PLOS ONE: Révéler le mécanisme moléculaire de cancer gastrique Marker Annexin A4 dans la prolifération des cellules du cancer utilisant Exon Arrays

Résumé

Le cancer gastrique est une maladie maligne qui résulte de l'épithélium gastrique. Un biomarqueur potentiel de cancer de l'estomac est la protéine annexine A4 (ANXA4), un Ca intracellulaire ^{2 + capteur. ANXA4 se trouve principalement dans les cellules épithéliales, et est connue pour être impliquée dans divers processus biologiques, y compris l'apoptose, le cycle cellulaire et de l'anticoagulation. En ce qui concerne le cancer, ANXA4 surexpression a été observée dans des cancers d'origines diverses, y compris les tumeurs gastriques associés à
infection par Helicobacter pylori. H. pylori
induit l'expression ANXA4 et intracellulaire [Ca 2 +] _{i élévation, et est un facteur de risque important pour la cancérogenèse qui se traduit par un cancer gastrique. En dépit de cette corrélation, le rôle de ANXA4 dans la progression des tumeurs gastriques reste incertaine. Dans cette étude, nous avons cherché à savoir si ANXA4 peut arbitrer le taux de croissance cellulaire et si les signaux en aval ANXA4 sont impliqués dans la tumorigenèse. Après avoir observé le taux de croissance des cellules en temps réel, nous avons déterminé que ANXA4 favorise la prolifération cellulaire. Le profil de transcription génique des cellules surexprimant ANXA4 a été mesuré et analysé par des réseaux d'exons humains. A partir de ces données de gène de la transcription, on montre que la surexpression de ANXA4 régule les gènes qui sont connus pour être liée à un cancer, par exemple l'activation de l'acide hyaluronique à médiation par le récepteur de mobilité (RHAMM), AKT et kinase cycline-dépendante 1 (CDK1), ainsi que la suppression de p21. La régulation de ces gènes induit la prolifération des cellules cancéreuses. Nous avons aussi trouvé Ca 2+ pourrait réguler la transmission de signaux en aval par ANXA4. Nous suggérons que ANXA4 déclenche une cascade de signalisation conduisant à une prolifération accrue des cellules épithéliales, finalement promouvoir cancérogenèse. Ces résultats pourraient donc fournir un nouvel aperçu pour le traitement du cancer gastrique, notamment par la modification de l'activité ANXA4}}

Citation:. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Révéler le mécanisme moléculaire de cancer gastrique Marker Annexin A4 dans le cancer de prolifération cellulaire utilisant exon Arrays. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10.1371 /journal.pone.0044615

Editeur: Eric Y. Chuang, Université nationale de Taiwan, Taiwan

reçues: 6 Juin 2012; Accepté: 6 Août 2012; Publié 7 Septembre, 2012 |

Droit d'auteur: © Lin et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par le Conseil national des sciences de Taiwan (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), projet de l'Université nationale de Taiwan Cutting-edge directeur de recherche (10R70602C3) et l'Institut national de recherche en santé, Taiwan (NHRIEX100-9819PI). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde entier et montre une forte prévalence dans les populations asiatiques. Bien que l'incidence du cancer gastrique est en baisse, le taux global de survie à 5 ans reste faible [1]. Déterminer les thérapies les plus efficaces de cancer gastrique et le développement à un stade précoce des outils de diagnostic sont des stratégies importantes affectant les résultats cliniques. L'enquête approfondie sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la carcinogenèse gastrique pourrait fournir de l'aide au développement de stratégies thérapeutiques utiles pour cette maladie.

Helicobacter pylori
est un agent pathogène gastrique et est le facteur étiologique prédominant pour la carcinogenèse gastrique . Environ la moitié de la population mondiale est infectée par H. pylori
, et plus de 60% des patients atteints de cancer gastrique ont une histoire de H. pylori de la -positivity [2], [3], [4]. Des études récentes ont montré que H.
pylori peut induire à la fois la prolifération des cellules cancéreuses gastriques et les réactions inflammatoires des muqueuses [5], [6]. Ainsi, afin d'étudier les mécanismes moléculaires carcinogenèse gastrique sous-jacent, il est nécessaire d'étudier le rôle et les mécanismes de H. pylori
dans la carcinogenèse gastrique.

