PLoS ONE: Het openbaren van het moleculaire mechanisme van maagkanker Marker annexine A4 in Cancer Cell Proliferation behulp Exon Arrays

Abstract

Maagkanker is een kwaadaardige ziekte die voortvloeit uit de maag epitheel. Een potentiële biomarker voor maagkanker is het eiwit annexine A4 (ANXA4), een intracellulaire Ca ^{2 + sensor. ANXA4 wordt voornamelijk gevonden in epitheelcellen en is bekend betrokken te zijn bij verschillende biologische processen, waaronder apoptose, celdeling en anticoagulantia. Met betrekking tot kanker is ANXA4-overexpressie waargenomen bij kanker van verschillende herkomst, waaronder maagtumoren geassocieerd met Helicobacter pylori infectie
. H. pylori
ANXA4 induceert expressie en intracellulaire [Ca 2 +] _{i elevatie, en is een belangrijke risicofactor voor kanker die leidt tot maagkanker. Desondanks correlatie, de rol van ANXA4 in de progressie van maag tumoren blijft onduidelijk. In deze studie hebben we onderzocht of ANXA4 de snelheid van de celgroei kunnen bemiddelen en of ANXA4 downstream signalen die betrokken zijn bij het ontstaan ​​van tumoren. Na het observeren van de snelheid van de celgroei in real-time, hebben we vastgesteld dat ANXA4 bevordert celproliferatie. De transcriptie genprofiel van ANXA4 overexpressie cellen werd gemeten en geanalyseerd door menselijke exon arrays. Uit deze transcriptionele gen gegevens tonen we aan dat overexpressie van ANXA4 reguleert genen die bekend is dat ze verband met kanker, bijvoorbeeld de activatie van hyaluronan motiliteit receptor (RHAMM), AKT en cycline-afhankelijke kinase 1 (CDK1) en de onderdrukking van p21. De regulering van deze genen induceert verdere verspreiding van kankercellen. We vonden ook Ca 2+ kan de overdracht van de downstream-signalen reguleren door ANXA4. Wij stellen voor dat ANXA4 triggers een signaling cascade, wat leidt tot verhoogde proliferatie epitheelcellen, uiteindelijk het bevorderen van carcinogenese. Deze resultaten kunnen daarom voorzien van een nieuw inzicht voor maagkanker therapie, met name door de wijziging van ANXA4 activiteiten}}

Visum:. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Het onthullen van de moleculaire mechanisme van maagkanker Marker annexine A4 in Cancer Cell Proliferation behulp Exon Arrays. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10.1371 /journal.pone.0044615

Uitgever: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Taiwan

Ontvangen: 6 juni 2012; Aanvaard: 6 augustus 2012; Gepubliceerd: 7 september 2012 |

Copyright: © Lin et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Science Raad van Taiwan (NSC 99-2621-B-002-005-my3, NSC 99-2621-B-010-001-my3), de National Taiwan University Cutting Edge-Steering Research Project (10R70602C3) en de National Health Research Institute, Taiwan (NHRIEX100-9819PI). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de tweede belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker wereldwijd en geeft een hoge prevalentie in Aziatische bevolkingsgroepen. Hoewel de incidentie van maagkanker daalt, de totale 5-jaarsoverleving blijft laag [1]. Het bepalen van de meest efficiënte maagkanker therapieën en de ontwikkeling van een vroeg stadium van diagnostische instrumenten zijn belangrijkste strategieën in het beïnvloeden van de klinische uitkomsten. Het uitgebreide onderzoek naar de moleculaire mechanismen die de maag carcinogenese zou kunnen hulp te bieden bij het ontwikkelen van bruikbare therapeutische strategieën voor deze ziekte ten grondslag liggen.

