Kubota, Osaka, Japán), 12-um pórusú membránszűrő bevonva 50- ng Matrigel (Collaborative Research Co., Bedford, MA). A kamra (felső komponens) helyeztünk egy 24-lyukú tenyésztő lemezen (alsó komponens). Gyomorrák sejteket újra szuszpendáljuk, hogy a végső koncentráció 5 × 10 ^{3 sejt /ml. Ezután 500 ul alsó alkatrészeket. Az inkubálás után 48 órán át, a rákos sejtek a felső felületén a membrán eltávolítjuk törléssel és megfestettük hematoxilinnal. A rákos sejtek, hogy betört egy szűrőn keresztül bevont Matrigel az alsó membrán manuálisan mikroszkóp alatt megszámoltuk a × 200 nagyítással. Hat véletlenszerűen kiválasztott területeken számoltuk vizsgálnak. Az átlagos négy mezőből számítottuk a minta érték. Minden csoport, a tenyészetet három párhuzamossal végzünk.}

validálása fehérje expresszióját immunhisztokémiai

immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk, formalin-fixált, paraffinba ágyazott szöveti mintákat, amelyeket paraffint xilolban és dehidratált keresztül osztályozott etanol. A metszeteket 10 percig melegítjük 105 ° C hőmérsékleten autoklávban Target Retrieval Solution (DAKO). A mintákat ezt követően inkubáltuk 3% -os hidrogén-peroxidot, hogy blokkolja az endogén peroxidáz aktivitást. A következő antitesteket használtuk a immunhisztokémiai folyamat: anti-RBBP6 (retinoblasztóma kötő fehérje 6; WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgi glikoprotein 1; HPA010815, 1:80; ATLAS), anti-VPS13A (vakuoláris fehérje válogató 13 homológ A; NBP1-85642, 1:500; Novus Biologicals), anti-ALDOA (aldoláz A, fruktóz-biszfoszfát; HPA004177, 1:400; ATLAS), anti-DCTPP1 (dCTP pirofoszfatáz 1; HPA002832, 1:200; ATLAS), anti-HSPA9 (hősokk 70 kDa-os fehérje; 9 HPA000898, 1:200; ATLAS), anti-HSPA4 (hősokk 70 kDa méretű fehérje 4; HPA010023, 1:200; ATLAS), és anti-KRT18 (keratin 18; ab668, 1:500; ABCAM). A mintákat inkubáltuk mindegyik antitest egy éjszakán át körülbelül 4 ° C-on. Ezt követően, a mintákat inkubáltuk előirányzott immunglobulin G-10 percig, majd háromszor mossuk PBS-sel. Minden mintát ezután sztreptavidin-peroxidáz reagenst, és inkubáljuk PBS-diaminobenzidin és 1% hidrogén-peroxidot (térfogat /térfogat), majd counterstaining Mayer-féle hematoxilinnel.

immunohisztokémiai vizsgálata

RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA és KRT18 expressziós szinteket kiértékelte intenzitása festéssel és aránya festett tumorsejteket. A festődés intenzitása pontoztuk skálán 0-3 (0 = nincs, 1 = enyhe, 2 = közepes, 3 = erős). Festés arányok pontoztuk skálán 0-4 (a százalékos volt különböző minden egyes ellenanyag) alapján a százalékos aránya pozitívan festett sejteket. Ezért a végső festés pontszámot, ami számítottuk többszöröse a festés intenzitása pontszám, és a festési aránya pontszám lenne skálán 0-12. Expressziós szintjét DCTPP1 tekintettük pozitívnak, ha a kapott pontszáma 3. expressziós szintje HSPA4 tekintettük pozitívnak, ha a kapott pontszáma 6. expressziós szintjének ALDOA, KRT18, VPS13A és GLG1 tekintettük pozitívnak, ha minden pontot kapott 8. RBBP6, az értékelés, amely csak a festés aránya pontszámot számításhoz használt, akkor tekintettük pozitívnak, ha pontot kapott 3. HSPA9, az értékelés, amely csak a festés intenzitása pontszámot számításhoz használt, akkor tekintettük pozitívnak, ha pontot kapott 3. Minden értékelést készítette két megfigyelő, akik nincsenek tisztában a klinikai adatok és eredményéről. Ha egy eltérő értékelést két független megfigyelő találtak a metszeteket ismételten ellenőrizni és újra megvizsgáltuk megbeszélés után. Katalógusa