annexines sont exprimés de manière ubiquitaire dans la plupart des organismes, y compris les animaux, les plantes, les champignons et les protistes. Elle est associée à une variété de fonctions physiologiques [7]. Sur la base de la structure de leur domaine central conservé, annexines sont considérés comme intracellulaire de Ca ^{2+ capteurs et des protéines de liaison de phospholipide. Ils ont été observés pour stimuler le trafic membranaire et de l'agrégation des vésicules en réponse à une augmentation intracellulaire [Ca 2 +] _{i [8], [9]. Chez les humains, les annexines ont été observés pour avoir une gamme de fonctions cellulaires qui ont été impliqués dans l'organisation du cytosquelette, exocytose, endocytose, la régulation du canal ionique, l'inflammation, l'apoptose, la fibrinolyse et la coagulation [8]. Annexines sont également considérés comme étant impliqués dans le cancer, le diabète et l'inflammation [10]. Récemment, de plus en plus d'études ont émergé qui impliquent la participation des annexines dans la cancérogenèse, ainsi que la promotion de la prolifération [11], [12], l'invasion [13] et les métastases [14], [15]. Cependant, la relation entre tous les membres de la famille des annexines avec le cancer n'a pas été caractérisé.}}

Annexin A4 (ANXA4) est un membre de la famille des annexines associée au système digestif. Elle est exprimée en évidence dans les cellules épithéliales [16]. Des études récentes ont montré que ANXA4 est considéré comme un biomarqueur potentiel gastrique sur la base de son identification dans les tissus des patients atteints d'un cancer de l'estomac dans les études protéomiques. Up-régulation de ANXA4 est spécifiquement trouvé dans H. les tissus tumoraux infectés par le pylori de [17], [18]. En outre, de nombreuses études ont rapporté une relation entre l'expression de ANXA4 et le cancer. Cette relation a été rapportée dans adénocarcinome pancréatique [19], le carcinome à cellules claires de l'ovaire [20], [21], carcinome rénal [22], le carcinome colorectal [23] et le cancer de la prostate [24]. Dans le carcinome des cellules rénales, la régulation de ANXA4 est impliquée dans la dissémination des cellules tumorales, la promotion de la migration cellulaire [22]. Chez les patients atteints d'un cancer colorectal, une expression élevée de ANXA4 était associée à un faible taux de survie et a été rapportée en tant que biomarqueur potentiel pour le diagnostic des tumeurs [23]. Dans la mesure où fonction cellulaire, ANXA4 pourrait induire la signalisation du calcium, l'anticoagulation et de la résistance à l'apoptose [25], [26]. Ces événements indiquent que ANXA4 a une fonction tumorigène en régulant le taux de croissance cellulaire.

Dans cette étude, nous avions l'intention d'élucider le mécanisme moléculaire par lequel ANXA4 induit cancérogenèse. Pour ce faire, nous avons suivi le taux de croissance des cellules du cancer de l'estomac avec différents niveaux de ANXA4 d'expression. Nous avons également évalué le profil d'expression de transcription des cellules surexprimant ANXA4 et utilisé des réseaux d'exons pour analyser la signalisation en aval de ANXA4. De ces études, nous avons identifié 9 gènes liés au cancer à partir de signaux en aval ANXA4 en utilisant la base de données Ingenuity Pathway Analysis (IPA). De plus, nous avons démontré que ANXA4 régule l'activation de RHAMM, AKT, CDK1 et la suppression de p21, et donc proposé une voie de prolifération cellulaire ANXA4 réglementés.

Résultats

L'activation de ANXA4 Favorise prolifération cellulaire

Nous avons précédemment rapporté que ANXA4 est surexprimée dans H. infecté gastrique tissu tumoral de pylori [17]. Pour approfondir la relation entre ANXA4 et la carcinogenèse, nous avons cherché à déterminer si ANXA4 favorise la prolifération cellulaire. Les cellules ont été transfectées avec pleine longueur ANXA4 d'ADNc pour augmenter l'expression de ANXA4 ou siRNA spécifique destiné à faire taire l'expression ANXA4. Après transfection, nous avons suivi le taux d'AGS cellules cancéreuses gastriques en utilisant un système d'analyse de cellules en temps réel (RTCA) croissance. Les nombres de cellules ont été enregistrées en tant que valeur indice de cellule (CI). Les courbes des cellules AGS de croissance ont été modifiés après la transfection. La surexpression de ANXA4 a augmenté de manière significative le taux dans les cellules AGS de la croissance des cellules par rapport aux cellules de contrôle ( P
< 0,001; Figure 1A), alors que ANXA4 knockdown a diminué de manière significative le taux de croissance ( P
<0,001; figure 1B). Ces résultats suggèrent que ANXA4 a le potentiel de promouvoir la prolifération cellulaire.