Helicobacter pylori
is een maag-pathogeen en is de belangrijkste etiologische factor voor de maag carcinogenese . Ongeveer de helft van de wereldbevolking is besmet met H. pylori
, en meer dan 60% van maagkanker patiënten hebben een geschiedenis van de H. pylori
-positivity [2], [3], [4]. Recente studies hebben aangetoond dat H. pylori
zowel de proliferatie van maagkanker en mucosale cellen ontstekingsreacties veroorzaken [5], [6]. Aldus teneinde de onderliggende moleculaire mechanismen maagkanker, is het noodzakelijk om de rol en mechanismen van H onderzoeken. pylori
in de maag carcinogenese.

annexinen zijn alomtegenwoordig uitgedrukt in de meeste organismen, met inbegrip van dieren, planten, schimmels en protisten. Het wordt geassocieerd met een verscheidenheid aan fysiologische functies [7]. Op basis van de structuur van hun geconserveerde kerndomein wordt annexinen als intracellulaire Ca zijn ^{2+ sensoren en fosfolipide-bindende eiwitten. Het is waargenomen dat membraantransport en vesicle aggregatie te stimuleren bij toenemende intracellulaire [Ca 2 +] _{i [8], [9]. Bij de mens zijn annexinen waargenomen een reeks cellulaire functies die zijn geïmpliceerd in organisatie van het cytoskelet, exocytose, endocytose, ionkanaal regulering, ontsteking, apoptose, fibrinolyse en stolling hebben [8]. Annexinen worden ook beschouwd te zijn betrokken bij kanker, diabetes en ontsteking [10]. Onlangs zijn er steeds meer studies bleek dat de rol van annexinen bij carcinogenese, en het bevorderen proliferatie [11], impliceren [12], invasie [13] en metastase [14], [15]. Echter, de verhouding tussen alle leden van de familie met annexinen kanker niet gekarakteriseerd.}}

Annexine A4 (ANXA4) is een lid van de familie annexinen geassocieerd met het spijsverteringsstelsel. Het is prominent expressie in epitheelcellen [16]. Recente studies hebben aangetoond dat ANXA4 wordt beschouwd als een potentiële biomarker maag gebaseerd op de identificatie daarvan in weefsels van maagkanker patiënten proteomische studies. Up-regulatie van ANXA4 is specifiek gevonden in H. pylori
geïnfecteerde tumor weefsels [17], [18]. Daarnaast hebben veel studies een relatie tussen ANXA4 expressie en kanker gerapporteerd. Deze relatie is beschreven in pancreas adenocarcinoom [19], clear cell carcinoma ovarium [20], [21], niercarcinoom [22], colorectaal carcinoom [23] en prostaatkanker [24]. In niercelcarcinoom, up-regulatie van ANXA4 is betrokken bij de verspreiding van tumorcellen, het bevorderen van celmigratie [22]. Bij patiënten met colorectaalkanker hoge expressie van ANXA4 was geassocieerd met een lage overleving en werd gerapporteerd als potentiële biomarker voor tumordiagnose [23]. Voor zover cellulaire functie, kan ANXA4 calciumsignalen, antistolling en weerstand tegen apoptose [25], [26] induceren. Deze gebeurtenissen geven aan dat ANXA4 een tumorigene functie door het reguleren van de celgroei tarief.

In deze studie hebben we bedoeld om het moleculaire mechanisme waarmee ANXA4 induceert carcinogenese te helderen. Om dit te bereiken, gevolgd we het groeitempo van maagkanker cellen met verschillende expressie niveaus van ANXA4. We hebben ook onderzocht de transcriptionele expressie profiel van ANXA4-overexpressie cellen en gebruikt exon arrays om de downstream signalering van ANXA4 analyseren. Uit deze studies identificeerden we 9 kankergerelateerde genen van ANXA4 downstream signalen via de Ingenuity Pathway Analysis (IPA) database. Verder hebben we aangetoond dat ANXA4 regelt de activering van RHAMM, AKT, CDK1 en de onderdrukking van p21, en stelde daarom een-ANXA4 gereguleerde cellulaire proliferatie route.

Resultaten

De Activering van ANXA4 Bevordert Cell Proliferation

We hebben eerder gemeld dat ANXA4 is overexpressie in H. pylori
besmette maag tumorweefsel [17]. Om de relatie tussen ANXA4 en carcinogenese verder te onderzoeken, hebben we geprobeerd om te bepalen of ANXA4 bevordert celproliferatie. Cellen werden getransfecteerd met ofwel de volledige lengte ANXA4
cDNA te verhogen ANXA4 expressie of specifieke siRNA ter ANXA4 expressie zwijgen. Na transfectie, gevolgd we het groeitempo van AGS maagkanker cellen met behulp van een real-time cell analyse (RTCA) -systeem. Celaantallen werden geregistreerd als cel index (CI) waarde. De groeicurves van AGS cellen werden gewijzigd na transfectie. De overexpressie van ANXA4 aanzienlijk toegenomen de celgroei tarief in AGS-cellen, vergeleken met controle cellen ( P Restaurant < 0,001; figuur 1A), terwijl ANXA4 knock-down aanzienlijk gedaald de groei ( P
<0,001 Figuur 1B). Deze resultaten suggereren dat ANXA4 heeft het potentieel om celproliferatie te bevorderen.

