Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального научного совета Тайваня (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), Национальный университет Тайваня Передовая Рулевое управление научно-исследовательский проект (10R70602C3) и Национальный институт исследований в области здоровья, Тайвань (NHRIEX100-9819PI). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка является второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире и показывает высокую распространенность в азиатских популяциях. Хотя заболеваемость раком желудка снижается, общий показатель 5-летней выживаемости остается на низком уровне [1]. Определение наиболее эффективных лечения рака желудка и развития на ранней стадии диагностики являются важными стратегиями в затрагивающих клинические исходы. Всестороннее исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе канцерогенеза желудка может оказать помощь в разработке полезных терапевтических стратегий для этого заболевания.
хеликобактерной Активация ANXA4 Содействует пролиферации клеток ANXA4 Регламентирует активации AKT, CDK1 и подавление p21 CDK1-циклин В1 комплексы регулируют /M фазе клеточного цикла G2 и также участвуют в продвижении туморогенез [43]. Недавнее исследование показало, что увеличение экспрессии CDK1 связано с прогрессированием от H. пилори В заключение, наши результаты показывают, что глушение ANXA4 снижает пролиферацию эпителиальных клеток, в то время как его избыточная экспрессия увеличивает пролиферацию. Кроме того, ANXA4 индуцирует вниз по течению сигналы, которые способствуют росту клеток. Мы предполагаем, что эти сигналы вниз по течению и активация деления клетки-хозяина могут быть патогенные события в H. пилори Клеточные линии и условия культивирования аденокарциномы желудка человека AGS клетки (CRL-1739, АТСС) выращивали в 90% RPMI 1640 (Biological Industries, Бет-ха-Эмек, Израиль), который был с добавлением 1% пенициллина /стрептомицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biological Industries, Бет-ха-Эмек, Израиль) , Клетки культивировали при 37 ° С в контролируемой атмосфере в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% CO <суб> 2. Антитела мышиные моноклональные антитела, используемые в этом исследовании, были следующими:. CDK1 р34 (SC-51578) из Санта Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, США); LAMP2 (ab25631) и RHAMM (ab67003) из Abcam (Кембридж, Великобритания); и α-тубулина (T5168) от компании Sigma (Дорсет, Великобритания). Кроличьи поликлональные антитела были следующими: ANXA4 (SC-28827), P21 (SC-397), и pCDK1 р34 (THR 161; SC-101654) от Santa Cruz Biotechnology; и АКТ (9272) и рАКТ (Ser473, 9271S). от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, США) иммуноблоттинг пролиферации клеток Анализ
является патогеном желудка и является основным этиологическим фактором рака желудка , Примерно половина населения земного шара инфицирована H. пилори
, и более чем 60% больных раком желудка имеют историю H. пилори
-positivity [2], [3], [4]. Недавние исследования показали, что H. пилори
может индуцировать как пролиферацию клеток рака желудка и слизистых оболочек, воспалительные реакции [5], [6]. Таким образом, для того, чтобы исследовать молекулярные механизмы, лежащие в канцерогенез желудка, необходимо исследовать роль и механизмы H. пилори
в желудочном канцерогенезе.
<р> аннексинов экспрессируются повсеместно в большинстве организмов, включая животных, растений, грибов и простейших. Это связано с различными физиологическими функциями [7]. На основе структуры их консервативном домене ядра, аннексины считаются внутриклеточного Са 2+ датчики и фосфолипидов связывающие белки. Они наблюдали, чтобы стимулировать мембранном и агрегацию везикул в ответ на увеличение внутриклеточного [Са 2 +] <суб> я [8], [9]. У людей, наблюдались аннексины иметь целый ряд клеточных функций, которые были подразумеваемый организации цитоскелета, экзоцитоз, эндоцитоз, регулирование канала иона, воспаления, апоптоза, фибринолиза и коагуляции [8]. Аннексинов также считаются быть вовлечены в рак, диабет и воспаления [10]. В последнее время все больше и больше исследований выяснилось, что вовлекают причастность аннексинов в канцерогенеза, а также содействие распространению [11], [12], вторжение [13] и метастазирование [14], [15]. Тем не менее, отношения между всеми членами семьи аннексинов с раком не было характерно.