Statisztikai elemzés katalógusa

A SPSS szoftver (SPSS Japán, Tokió, Japán) használtunk adatelemzés. A statisztikai szignifikanciát a szervezetek közötti fehérjék expresszióját és a különböző klinikopatológiai változókat, beleértve a kor, nem, makroszkopikus típus, a tumor differenciálódásának, teljes száma kimetszett nyirokcsomót, és a műtét típusa (D1 vagy D2 gastrectomián) alkalmazásával értékeltük Fisher és a Chi -squared vizsgálatok. A túlélési görbéket számítva a műtét napján, hogy a halál pillanatában, vagy a legutóbbi nyomonkövetési megfigyelés a Kaplan-Meier módszer. Emellett bármilyen különbség túlélési görbéket értékelték a log-rank teszt. A többváltozós elemzéseket végeztünk szerint Cox regressziós modell meghatározására az egyesületek közötti klinikopatológiai paramétereivel és a mortalitás. P-értékek < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

A stemness gyomorrák sejtvonalak

A százalékos SP sejtek magasabb volt a OCUM-12 /SP és OCUM-2MD3 /SP sejtekben, mint a szüleik OCUM-12 és OCUM-2MD3 sejtek (ábra S1). Rák őssejt markerek SP sejtek, OCUM-12 /SP és OCUM-2MD3 /SP, mint például a CD44, CD133, és Nanog, analizáltuk RT-PCR-rel. Az expressziós szint ezen markerek szignifikánsan emelkedett volt mindkét SP sejtvonalakban, összehasonlítva a szülő sejtvonalak (ábra S2). Száma szferoid kolónia szignifikánsan nagyobb volt mindkét OCUM-12 /SP és OCUM-2MD3 /SP sejtek, mint a szülő OCUM-12 és OCUM-2MD3 sejtekben (adatokat nem köziünk).

kimutatása Candidate Proteins

Megvizsgáltuk, hogy a fehérjéket differenciáltan, vagy egymástól függetlenül kifejezett SP sejtek, és összehasonlítva a megállapításokat e a szülő sejtek felhasználásával QSTAR Elite LC-MS /MS. Elemezve a biológiai folyamatok, és a 95% -os megbízhatósági cut-off limit és p < 0,05 azonosítottunk, hogy a fehérjék valóban eltérően expresszált. A kapott eredményeket a következő megállapítások a 1. ábra A legtöbb fehérjék túlexpresszált citoplazmájában tumorsejtek (1a ábra). A p-érték szerepel a leleményesség elemzés táblázatban szereplő S1. Ezek a fehérjék határoztuk, hogy kapcsolatban áll a celluláris folyamatok, mint például a sejthalál, metabolizmus, sejtes szervezet, a DNS anyagcserét, protein degradáció, és feldolgozása RNS-t (1B ábra). A felső kanonikus utak társított ezeket a célokat, és azonosítjuk az IPA táblázatban mutatjuk be az S2.