ANXA4 augmente l'expression des protéines membranaires, RHAMM et LAMP2

Nous avons également examiné la différence dans l'expression des gènes entre les cellules surexprimant ANXA4 et cellules témoins exprimant un vecteur vide. Nous avons examiné cela en utilisant l'analyse de réseau exon, qui offre une vue plus précise de l'expression au niveau des gènes en utilisant quatre sondes par exon, par rapport aux 3 'des réseaux classiques [27]. Dans la figure S1, le X
-axis du nuage de points affiche les intensités d'expression de sonde mesurées dans une expérience et Y-
axe affiche les intensités d'expression de la sonde de mesure dans l'autre expérience . Ces résultats indiquent une corrélation entre les résultats des deux expériences indiquent donc une cohérence entre les puces à ADN en double. Les niveaux d'expression des gènes ont été calculés à partir des intensités mesurées par l'intermédiaire d'ensembles de sondes. Dans l'ensemble, l'expression de 1052 gènes se sont révélés être significativement différentes ( P
< 0,05). Entre les cellules ANXA4 surexprimant et des cellules de contrôle

ANXA4 est une membrane de protéine plasmatique de liaison, de sorte que nous proposent que d'autres protéines de la membrane plasmique peuvent être réglées par ANXA4 et travaillent ensemble pour la transduction de sa signalisation en aval. Pour explorer la transduction de signalisation régulée par ANXA4, nous avons étudié les protéines de la membrane plasmique de l'analyse de réseau exon. Quarante-sept protéines de membrane plasmique a été observé un changement ≥1.5 fois dans les cellules surexprimant ANXA4 (tableau S1). Parmi ceux-ci, le récepteur de la motilité hyaluronane-médiée ( HMMR
) ont montré la plus grande augmentation de l'expression (2,4 fois, le tableau S1). De plus, notre étude précédente a montré que l'expression de surface cellulaire de lysosomale-associated membrane protein 2 ( LAMP2
), un marqueur lysosomale, est régulée à la hausse par ANXA4 et est impliqué dans l'exocytose (Figure S2 et File S1) . Ici, l'expression transcriptionnelle du LAMP2
a également montré une augmentation de l'expression (1,8 fois; Tableau S1) lorsqu'elle est mesurée par analyse de la matrice de exon. Dans cette étude, ANXA4 a été surexprimé ou réduit au silence (figure 2A), puis analysé par immunoblot pour vérifier l'expression de la protéine de RHAMM et LAMP2. ANXA4 surexpression augmente l'expression de RHAMM (figure 2B) et LAMP2 (figure 2C) et, conformément à cela, le knockdown de l'expression ANXA4 diminué leurs niveaux d'expression (figure 2B et 2C).