ANXA4 verhoogt expressie van membraaneiwitten, RHAMM en LAMP2

We onderzochten ook het verschil in genexpressie tussen ANXA4-overexpressie cellen en controle cellen die een lege vector. We onderzochten deze via exon array analyse, die een nauwkeuriger beeld van gen-expressieniveau heeft met vier probes per exon, vergeleken met de conventionele 3'-arrays [27]. In figuur S1, de X
-as van de scatter plot toont de intensiteit van de sonde expressie gemeten in één experiment en de Y-
as geeft de intensiteit van de sonde expressie gemeten in het andere experiment . Deze resultaten wijzen op een correlatie tussen de resultaten van beide experimenten en dus aan coherentie tussen onze dubbele microarrays. Het gen expressieniveaus werden berekend uit de gemeten intensiteiten via probesets. Kortom, de expressie van 1052 genen bleken significant verschillend ( P
<0,05) te zijn. Tussen-ANXA4 overexpressie cellen en controlecellen

ANXA4 een plasmamembraan bindingseiwit, dus voorstellen andere plasmamembraan eiwitten kunnen worden gereguleerd door ANXA4 en werken samen om de downstream signalering transduceren. Om de signalering transductie gereguleerd door ANXA4 verkennen, onderzochten we plasmamembraan eiwitten uit exon array analyse. Zevenenveertig plasmamembraaneiwitten werden behandeld, een ≥1.5-voudige verandering in ANXA4 overexpressie cellen (Tabel S1) hebben. Onder deze, hyaluronzuur-gemedieerde motiliteit receptor ( HMMR
) liet de grootste stijging in uitdrukking (2.4-voudig; Tabel S1). Bovendien onze eerdere studie toonde aan dat de celoppervlak-expressie van lysosomale membraaneiwit geassocieerde 2 ( LAMP2
), een lysosomale marker, up-gereguleerd door ANXA4 en is betrokken bij exocytose (figuur S2 en S1 File) . Hier, transcriptionele expressie van de LAMP2
toonde ook een toename in expressie (1,8-voudig; Tabel S1) gemeten volgens exon array analyse. In deze studie werd ANXA4 overexpressie of zwijgen (figuur 2A) en vervolgens geanalyseerd door immunoblotting met de eiwitexpressie van RHAMM en LAMP2 controleren. ANXA4 overexpressie de uitdrukking van RHAMM (Figuur 2B) en LAMP2 (figuur 2C) en, in overeenstemming met dit gestegen, maar de knock-down van ANXA4 meningsuiting verminderde hun niveaus van expressie (figuur 2B en 2C).

ANXA4 overexpressie Reguleert Cancer -gerelateerde Gene Expression

We gebruikten de Ingenuity Pathway Analysis (IPA) database naar een gen functie analyse van de exon-array data uit te voeren en vond dat 25 van de 42 genen in aanmerking kwamen voor het netwerk functie analyse (≥2-voudig differentiële expressie, t
test, P Restaurant < 0,05) (tabel 1). Drie functionele netwerken waren significant geassocieerd met ANXA4 gereguleerde genen. De meest sterk geassocieerd netwerk was kanker, celcyclus en voortplantingssysteem ziekte
( P Restaurant < 0,05; figuur 3A) en de top-ranked van ziekten of aandoeningen werd kanker
( P Restaurant < 0.05; Figuur 3B). Er waren 9 genen ingedeeld als kanker-gerelateerde genen in ANXA4 overexpressie cellen inclusief 7 genen werden opwaarts gereguleerd in onze experimenten. Deze genen zijn eukaryotische translatie-initiatie factor 4E ( eIF4E
), succinaat dehydrogenase complex, subunit C, integraal membraaneiwit, 15 kDa ( SDHC
), cycline-afhankelijke kinase 1 ( CDK1
), verwijderd in lymfatische leukemie 2 ( DLEU2
), chromatine modificeren eiwit 5 ( CHMP5
), tIJDLOOS interactie eiwit ( TIPIN
), PDZ- bindend kinase ( PBK
). Chorion somatomammotropin hormoon 1 (placenta lactogen) ( CSH1
) en interferon alfa 2 ( IFNA2
) werden down-gereguleerd door ANXA4. Op basis van onze resultaten stellen wij ANXA4 heeft een functie bij het induceren van celproliferatie. Bovendien, CDK1- Kopen en PBK
(Figuur 3B en Tabel 1) werden beschouwd betrokken te zijn bij de ANXA4-proliferatie inducerende model. Aangezien CDK1 activering geassocieerd met celproliferatie in ontwikkelingslanden gastrisch MALT lymfoom [28]. De onderlinge activering van CDK1 en PBK werd eerder gerapporteerd [29]. In deze studie, de up-regulatie van CDK1- Kopen en PBK
waargenomen in-ANXA4 overexpressie cellen werd gevalideerd door kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyse (figuur S3) .