Ha összehasonlítjuk a megfelelő szülő-sejtek, 40 fehérjék voltak up-szabályozott OCUM-12 /SP, és 35 fehérjék voltak akár -regulated a OCUM-2MD3 /SP. Ezek közül a fehérjék közül nyolc serkentő szabályozás mind OCUM-12 /SP sejtek és OCUM-2MD3 /SP sejtek, mivel nincs ilyen összefüggés volt kimutatható közötti megfelelő szülő-sejtek (2. táblázat és 1C). E nyolc fehérjék, a három fehérje, RBBP6, GLG1, és VPS13A voltak függetlenül kimutatható mindkét SP sejtvonalak, de nem a megfelelő szülő sejteket. Az öt fehérjék, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA és KRT18, szignifikánsan túiexpresszálódó legalább 1,2-szeres mindkét SP sejtek képest a megfelelő szülő-sejtek. Katalógusa

Az mRNS expressziós szintjét ezeknek 8 molekulák, RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1 katalógusa, és CK18 katalógusa növeltük OCUM-12 /SP (9,15-szeres, 9,36-szeres, 4,14-szeres, 7,80-szeres, 2,08-szeres, 1,46-szeres, 3,44-szeres, és 1,99 szoros volt), és OCUM-2MD3 /SP (6,15-szeres, 1,71-szeres, 2,33-szeres, 2,30-szeres, 2,03-szeres, 1,32-szeres, 1,35-szeres és 1,31-szeres, -kal) sejtek, összehasonlítva a kontroll szülő OCUM-12 és OCUM-2MD3 sejtek (1D ábra). Western-blot analízis azt jelezte, hogy az expressziós szintje RBBP6 és ALDOA magas volt cum-12 /SP és OCUM-2MD3 /SP sejtek, ahhoz képest, OCUM-12 és OCUM-2MD3 sejtek (ábra S3).

a hálózat ábrán bemutatott 1E generálta IPA, és az elemzés függ a korábban jellemzett, és jelenteni fehérje kölcsönhatások. Így RBBP6, amely megfigyelhető volt, hogy több mint-ben kifejezve CSC-szerű SP sejtek, OCUM-12 /SP sejtek és OCUM-2MD3 /SP sejtek, közvetlenül kapcsolódik HSPA4 és Rb, valamint közvetve kapcsolódó Hsp90 és TAGLN2. HSPA4, Hsp90 és TAGLN2 is találták fel szabályozott CSC-szerű SP sejtek. Katalógusa

Hatása siRBBP6 transzfekció a migrációs és invazív képességek gyomorrák sejtek katalógusa

A 2A azt mutatja, hogy SI RBBP6
transzfekció jelentősen csökkent mRNS expressziós szintje mindkét SP sejtvonalak (OCUM-12 /SP-ben 12%, p < 0,01, OCUM-2MD3 /SP 2,5% volt. p < 0,01), a szemben hogy a negatív siRNS transzfekció. RBBP6 katalógusa siRNS kiütése jelentősen csökkent az invázió (2B) és a migráció tevékenység (2C ábra) mindkét SP sejtek. Katalógusa

immunhisztokémiai vizsgálata alá vont fehérjék és társulási klinikopatológiai jellemzők katalógusa

RBBP6, DCTPP1, és HSPA9 figyeltek is elsősorban kifejezve a citoplazmában és a sejtmag a gyomor rákos sejteket. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA, és KRT18 figyeltek is elsősorban kifejezve a citoplazmában (3A ábra). Normális hámsejtek RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 és HSPA9 kifejezés találtak néhány sejt a hámsejtek mirigy. KRT18 fejeztük legtöbb epiteliális sejtekben. HSPA4 és ALDOA kifejezés nem található a normál sejtek. BBP6, DCTPP1, és HSPA9 fejeztük a citoplazmában és a sejtmag normális epiteliális sejtekben. GLG1, VPS13A, HSPA9, és KRT18 figyeltünk meg a citoplazmában hámsejtek (3B ábra).