Cancer ANXA4 surexpression Régule la PI expression génique

Nous avons utilisé la base de données Ingenuity Pathway Analysis (IPA) pour effectuer une analyse de la fonction des gènes des données du tableau de exon et a constaté que 25 des 42 gènes étaient admissibles à l'analyse de la fonction de réseau (≥2 fois expression différentielle, t
test, P
< 0,05) (tableau 1). Trois réseaux fonctionnels étaient significativement associés à des gènes ANXA4 réglementés. Le réseau le plus fortement associé était cancer, cycle cellulaire, et le système reproducteur maladie
( P
< 0,05; Figure 3A), et le premier rang des maladies ou des troubles a été cancer
( P
< 0,05; Figure 3B). Il y avait des 9 gènes classés comme des gènes liés au cancer dans les cellules surexprimant ANXA4 dont 7 gènes qui étaient régulés à la hausse dans nos expériences. Ces gènes sont traduction facteur d'initiation eucaryote 4E ( EIF4E
), complexe succinate déshydrogénase, la sous-unité C, la protéine membranaire intégrale de 15 kDa ( SDHC
), la kinase cycline-dépendante 1 ( CDK1
), supprimé dans la leucémie lymphocytaire 2 ( dLEU2
), la chromatine modifier la protéine 5 ( CHMP5
), TIMELESS interacting protein ( TIPIN
), PDZ kinase de liaison ( PBK
). Chorionique somatomammotropine hormone 1 (placentaire lactogène) ( CSH1
) et l'interféron alpha 2 ( IFNA2
) ont été régulés à la baisse par ANXA4. Sur la base de nos résultats, nous proposons que ANXA4 a une fonction dans l'induction de la prolifération cellulaire. En outre, CDK1
et PBK
(figure 3B et le tableau 1) ont été considérés comme impliqués dans le modèle de prolifération induisant ANXA4. Etant donné que l'activation de la CDK1 est associée à la prolifération des cellules dans le développement du lymphome gastrique du MALT [28]. L'activation mutuelle des CDK1 et PBK a été rapporté précédemment [29]. Dans cette étude, la régulation positive de CDK1
et PBK
observée dans les cellules surexprimant ANXA4 a été validé par temps réel réaction quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) (Figure S3) .

ANXA4 Régule l'activation de l'AKT, CDK1 et la répression du p21

d'activation de CDK1, qui est régulée par p21, inhibe phase G2 /M arrestation, favorisant ainsi la mitose et la prolifération cellulaire [30 ]. Il a également été rapporté que les blocs de AKT l'activation de p21, ce qui provoque son accumulation dans le cytoplasme et par conséquent favorisant la prolifération cellulaire [31]. En utilisant l'analyse par immunotransfert, on a observé que la surexpression de ANXA4 augmente la phosphorylation de la serine 473 dans Akt et la thréonine 161 sur CDK1 et une diminution de l'expression de p21 (figure 4A). En plus de cela, le knock-down de l'expression ANXA4 diminué phospho-AKT phospho-et CDK1 et a augmenté l'expression de p21 (figure 4B). Ces données suggèrent que phospho-AKT, phospho-CDK1 et p21 sont régulés par ANXA4 et sont des signaux en aval de ANXA4.

Ca 2+ ANXA4 Downstream Signaling Faire la médiation transduction

Dans la cancérogenèse, Ca ^{2+ est impliquée dans l'apparition de la transduction du signal à médiation d'une grande variété de processus biologiques, y compris l'invasion, la prolifération, l'angiogenèse et les métastases [32]. Il a été rapporté que les annexines peuvent médier certains mécanismes physiologiques dans un rapport Ca 2 + manière dépendante [9]. Dans des études précédentes, intracellulaire [Ca 2 +] _{i élévation a été induite par H. pylori de l'infection, ce qui, à son tour, régule à la hausse l'expression de ANXA4 [17], [33]. Pour déterminer si une augmentation intracellulaire [Ca 2 +] i médie la transmission de signaux en aval à partir ANXA4, les cellules ont été traitées avec AGS ionomycine. Ionomycine est un Ca 2+ ionophore et a été ajouté au milieu de culture dans notre modèle de cellules AGS pour induire une élévation soutenue de intracellulaire [Ca 2 +] i [34]. Les expressions de protéines de ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, phospho-AKT et phospho-CDK1 ont été mesurés par analyse immunoblot (figure 5A). Semblable à nos observations avec ANXA4 surexpression, l'augmentation de [Ca 2 +] i des niveaux significativement régulés à la hausse l'expression de RHAMM ( P
< 0,01) et phospho-AKT (Ser 473) ( P
< 0,05) significativement régulée à la baisse l'expression de p21 et ( P
< 0,01) (figure 5B). activation de CDK1 a été légèrement augmentée par [Ca 2 +] i élévation. Cependant, élevée [Ca 2 +] i niveaux n'a eu aucun effet sur l'expression de ANXA4 et LAMP2. Dans notre étude précédente, ANXA4 et LAMP2 peuvent localiser à la membrane plasmatique après H. pylori de l'infection par intracellulaire [Ca 2 +] i élévation (Figure S4 et le fichier S1). Ces résultats suggèrent que Ca 2+ change juste localisation intracellulaire de ANXA4 et LAMP2, mais pas régule leur expression.}}