<Р> аннексина A4 (ANXA4) является членом семейства аннексинов, связанных с пищеварительной системой. Она заметно выражена в эпителиальных клетках [16]. Недавние исследования показали, что ANXA4 считается потенциальным желудка биомаркеров на основе его идентификации в тканях больных раком желудка в протеомическим исследованиях. Up-регулирования ANXA4 специально найдены в H. Pylori
-infected ткани опухоли [17], [18]. Кроме того, многие исследования выявили связь между экспрессией ANXA4 и рак. Это соотношение было сообщено в аденокарциноме поджелудочной железы [19], четкой клеточной карциномы яичников [20], [21], рака почки [22], колоректальный рак [23] и рак предстательной железы [24]. В почечно-клеточная карцинома, повышающая регуляция ANXA4 участвует в распространении опухолевых клеток, способствуя миграции клеток [22]. В больных колоректальным раком, высокая экспрессия ANXA4 была связана с низким уровнем выживаемости и было сообщено в качестве потенциального биомаркера для диагностики опухоли [23]. Поскольку клеточной функции, ANXA4 может вызывать передачу сигналов кальция, антикоагулянты и устойчивость к апоптозу [25], [26]. Эти события свидетельствуют о том, что ANXA4 имеет онкогенного функцию, регулируя скорость роста клеток.
<Р> В этом исследовании мы намеревались выяснить молекулярный механизм, с помощью которого ANXA4 индуцирует канцерогенез. Для достижения этой цели, мы контролировали скорость роста клеток рака желудка с различными уровнями экспрессии ANXA4. Мы также оценили транскрипционный экспрессии профиль ANXA4 сверхэкспрессией клеток и использовали экзона массивы для анализа вниз по течению сигнализацию ANXA4. Из этих исследований мы выявили 9 связанных с раком генов из ANXA4 вниз по течению сигналов, используя базу данных Изобретательность Pathway Analysis (IPA). Кроме того, мы показали, что ANXA4 регулирует активацию RHAMM, AKT, CDK1 и подавление p21, и поэтому предложил ANXA4 Регулируют клеточный путь распространения.
Результаты
<р> ранее мы уже сообщали, что ANXA4 избыточно экспрессируется в H. Pylori
инфицированных тканей желудка опухоли [17]. Для дальнейшего изучения взаимосвязи между ANXA4 и канцерогенеза, мы стремились определить, способствует ли ANXA4 клеточную пролиферацию. Клетки трансфицировали либо полнометражный ANXA4
кДНК для увеличения экспрессии ANXA4 или специфической миРНК, предназначенной для подавления экспрессии ANXA4. После трансфекции, мы контролировали скорость роста AGS рака желудка клеток с использованием системы анализа в реальном масштабе времени клетки (RTCA). Число клеток регистрировали как значение индекса ячейки (CI). Кривые роста клеток AGS были модифицированы после трансфекции. Избыточная экспрессия ANXA4 значительно увеличивает скорость роста клеток в клетках AGS по сравнению с контрольными клетками ( P
&л; 0,001; Фигура 1А), в то время как ANXA4 нокдаун значительно снизились темпы роста ( P &
л; 0,001; Фигура 1В). Эти результаты свидетельствуют о том, что ANXA4 имеет потенциал для содействия пролиферации клеток.
ANXA4 увеличивает экспрессию мембранных белков, RHAMM и LAMP2
<р> Мы также исследовали разницу в экспрессии генов между ANXA4-гиперэкспрессией клетки и контрольные клетки, экспрессирующие пустой вектор. Мы исследовали это с помощью экзонное анализа массива, который предлагает более точное представление о экспрессии генов на уровне с помощью четырех зондов на экзона, по сравнению с обычными 3 'массивов [27]. На рисунке S1, то X
Оу точечного графика показывает интенсивность экспрессии зонда, измеренного в одном эксперименте и Y-
ось отображает интенсивность экспрессии зонда, измеренные в другом эксперименте , Эти результаты указывают на корреляцию между результатами обоих экспериментов и, следовательно, указывает на соответствие между нашими дублированных микрочипов. Уровни экспрессии генов были вычислены из интенсивностей, измеренных с помощью наборов зондов. В целом, было обнаружено, что экспрессия генов 1052 будут значительно отличаться ( P
&л; 0,05). Между ANXA4-гиперэкспрессией клеток и контрольных клеток
<р> ANXA4 является плазматическая мембрана-связывающий белок, поэтому мы предполагают, что другие плазменные мембранные белки могут регулироваться ANXA4 и работать вместе, чтобы преобразовывают его вниз по течению сигнализации. Для того, чтобы исследовать сигнализации трансдукции регулируется ANXA4, мы исследовали плазменные мембранные белки из экзона анализа массива. наблюдались Сорок семь белков плазматической мембраны, чтобы иметь ≥1.5-кратное изменение в ANXA4-гиперэкспрессией клеток (таблица S1). Среди них, гиалуроновая кислота, опосредованной моторики рецептора ( HMMR
) показала наибольший рост в выражении (в 2,4 раза, таблица S1). Кроме того, наше предыдущее исследование показало, что выражение на поверхности клеток лизосомальных-ассоциированной мембранного белка 2 ( LAMP2
), лизосомального маркер, вверх-регулируется ANXA4 и участвует в экзоцитоза (рис S2 и S1 файла) , Здесь, транскрипционный выражение LAMP2
также показали увеличение экспрессии (в 1,8 раза, таблица S1), когда измеренный с помощью анализа экзон массива. В этом исследовании, ANXA4 был избыточно экспрессируется или немоты (рис 2А), а затем анализировали с помощью иммуноблоттинга проверить экспрессию белка RHAMM и LAMP2. ANXA4 избыточная экспрессия повышал экспрессию RHAMM (рис 2В) и LAMP2 (рис 2С) и, в соответствии с этим, нокдаун экспрессии ANXA4 сократили свои уровни экспрессии (рис 2В и 2С).