feltárni közötti összefüggést expressziós szintjének a nyolc jelölt fehérjék és a klinikopatológiai jellemzői. Esetek száma az egyes pontszámot a nyolc célokat táblázatban mutatjuk be S3. Ez a nyolc fehérjék elszánt társítható potenciálisan malignus folyamatok, mint például a távoli áttétek, nyirokcsomó (LN) metasztázis, invázió mélysége, vagy színpadi haladás (3. táblázat). A számított p-értékek a következők voltak: RBBP6 szignifikánsan összefüggött a invázió mélysége (p < 0,001), LN metasztázis (p < 0,001), távoli áttét (p = 0,013), és a klinikai stádium (p < 0,001); GLG1 szignifikáns összefüggést csak távoli áttét (p = 0,045). VPS13A szignifikáns összefüggést invázió mélysége (p = 0,005), LN áttét (p < 0,001), és a színpadon haladás (p = 0,005); DCTPP1 szignifikáns összefüggést invázió mélysége (p < 0,001), LN áttét (p < 0,001), a távoli áttétek (p < 0,001), és a színpadon haladás (p < 0,001); HSPA9 szignifikáns összefüggést invázió mélysége (p < 0,001), LN áttét (p < 0,001), és a színpadon haladás (p < 0,001); HSPA4 szignifikáns összefüggést invázió mélysége (p < 0,001), LN áttét (p < 0,001), a távoli áttétek (p = 0,007), és a színpadon haladás (p < 0,001); ALDOA szignifikáns összefüggést invázió mélysége (p = 0,034), LN áttét (p = 0,004), és a színpadon haladás (p = 0,029); és KRT18 szignifikáns összefüggést invázió mélysége (p = 0,001), LN áttét (p = 0,001), a távoli áttétek (p = 0,034), és a színpadon haladás (p = 0,004). katalógusa

Prognózis katalógusa

a Kaplan-Meier azt javasolta, hogy a nyolc túiexpresszálódó fehérjék RBBP6, DCTPP1, HSPA4 és ALDOA, szignifikáns összefüggést mutattak a szegények túlélési minden betegnél (lásd 4. ábra). A kumulatív ötéves teljes túlélési aránya RBBP6-pozitív esetet (61%) szignifikánsan kisebb volt (p = 0,002), mint a RBBP6-negatív esetekben (78%). Továbbá, a betegek az első lépcsőben a III, a teljes túlélési aránya RBBP6-pozitív esetek szignifikánsan kisebb volt (p = 0,034), mint a RBBP6-negatív esetekben. A prognózis betegek DCTPP1-pozitív daganatok (63%) volt szignifikánsan rosszabb (p = 0,016), mint a DCTPP1-negatív tumorok (75%). Az öt éves teljes túlélési arány HSPA4-pozitív esetet (66%) szignifikánsan kisebb volt (p = 0,047), mint a HSPA4-negatív esetekben (75%). Az öt éves teljes túlélési arány ALDOA-pozitív daganatok mutatnak túlzott kifejeződése (61%) szignifikánsan rosszabb (p = 0,043), mint a ALDOA-negatív tumorok (72%). Ezzel szemben nem szignifikáns összefüggést figyeltek meg más fehérjék és a betegek túlélését. Következő egyváltozós elemzés RBBP6, DCTPP1, HSPA4 és ALDOA expressziós szintek szignifikáns összefüggést mutattak a rossz prognózissal 300 gyomorrákos betegek (4. táblázat). Ezenkívül makroszkopikus típus (4. típus), a szövettani típus (diffúz), T kategória (T2-4), hajó invázió, beszivárgás minta (INF b, c), hashártya áttét, és LN metasztázis elszánt jelentősen társítva rossz prognózissal. A többváltozós analízist a Cox-féle modell az összes szignifikáns változókat az egyváltozós elemzésben. Upon elemzés befejezésekor, RBBP6 expresszió (p = 0,023), Borrmann 4. típusú (p < 0,001), hashártya pozitív (p = 0,001), LN metasztázis (p = 0,003), és a máj metasztázis (p = 0,001) is megerősítették, mint független tényezők korrelált túlélést (3. táblázat). A nyolc fehérjék RBBP6 kifejezés egy független prognosztikai faktora. Katalógusa