Discussion

Dans la recherche sur le cancer, l'identification de biomarqueurs et la clarification ultérieure de leurs relations mécanistiques avec la tumorigenèse peut contribuer au développement d'outils de diagnostic utiles et aboutir à des stratégies thérapeutiques optimales. Récemment, de plus en plus d'études ont montré que les protéines biomarqueurs candidats dans la famille des annexines sont potentiellement contribué à la progression de divers cancers; par exemple, ANXA1 pour le cancer rénal à cellules claires, ANXA2 pour le cancer gastrique et le cancer colorectal, ANXA4 pour le cancer colorectal, ANXA8 pour le cancer du sein, ANXA10 pour le cancer hépatocellulaire, ANXA11 pour le cancer de l'ovaire et le cancer colorectal [35]. ANXA4, un membre de la famille des annexines, a été observée pour être surexprimé dans les tissus tumoraux gastriques et est également associée au cancer liés à l'estomac H. pylori de l'infection [17]. En outre, un autre membre de la famille des annexines, ANXA2, a également été observée pour être surexprimé dans le cancer gastrique et est liée aux résultats cliniques pauvres, ce qui en fait un facteur pronostique potentiel [36]. Pris ensemble, ces résultats suggèrent l'implication de ANXA4 dans la tumorigenèse; Cependant, le mécanisme exact dans le processus reste incertain. Afin d'évaluer davantage la fonction cellulaire de ANXA4 dans la progression du cancer de l'estomac, nous avons exploré le lien entre les deux et ensuite démontré que ANXA4 peut réguler les gènes liés au cancer et à propager la voie à la prolifération cellulaire.

la présente étude, nous avons constaté que les protéines de cancérogenèse associées telles que RHAMM, AKT, p21, PBK et CDK1 sont réglementés par la surexpression de ANXA4. Une représentation schématique des signaux en aval ANXA4 induits liés à la prolifération des cellules est montrée sur la figure 6. HMMR
(RHAMM) est un oncogène qui est surexprimée dans plusieurs types de cancers, notamment le cancer gastrique, et a été impliquée dans de nombreux cellulaire processus, tels que la signalisation cellulaire, la prolifération cellulaire et la tumorigenèse [37], [38].

Il a été rapporté que RHAMM induit la cascade de signalisation RAS et active AKT [39]. La cascade de signalisation RAS transduction des signaux en aval en activant phospho-AKT par phosphoinositide 3-kinases. Cette activation de l'AKT a été rapportée en tant que marqueur pour la progression du cancer gastrique [40]. Nous avons précédemment rapporté que H. pylori de l'infection est associée à ANXA4 surexpression [17]. H. pylori
peut délivrer le gène associé cytotoxine A (CagA) dans des cellules hôtes, ce qui entraîne l'activation de l'AKT, et favorisant ainsi la prolifération cellulaire [41]. En termes de survie des cellules, AKT supprime l'apoptose en stimulant NF-kB [42]. Des études récentes ont également montré que ANXA4 interagit avec p105 (le précurseur de la protéine NF-kB p50) et inhibe l'activité transcriptionnelle de NF-kB pour induire un effet anti-apoptotique [25]. Pris ensemble, ces observations indiquent que ANXA4 joue un rôle important dans la survie cellulaire et la croissance cellulaire.

complexes B1 CDK1 cycline régulent le G2 du cycle cellulaire phase /M et ont également été impliqués dans la promotion de la tumorigenèse [43]. Une étude récente a montré que l'expression accrue de CDK1 est associée à la progression de H. pylori
gastrite -Associated lymphome du tissu lymphoïde associé aux muqueuses [28]. Dans cette étude, l'activation CDK1 était régulée à la hausse par ANXA4. Ces événements suggèrent que ANXA4 pourrait arbitrer la voie de signalisation en aval, conduisant à la tumorigenèse chez les patients atteints de cancer gastrique avec un H. pylori de l'infection.