ANXA4 regelt de activering van AKT, CDK1 en de onderdrukking van p21

CDK1 activering, die wordt gereguleerd door p21, remt de G2 /M-fase-arrest, aldus mitose en celproliferatie [30 bevorderen ]. Ook is gemeld dat AKT blokkeert de activering van p21, waardoor de accumulatie in het cytoplasma en derhalve bevorderen celproliferatie [31]. Gebruik immunoblot analyse hebben we vastgesteld dat overexpressie van ANXA4 verhoogde de fosforylering van serine 473 en threonine op AKT 161 op CDK1 en verminderde de expressie van p21 (figuur 4A). Daarnaast wordt de knockdown van ANXA4 expressie verminderd fosfo-AKT en fosfo-CDK1 en de verhoogde expressie van p21 (figuur 4B). Deze gegevens suggereren dat fosfo-AKT, fosfo-CDK1 en p21 worden gereguleerd door ANXA4 en zijn downstream signalen van ANXA4.

Ca 2 + Bemiddelt ANXA4 Downstream signaaloverdrachten

In carcinogenese, Ca ^{2+ is betrokken bij signaaltransductie veroorzaakt een groot aantal biologische processen waaronder invasie, proliferatie, angiogenese en metastase [32] mediëren. Er is gerapporteerd dat sommige annexinen fysiologische mechanismen kunnen bemiddelen in een Ca 2 + -afhankelijke wijze [9]. In eerdere studies, intracellulaire [Ca 2 +] _{i hoogte werd geïnduceerd door H.
pylori infectie, welke op zijn beurt omhoog-reguleert ANXA4 expressie [17], [33]. Te bepalen of een toename van intracellulair [Ca 2 +] i bemiddelt de overdracht van stroomafwaartse signalen van ANXA4 werden AGS cellen behandeld met ionomycine. Ionomycine is een Ca 2 + ionofoor en is in onze AGS celmodel aan het kweekmedium toegevoegd aan een aanhoudende verhoging van intracellulair induceren [Ca 2 +] i [34]. De eiwitexpressies van ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT en fosfo-CDK1 werden gemeten door immunoblot analyse (Figuur 5A). Net als bij onze observaties met ANXA4 overexpressie, verhoogde [Ca 2 +] i levels aanzienlijk up-gereguleerd de expressie van RHAMM ( P Restaurant < 0,01) en fosfo-AKT (Ser 473) ( P Restaurant < 0,05) en aanzienlijk neerwaarts gereguleerd de expressie van p21 ( P Restaurant < 0,01) (Figuur 5B). CDK1 activering werd licht verhoogd door [Ca 2 +] i elevatie. Echter, verhoogde [Ca 2 +] i niveaus had geen effect op de expressie van ANXA4 en LAMP2. In onze vorige studie, kunnen ANXA4 en LAMP2 lokaliseren om plasmamembraan na H. pylori
infectie met intracellulaire [Ca 2 +] i elevatie (figuur S4 en File S1). Deze resultaten suggereren dat Ca 2 + gewoon verandert intracellulaire locatie van ANXA4 en LAMP2, maar niet reguleert hun expressie.}}