Vita katalógusa

A gyomorrák ez nagyon rossz a prognózisa, mert a gyakori áttétes folyamatok, például az LN metasztázis és hashártya áttét [23]. CSC javasoltak már, mint amelyek fontos szerepet a malignus potenciálját a rákos sejtek, beleértve a távoli metasztázis és kemorezisztencia [4]. Azóta felfedezték, hogy SP sejtek nyert gyomorrák alanyok rendelkeznek ilyen CSC tulajdonságokkal [3]. Igazoltuk, hogy az SP felhasznált sejteket ebben a vizsgálatban kifejezett jelölt gyomorrák őssejt markerek, beleértve a CD44 [24], CD133 [25], és Nanog [26] (ábra S2). A szferoid kolónia képződését aktivitását ezek SP sejtek magasabb volt, mint a szülő-sejtek [18]. Továbbá, ezek a CSC-szerű SP sejtek megjelenítéséhez kemorezisztencia a rákellenes gyógyszerek [2]. Ezek az eredmények megerősítették, hogy OCUM-12 /SP sejtek és OCUM-2MD3 /SP sejtek jelentik a rákos őssejt-szerű tulajdonságokkal. Mivel specifikus markerek gyomor CSC nem tettek közzé, mint a még, tisztázzuk az adott jelátviteli utak és mechanizmusa az intézkedések a CSC javíthat a gyomorrák prognózisa. Ebben a vizsgálatban nyolc jelölt CSC markereket azonosítottunk proteomikus technikákat használva LC-MS /MS párosul iTRAQ technológiával. Három fehérjék, RBBP6, GLG1 és VPS13A, kimutatható volt csak SP sejtvonalak, de nem a saját szülő sejtvonalak. Ezen túlmenően, az öt fehérjék, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, HSPA4, és KRT18 voltak túlzott egyaránt kifejezett SP sejtvonalak képest az illető szülő sejtvonalak. RT-PCR elemzés arra is rámutatott, hogy az expressziós szintje RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1 katalógusa, és CK18 katalógusa magas volt OCUM-12 /SP és OCUM- 2MD3 /SP, az a kontrollhoz képest a szülő OCUM-12 és OCUM-2MD3. Ezeket a fehérjéket gyaníthatóan új biomarkerek gyomor CSC. Ezt a hipotézist teszteltük immunhisztokémiai analízissel 300 gyomorrák esetben.

RBBP6 egy nukleáris fehérje, amely egy ismert módon kapcsolódó, és potenciálisan kapcsolatos p53, retinoblasztóma kötő Q fehérje 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 kölcsönhatásba lép a tumorszuppresszor fehérjék p53 és Rb, és szerepet játszik az apoptózis indukcióját, valamint a sejtciklus szabályozásában [28], [29]. RBBP6 kötődik a vad típusú p53-fehérjét, de nem a p53 mutánsok [30]. Azt is kimutatták, hogy elősegíti a kötődését MDM2 [31], egy E3 ubikvitin ligáz, hogy megcélozza a p53 [32], és hogy zavarja, hogy képes transzaktiválni a célgének [33]. Up-szabályozása RBBP6 már erősen korrelál a tumor progressziójának nyelőcsőrák és a méhnyakrák [32]. Ebben a vizsgálatban, RBBP6 expresszióját összefüggésbe hozták a "T" kategória rák tekintetében invázió mélység, távoli áttétek, nyirokcsomó-metasztázis, és a klinikai szakaszban. Sőt, RBBP6 expresszió szignifikáns összefüggést a szegény betegek túlélésének minden szakaszában, különösen a színpadi III, és arra a következtetésre, hogy RBBP6 volt független faktor a túlélésért. Elvégeztük az RBBP6 katalógusa siRNS kiütése RBBP6 katalógusa gént OCUM-12 /SP sejtek és OCUM-2MD3 /SP sejtek ebben a vizsgálatban.

• PLoS One: Photoimmunotherapy gyomorrák peritoneális carcinomatosis egy egérmodellben
• PLOS Genetics: csírasejt-mutáció MAP3K6 társul familiáris gyomorkarcinóma