En plus de son implication dans la progression du cancer, ANXA4 a également été liée à la chimiorésistance acquise aux médicaments anticancéreux [44], [45], [46]. Dans une lignée cellulaire résistante paclitaxel (H460 /T800), l'expression est augmentée et ANXA4 localisée dans le noyau [44]. Dans le carcinome à cellules claires des cellules de l'ovaire et du mésothéliome, l'expression de ANXA4 est élevé et associé à une résistance au traitement avec le carboplatine et est considéré comme un biomarqueur pour la susceptibilité à la cisplatine [45], [46]. En outre, ANXA4 est un intracellulaire de Ca ^{2 + capteur, et Ca 2 + joue un rôle important dans la neurotoxicité et l'insuffisance cardiaque [47], [48]. Des études récentes ont montré que la quantité accrue de ANXA4 est non seulement associé au cancer, mais aussi de la maladie d'Alzheimer, l'insuffisance cardiaque et une lésion cellulaire provoquée par l'éthanol [49], [50], [51].}

Ca ^{2+ système de messagerie est également nécessaire pour le processus de prolifération cellulaire et peut réguler le cycle cellulaire [52], [53]. Il a été rapporté que le Ca 2+ peut activer AKT pour favoriser la survie cellulaire [54]. Dans cette étude, nous avons constaté que l'expression de RHAMM, phospho-AKT et la suppression de p21 ont été significativement augmentée par [Ca 2 +] _{i élévation (Figure 5). H. pylori de l'infection est associée à ANXA4 surexpression et intracellulaire [Ca 2 +] i élévation (Figure S4 et File S1) [17], [33]. Ces résultats indiquent que H. pylori de l'infection pourrait induire une certaine signalisation en aval de ANXA4 en stimulant intracellulaire [Ca 2 +] i élévation. Néanmoins, le mécanisme de détail dans le processus pourrait être complexe et reste incertain. Celles-ci pourraient fournir élucidation des processus de tumorigenèse gastrique sous-jacente H. pylori
stimulation. Pris ensemble, ces éléments de preuve suggère que Ca 2+ pourrait aider ANXA4 pour la transduction de signalisation et de promouvoir la tumorigenèse chez les patients gastriques avec H. pylori de l'infection.}}

En conclusion, nos résultats montrent que la réduction au silence de ANXA4 diminue la prolifération des cellules epitheliales, tandis que sa surexpression augmente la prolifération. En outre, ANXA4 induit des signaux en aval qui favorisent la croissance des cellules. Nous supposons que ces signaux en aval et l'activation de la division de la cellule hôte peuvent être des événements pathogènes dans H. pylori
carcinogenèse induite. Dans la thérapie clinique actuelle, AKT p21 et CDK1 ont été utilisés comme cible de médicaments anticancéreux. un inhibiteur de l'AKT, perifosine, un agent anti-cancer de la bouche et a une activité anti-prolifération dans plusieurs modèles de tumeur [55], [56], [57]. Paclitaxel (Taxol) et la vincristine peut induire et augmenter l'expression de p21 pour diminuer G2 /M arrestation et cellule de bloc prolifération [58], [59], [60], [61]. Flavopiridol est un inhibiteur de CDK, dont plusieurs CDK1 pour induire l'apoptose et antiangiogénique [62]. Ces études indiquent que l'élévation de ANXA4 chez les patients pouvait être considéré comme une cible médicamenteuse pour la thérapie du cancer gastrique. L'utilisation de plusieurs médicaments en combinaison peut assurer un traitement plus efficace pour bloquer les signaux de la voie. Pris ensemble, cette étude pourrait fournir de nouvelles perspectives dans le développement de stratégies thérapeutiques pour le cancer de l'estomac.

adénocarcinome de l'estomac humain cellules AGS Matériels et méthodes

lignées cellulaires et conditions
Culture (CRL-1739, ATCC) ont été cultivées dans 90% du milieu RPMI 1640 (Biological Industries, Beth-Haemek, Israël) qui a été complété avec 1% de pénicilline /streptomycine et 10% de sérum de veau fœtal (Biological Industries, Beth-Haemek, Israël) . Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contrôlée dans un incubateur contenant 5% de CO _2.