Discussie

In het onderzoek naar kanker, de identificatie van biomarkers en de daaropvolgende toelichting hun mechanistische relatie met tumorigenese kan bijdragen aan de ontwikkeling van bruikbare diagnostische instrumenten en resulteren in optimale therapeutische strategieën. Onlangs zijn er steeds meer studies aangetoond dat de biomarker gegadigde eiwitten in de familie annexinen potentieel rol in de progressie van verschillende kankers; bijv ANXA1 voor clear cell nierkanker, ANXA2 voor maagkanker en darmkanker, ANXA4 voor colorectale kanker, ANXA8 voor borstkanker, ANXA10 voor hepatocellulaire kanker, ANXA11 voor eierstokkanker en darmkanker [35]. ANXA4, lid van de familie annexinen, is waargenomen dat overexpressie gastrische tumorweefsels en ook geassocieerd met de maag-kankergerelateerde H. pylori
infectie [17]. Bovendien is een ander annexinen familielid, ANXA2 ook waargenomen dat overexpressie van maagkanker en is gerelateerd aan slechte klinische resultaten, waardoor het een potentiële prognostische factor [36]. Samen vormen deze bevindingen suggereren de betrokkenheid van ANXA4 in het ontstaan ​​van tumoren; echter de exacte mechanisme op het proces blijft onduidelijk. Om de cellulaire functie van ANXA4 in de progressie van maagkanker verder te evalueren, hebben we de verbinding tussen beide en vervolgens aangetoond dat ANXA4 kankergerelateerde genen reguleren en propageren pad celproliferatie.

In de huidige studie, vonden we dat-carcinogenese geassocieerde eiwitten zoals RHAMM, AKT, p21, PBK, en CDK1 worden gereguleerd door de overexpressie van ANXA4. Schematisch ANXA4 geïnduceerde downstream signalen met betrekking tot celproliferatie wordt getoond in figuur 6. HMMR
(RHAMM) een oncogen dat tot overexpressie wordt gebracht in een aantal kankers, zoals maagkanker, en is betrokken bij vele cellulaire processen, zoals celsignalering, celproliferatie en tumorigenese [37], [38].

vermeld is dat RHAMM induceert de RAS signaalcascade en activeert AKT [39]. De RAS signaalcascade overbrengt downstream signalen door activering fosfo-AKT tot fosfoinositide 3-kinases. Deze activering van AKT is ook vermeld als een marker voor maagkanker progressie [40]. We hebben eerder gemeld dat H.
pylori infectie wordt geassocieerd met overexpressie ANXA4 [17]. H. pylori
kan het cytotoxine geassocieerde gen A (CagA) brengt in gastheercellen, waardoor AKT activering en dus het bevorderen celproliferatie [41]. In termen van overleving van de cel, AKT onderdrukt apoptose door het stimuleren van NF-KB [42]. Recente studies hebben ook aangetoond dat ANXA4 interactie met p105 (de NF-KB p50 precursor eiwit) en onderdrukt de transcriptionele activiteit van NF-KB een anti-apoptotisch effect [25] induceren. Samengevat, deze waarnemingen aan dat ANXA4 speelt een belangrijke rol in celoverleving en celgroei.

CDK1-cycline B1 complexen reguleren van de celcyclus G2 /M fase en zijn ook betrokken bij het bevorderen van tumorigenese [43]. Een recente studie toonde aan dat verhoogde expressie van CDK1 wordt geassocieerd met de progressie van H. pylori
geassocieerde gastritis to-slijmvlies geassocieerd lymfeweefsel lymfoom [28]. In deze studie, CDK1 activering werd up-gereguleerd door ANXA4. Deze gebeurtenissen suggereren dat ANXA4 de downstream-signaalroute kan bemiddelen, wat leidt tot het ontstaan ​​van tumoren bij maagkanker patiënten met een H.
pylori infectie.

Naast zijn rol in de progressie van kanker, is ANXA4 ook gekoppeld aan verworven chemoresistance antikanker drugs [44], [45], [46]. Een paclitaxel-resistente cellijn (H460 /T800), wordt expressie verhoogd ANXA4 en gelokaliseerd in de nucleus [44]. In clear cell ovariumcarcinoom en mesothelioom cellen wordt ANXA4 expressie verhoogd en geassocieerd met resistentie tegen behandeling met carboplatin en wordt beschouwd als een biomarker voor gevoeligheid voor cisplatine [45] zijn [46]. Bovendien ANXA4 een intracellulair Ca ^{2+ sensor en Ca 2+ een belangrijke rol neurotoxiciteit en hartfalen [47] bereikt, [48]. Recente studies hebben aangetoond dat de verhoogde hoeveelheid ANXA4 wordt niet alleen geassocieerd met kanker, maar ook de ziekte van Alzheimer, hartfalen en cel letsel veroorzaakt door ethanol [49], [50], [51].}

Ca ^{2+ messenger systeem is ook nodig voor celproliferatie proces en kan celcyclus [52] [53] te reguleren. Vermeld is dat Ca 2+ AKT pad kan activeren om celoverleving [54] bevorderen. In deze studie hebben we vastgesteld dat de uitdrukking van RHAMM, fosfo-AKT en de onderdrukking van p21 aanzienlijk werden verhoogd met [Ca 2 +] _{i elevatie (Figuur 5). H. pylori
infectie wordt geassocieerd met ANXA4 overexpressie en intracellulaire [Ca 2 +] i elevatie (figuur S4 en File S1) [17], [33]. Deze resultaten geven aan dat H. pylori
infectie kan een aantal downstream signalering van ANXA4 induceren door het stimuleren van intracellulaire [Ca 2 +] i elevatie. Niettemin de details mechanisme op het proces kan complex zijn en blijft onduidelijk. Deze kunnen opheldering van de maag ontstaan ​​van tumoren proces onderliggende H bieden. pylori
stimulatie. Bij elkaar genomen, deze gegevens blijkt dat Ca 2 + zou helpen ANXA4 te transduceren signalering en ontstaan ​​van tumoren te bevorderen in de maag bij patiënten met H.
pylori infectie.}}

Samenvattend tonen onze resultaten dat de silencing van ANXA4 afneemt epitheelcel proliferatie, terwijl de overexpressie proliferatie verhoogt. Bovendien induceert ANXA4 downstream signalen die celgroei bevorderen. Onze hypothese is dat deze downstream signalen en activatie van gastheer celdeling kan pathogene gebeurtenissen in H. pylori
geïnduceerde carcinogenese. In de huidige klinische therapie, AKT, p21 en CDK1 gebruikt als een antikanker drug target. AKT-remmer, Perifosine, is een oraal antikankermiddel en heeft een anti-proliferatie-activiteit in verschillende tumormodellen [55], [56], [57]. Paclitaxel (Taxol) en vincristine kan veroorzaken en het verhogen van p21 expressie G2 /M arrestatie en blokkeren celproliferatie [58], [59], [60], [61] te verlagen. Flavopiridol is een remmer van verschillende CDK CDK1 waaronder apoptose en anti-angiogenese [62] induceren. Deze studies geven aan dat de verhoging van ANXA4 bij patiënten kan worden beschouwd als een doelwit voor maagkanker therapie. Meerdere geneesmiddelen in combinatie kunnen effectievere behandeling voor het blokkeren van signalen in de weg. samen genomen, kon dit onderzoek nieuwe inzichten in de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor maagkanker.

Materialen en methoden

cellijnen en kweekomstandigheden

Menselijke maag adenocarcinoom AGS cellen (CRL-1739, ATCC) werden gekweekt in 90% RPMI 1640 medium (Biological Industries, Beth-Haemek, Israël) dat werd aangevuld met 1% penicilline /streptomycine en 10% foetaal runderserum (Biological Industries, Beth-Haemek, Israël) . Cellen werden gekweekt bij 37 ° C in een gecontroleerde bevochtigde atmosfeer in een incubator met 5% CO _2.