Plasmides et transfections

pleine longueur ANXA4
Was amplifié par PCR en utilisant la paire d'amorces ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') et ANXA4
R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3') produit, et l'amplification a été inséré dans le HindlII /sites EcoRI de pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
siRNA spécifique de contrôle négatif et Furtif siRNA (Furtif ARNi ™) ont été achetés chez Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Les cellules ont été cultivées dans des plaques à six puits ou sur des lamelles revêtues pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été transitoirement transfectées avec pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 pg pour une plaque à six puits; 0,4 pg /mL pour une E-plaque de 96 puits) ou ANXA4
ARNsi (100 pmol pour une plaque à six puits, 10 pmol de 96 puits E-plaque) en utilisant la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. L'efficacité du vecteur d'expression et transfection de siRNA a été analysée par immunotransfert. Après transfection pendant 48 h, l'expression différentielle des protéines et des gènes a été détectée

Anticorps

Les anticorps monoclonaux de souris utilisées dans cette étude sont les suivants:. CDK1 p34 (sc-51578) de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); LAMP2 (ab25631) et RHAMM (ab67003) de Abcam (Cambridge, Royaume-Uni); et α-tubuline (T5168) auprès de Sigma (Dorset, RU). Le lapin anticorps polyclonaux sont les suivants: ANXA4 (sc-28827), p21 (sc-397), et pCDK1 p34 (Thr 161; sc-101654) de Santa Cruz Biotechnology; et AKT (9272) et pAKT (Ser473; 9271S). de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA):

immunotransfert

lysats cellulaires ont été préparés à partir de cellules AGS qui ont été transfectées transitoirement avec le des vecteurs d'expression pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 pg) ou ANXA4
siRNA (100 pmol). Pour déterminer les différences dans l'expression des protéines dans des conditions de haute intracellulaire [Ca ^{2 +] _{i, ionomycine (5 uM) a été ajouté aux cellules pendant 1 h. Pour étudier les effets de l'inhibition de la phosphorylation de Akt, les cellules ont été privées de nourriture pendant 1,5 h après une transfection de 48 heures et ont été traitées avec 5 uM de l'inhibiteur de l'AKT VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) pendant 1 h. Les échantillons ont été séparés par 10% SDS-PAGE, puis transférés sur polyfluorure de vinylidène (PVDF) membranes (Millipore, Billerica, MA, USA). anti-ANXA4 (: Après le blocage de 5% de lait et de nonfat solution saline (TBS) contenant 0,1% de Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) pendant 1 h à température ambiante avec doux balancement, les anticorps primaires suivants ont été appliqués tris-tamponnée 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-pAKT (Ser473; 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500) et un anticorps anti-RHAMM (1:400). Les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué IgG (Sigma) ou de chèvre anti-lapin conjugué IgG (Rockland, Gilbertsville, PA), respectivement. a-tubuline anticorps (1:4000) a été utilisé comme témoin interne. Immunotransferts ont été développés en utilisant chimiluminescence amplifiée (ECL) kit de détection (Millipore) et visualisés sur les films X-ray. L'intensité des bandes observées a été normalisées par rapport à l'intensité de la bande α-tubuline. L'analyse densitométrique a été réalisée en utilisant Kodak 1-D version du logiciel d'analyse d'images 3.6 (Eastman Kodak, Londres, Royaume-Uni).}}

Exon tableau Hybridation et analyse

Pour étudier les gènes en aval de ANXA4, nous avons comparé les profils d'expression génique entre les cellules transfectées avec pcDNA3.1 (+) / ANXA4
et des cellules de contrôle transfectées avec un vecteur vide en utilisant un réseau de exon. L'ARN cellulaire total a été extrait en utilisant TRIzol® Réactif (Invitrogen), et la pureté de l'ARN a été confirmée par spectrophotométrie (rapport A260 /A280), ainsi que par électrophorèse capillaire (Agilent Bioanalyseur 2100, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). traitement de l'ARN et l'hybridation ont été effectuées en utilisant les Affymetrix Exon Human 1.0 matrices ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) selon le protocole du fabricant. Chaque tableau a 28.869 gènes bien annotés avec 764,885 sondes différentes. Le tableau contient environ 26 sondes pour chaque gène. sonde Affymetrix définit les informations sont affichées sur NetAffx site Web (http://www.affymetrix.com) [63]. l'analyse des microréseaux (n = 2 par groupe) a été réalisée en utilisant la version Partek Genomics Suite 6.5 (Partek Inc., St Louis, MO, USA). Les données brutes (fichiers CEL) ont été normalisées en utilisant l'algorithme robuste multichip moyenne (RMA) et analysées en utilisant t
tests. Analyse de la fonction et le mécanisme biologique des gènes exprimés de manière différentielle a été réalisée en utilisant la version du Pathway Analysis Ingenuity (IPA) du logiciel 7.5; un score de 3 ou au-dessus a été considérée comme statistiquement significative ( P
< 0,01) pour annoter les informations. Nous avons soumis les données de tableau à la base de données GEO, et le numéro d'enregistrement de la série est GSE33620.

Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR)

Les données du tableau de exon obtenus en utilisant le logiciel Partek et la base de données IPA a été confirmée par qRT-PCR. L'ARN a été isolé à partir de cellules AGS en utilisant le réactif TRIzol® (Invitrogen) et le kit RNeasy® Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fabricant. L'ADNc du premier brin a été synthétisé à partir d'ARNm totaux en utilisant un kit de transcription inverse (Invitrogen, Carlsbad, CA). Amorces (tableau S2) ont été conçus en utilisant le logiciel DNAStar (DNAStar, Inc., Madison, WI, USA) et PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). L'expression des gènes a été mesurée en utilisant un système en temps réel de détection PCR Bio-Rad iQ5 avec un SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), et a été normalisée à l'expression de GAPDH.

Cell Proliferation Assay

cellules AGS ont été chargés dans chaque puits d'un 16 puits de microtitrage E-plaque. Chaque réseaux de capteurs microélectroniques bien contenues à la base pour détecter l'indice cellulaire (CI). Pour les expériences de transfection, après incubation pendant 24 h, les cellules AGS ont été transfectées avec des vecteurs d'expression ou ARNsi pendant 6 heures et surveillé pendant un total de 84 heures. Le E-plaque a été placée dans le système analyseur en temps réel cellulaire (RTCA) et incubé dans un incubateur contenant 5% de CO _{2 à 37 ° C. Le niveau de la prolifération cellulaire a été représentée comme CI, qui était basée sur l'impédance électrique mesurée à l'aide du système xCELLigence (Roche, Mannheim, Allemagne).}

Analyse statistique

Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (SD). Différence entre les groupes indépendants a été analysé à l'aide t
un test de Student bilatéral. Les données obtenues par l'analyse de prolifération cellulaire ont été analysées à l'aide des deux échantillons test de Kolmogorov-Smirnov. A P
valeur inférieure à 0,05 indique la signification statistique.

Informations complémentaires
Figure S1.
nuage de points des intensités de sonde dans les expériences de réseau de exon répétées. Les intensités de sonde de deux expériences répétées ont été présentées séparément sur une X
-axis et Y
-axis. Chaque sonde a été représentée par un seul point dans le diagramme de dispersion. Ces résultats ont montré la cohérence dans nos expériences de réseau de exon double
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s001
(TIF)
Figure S2.
ANXA4 participe à plasma réparation de la membrane en recrutant membrane exocytose. cytométrie de flux représentant analyses ont démontré la présence de LAMP2 dans H. pylori
cellules infectées par. (A) cellules ANXA4 surexprimant ont été comparés à (B) cellules ANXA4
-silenced. Les résultats indiquent que ANXA4 favorise l'expression de LAMP2 sur la surface de H. pylori
cellules infectées par. ANXA4 surexpression, Over-ANXA4; Contrôle siRNA, siControl; . ANXA4
siRNA, si ANXA4
doi: 10.1371 /journal.pone.0044615.s002
(TIF)
Figure S3.
ANXA4 induit en aval de transduction du signal. Un essai qRT-PCR de ANXA4 surexprimant cellules AGS (boîtes noires) a été effectuée pour confirmer les données obtenues à partir des tableaux d'exons (boîtes grises). Les niveaux de CDK1
et PBK
ont été mesurées et normalisées à Les taux d'ARNm de GAPDH
doi ARNm relative:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF)
Figure S4.
intracellulaires Ca 2 + élévation, ANXA4 et LAMP2 localisation sur H. pylori
infection. (A) H. les cellules AGS infectées par pylori de ont été chargées avec Fluo-3 /AM pour surveiller intracellulaires Ca niveaux 2+ par cytométrie en flux. (B) de localisation dynamique ANXA4 dans la cellule vivante. images de fluorescence en temps réel montrant la localisation de EGFP-ANXA4 dans H. pylori
AGS et des cellules infectées par le SC-M1 (flèche jaune) colorées avec Hoechst 33258. (C) LAMP2 fluorescence sur la surface de H.

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