Plasmiden en transfecties

Full-length ANXA4
WAS geamplificeerd door PCR met het primerpaar ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') en ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), en het amplificatieproduct werd in de HindIII /EcoRI plaatsen van pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
-specifieke siRNA en negatieve controle siRNA Stealth (Stealth RNAi ™) werden gekocht van Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Cellen werden gekweekt in platen met zes putjes of beklede dekglaasjes gedurende 24 uur. Cellen werden vervolgens voorbijgaand getransfecteerd met pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 ug van een zes-puts plaat; 0,4 ug /ml voor een 96-well-plaat E) of ANXA4
siRNA (100 pmol van een zes-puts plaat, 10 pmol van een 96-well-plaat E) met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. De efficiëntie van expressie vector en siRNA transfectie werd geanalyseerd door immunoblot. Na transfectie gedurende 48 uur, de differentiële expressie van eiwitten en genen gedetecteerd

Antibodies

De muis monoklonale antilichamen gebruikt in deze studie waren als volgt:. CDK1 P34 (SC-51578) uit Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); LAMP2 (ab25631) en RHAMM (ab67003) van Abcam (Cambridge, UK); en α-tubuline (T5168) van Sigma (Dorset, UK). Konijn polyklonale antilichamen waren als volgt: ANXA4 (SC-28827), p21 (sc-397) en pCDK1 p34 (Thr 161; sc-101.654) van Santa Cruz Biotechnology; en AKT (9272) en Pakt (Ser 473, 9271S). van Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)

Immunoblottingtest

Cellysaten werden bereid uit AGS cellen die transient werden getransfecteerd met de expressievectoren pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 ug) of ANXA4
siRNA (100 pmol). De verschillen in eiwitexpressie bij hoge intracellulaire bepalen [Ca ^{2 +] _{i, ionomycine (5 uM) toegevoegd aan de cellen gedurende 1 uur geroerd. Om de effecten van remming van Akt fosforylering bestuderen, werden de cellen uitgehongerd voor 1,5 uur na een 48-uur transfectie en werden behandeld met 5 pM van de remmer AKT VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) gedurende 1 uur. De monsters werden gescheiden door 10% SDS-PAGE en vervolgens overgebracht op polyvinylideen (PVDF) membranen (Millipore, Billerica, MA, USA). Na het blokkeren in 5% niet vette melk en tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) dat 0,1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schommelen, de volgende primaire antilichamen werden toegepast: anti-ANXA4 ( 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-pakt (Ser473, 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500) en anti-RHAMM antilichaam (1:400). Membranen werden geïncubeerd met secundaire geit anti-muis IgG geconjugeerd antilichamen (Sigma) of geit anti-konijn geconjugeerd IgG (Rockland, Gilbertsville, PA), respectievelijk. a-tubuline antilichaam (1:4000) werd gebruikt als een interne controle. Immunoblots werden ontwikkeld met behulp van verbeterde chemiluminiscence (ECL) detectie kit (Millipore) en zichtbaar op de X-ray-films. De intensiteit van de waargenomen banden werd genormaliseerd op de intensiteit van de α-tubuline band. Densitometrische analyse werd uitgevoerd met behulp van Kodak 1-D Image Analysis-software versie 3.6 (Eastman Kodak, Londen, UK).}}

Exon Array hybridisatie en analyse

Om de downstream genen van ANXA4 bestuderen, we vergeleken de genexpressieprofielen tussen de cellen getransfecteerd met pcDNA3.1 (+) / ANXA4 Kopen en regelcellen getransfecteerd met een lege vector met een exon array. Totaal cellulair RNA werd geëxtraheerd met behulp TRIzol® reagens (Invitrogen), en RNA zuiverheid werd bevestigd spectrofotometrisch (A260 /A280-verhouding) en door capillaire elektroforese (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). RNA processing en hybridisatie werden uitgevoerd met het Affymetrix Human Exon 1,0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Elke array heeft 28.869 goed geannoteerde genen met 764.885 verschillende sondes. De array bevat ongeveer 26 probes voor ieder gen. informatie Affymetrix probe sets worden weergegeven op NetAffx website (http://www.affymetrix.com) [63]. Microarray analyse (n = 2 per groep) werd uitgevoerd met het Partek Genomics Suite versie 6.5 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). De ruwe data (CEL-bestanden) werden genormaliseerd met behulp van de robuuste multichip middeling (RMA) algoritme en geanalyseerd met behulp van t
testen. Analyse van de functie en biologisch mechanisme van de differentieel tot expressie gebrachte genen werd uitgevoerd met het Ingenuity Pathway analyse (IPA) softwareversie 7,5; een score van 3 of hoger werd beschouwd als statistisch significant ( P Restaurant < 0,01) om de informatie te annoteren. We hebben de array gegevens voorgelegd aan de GEO-database, en de serie record aantal is GSE33620.

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)

De exon-array gegevens die zijn verkregen met behulp van software en Partek de IPA gegevensbank werd bevestigd door qRT-PCR. RNA werd geïsoleerd uit cellen met behulp AGS TRIzol® reagens (Invitrogen) en de RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Eerste streng cDNA werd gesynthetiseerd uit totaal mRNA een reverse transcriptie kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primers (Tabel S2) werden ontworpen met behulp van software DNAStar (DNAStar, Inc., Madison, WI, USA) en PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Genexpressie werd gemeten met een Bio-Rad IQ5 real-time PCR detectiesysteem met SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), en werd genormaliseerd op GAPDH expressie.

Cell Proliferation Assay

AGS cellen werden geladen in elke well van een 16-well microtiter plate-E. Elk putje bevatte micro sensorarrays aan de basis om de cel index (CI) te detecteren. Voor transfectie-experimenten na incubatie gedurende 24 uur, AGS cellen werden getransfecteerd met expressievectoren of siRNAs gedurende 6 uur en gecontroleerd op een totaal van 84 uur. De E-plaat werd in de real-time Cell Analyzer (RTCA) systeem gebracht en geïncubeerd in een incubator met 5% CO _{2 bij 37 ° C. Het niveau van celproliferatie werd voorgesteld als BI, gebaseerd op de elektrische impedantie gemeten met de xCELLigence systeem (Roche, Mannheim, Duitsland).}

Statistische analyse

De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Verschil tussen onafhankelijke groepen werd geanalyseerd met behulp van t Electronics Test een tweezijdige Student's. Gegevens uit de celproliferatie assay werden geanalyseerd met de twee steekproeven Kolmogorov-Smirnov-test. Een P
waarde van minder dan 0,05 aangegeven statistische significantie.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Scatter plot van de sonde intensiteiten in de herhaalde exon reeks experimenten. De sonde intensiteiten van twee herhaalde experimenten werden afzonderlijk op presenteerde een X
-as en Y
-as. Elke probe werd vertegenwoordigd door een enkele punt in de scatter plot. Deze resultaten toonden aan de samenhang in onze tweevoud exon reeks experimenten
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s001
(TIF)
Figuur S2.
ANXA4 participeert in plasmamembraan reparatie door het werven van exocytotische membraan. Representatieve flowcytometrische analyses aangetoond dat de aanwezigheid van LAMP2 in H. pylori
geïnfecteerde cellen. (A)-ANXA4 overexpressie cellen werden vergeleken met (B) ANXA4
-silenced cellen. De resultaten geven aan dat ANXA4 bevordert LAMP2 expressie op het oppervlak van H. pylori
geïnfecteerde cellen. ANXA4 overexpressie, Over-ANXA4; Control siRNA, siControl; . ANXA4
siRNA, si ANXA4
doi: 10.1371 /journal.pone.0044615.s002
(TIF)
Figuur S3.
ANXA4 induceert stroomafwaartse signaaltransductie. Een qRT-PCR-test van ANXA4-overexpressie AGS cellen (zwarte dozen) werd uitgevoerd om de verkregen uit exon arrays (grijze vakken) gegevens te bevestigen. De relatieve mRNA-niveaus van CDK1- Kopen en PBK
werden gemeten en genormaliseerd naar GAPDH
mRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF)
figuur S4.
intracellulaire Ca 2 + hoogte, ANXA4 en LAMP2 lokalisatie na H. pylori
infectie. (A) H. pylori
geïnfecteerde AGS-cellen werden geladen met Fluo-3 /AM intracellulaire Ca 2 + niveaus cytometry te controleren door flow. (B) Dynamisch lokalisatie van ANXA4 in de levende cel. Real-time fluorescentie beelden die lokalisatie van EGFP-ANXA4 in H.
pylori geïnfecteerde AGS en SC-M1 cellen (gele pijl) gekleurd met Hoechst 33258. (C) LAMP2 fluorescentie op het oppervlak van H.

• PLoS ONE: Het effect van XPD /ERCC2 Polymorfismen op maagkanker Risk tussen verschillende etnische groepen: een systematische review en meta-analyse
• PLoS ONE: uitgescheiden eiwit zuur en rijk aan cysteïne (SPARC) Onderdrukt Angiogenese door stads Regulering van de expressie van VEGF en MMP-7 bij maagkanker