Рак ANXA4 Гиперэкспрессия Регулирует Экспрессия генов о связанных
<р> Мы использовали базу данных Изобретательность Pathway Analysis (IPA), чтобы выполнить функцию гена анализа данных экзон массива и обнаружили, что 25 из 42 генов, имели право на получение функционального анализа сети (≥2 раза дифференциальное выражение, т
тест, P
&л; 0,05) (таблица 1). Три функциональные сети были связаны с ANXA4-регулируемых генов. Наиболее тесно связаны сеть была
рака, клеточного цикла и репродуктивной системы заболевания ( P
&л; 0,05; Рисунок 3A) и топ-рейтинг заболеваний или расстройств рак
( P
&л; 0,05; Рисунок 3B). Были 9 генов, классифицируемые как генов, связанных с раком в ANXA4-гиперэкспрессией клеток в том числе 7 генов, которые были до регулируемых в наших экспериментах. Эти гены эукариотических перевод фактор инициации 4Е ( eIF4E
), сукцинатдегидрогеназы комплекс, субъединица С, интегральный мембранный белок, 15 кДа ( SDHC
), циклин-зависимой киназы 1 ( CDK1
), удаленные в лимфолейкоза 2 ( DLEU2
), хроматина модификации белка 5 ( CHMP5
), вНЕВРЕМЕННОЙ взаимодействующий белок ( TIPIN
), PDZ- связывании киназы ( ПБК
). Хорионический гормон somatomammotropin 1 (плацентарный лактоген) ( CSH1
) и интерферон альфа 2 ( IFNA2
) были вниз регулируется ANXA4. На основании полученных результатов, мы полагаем, что ANXA4 имеет функцию в индукции пролиферации клеток. Кроме того, CDK1
и ПБК
(Рисунок 3B и Таблица 1) были рассмотрены участвовать в пролиферации индуцирующего модели ANXA4. Так как активация CDK1 связана с пролиферацией клеток в развитии желудочной MALT лимфома [28]. Взаимное активация CDK1 и ПБК уже сообщалось ранее [29]. В этом исследовании, повышающая регуляция CDK1
и ПБК
наблюдается в ANXA4-гиперэкспрессией клеток была подтверждена с помощью количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) анализ (рис S3) .
<р> активации CDK1, которая регулируется p21, ингибирует G2 /M фазы арест, тем самым способствуя митоза и пролиферации клеток [30 ]. Кроме того, сообщалось, что Akt блокирует активацию р21, вызывая его накопление в цитоплазме и, следовательно, содействие пролиферации клеток [31]. С помощью иммуноблот-анализа, мы наблюдали, что избыточная экспрессия ANXA4 увеличилась фосфорилирование серина 473 на AKT и треонина 161 на CDK1 и снижение экспрессии p21 (рис 4А). В дополнение к этому, что нокдаун экспрессии ANXA4 уменьшилось фосфо-АКТ и фосфо-CDK1 и повышал экспрессию р21 (фиг.4В). Эти данные показывают, что фосфо-AKT, фосфо-CDK1 и р21 регулируются ANXA4 и вниз по течению сигналы ANXA4.
Ca 2+ посредничает ANXA4 Downstream Signaling Трансдукция
<р> В канцерогенеза, Са 2 + участвует в возникновении трансдукции сигнала опосредует большое разнообразие биологических процессов, включая инвазию, пролиферацию, ангиогенез и метастазирование [32]. Было сообщено, что аннексины может стать посредником некоторые физиологические механизмы в Са 2 + -зависимая образом [9]. В предыдущих исследованиях, внутриклеточный [Са 2 +] <югу> я высота индуцировали H. Pylori
инфекция, которая, в свою очередь, до-регулирует экспрессию ANXA4 [17], [33]. Чтобы определить увеличение внутриклеточного [Са 2 +] <суб> я опосредует ли передача сигналов вниз по течению от ANXA4, AGS клетки обрабатывали иономицином. Ionomycin является Са 2 + ионофор и добавляли в культуральную среду в нашей модели AGS клеток, чтобы индуцировать поддерживаемое повышение внутриклеточной [Са 2 +] <суб> I [34]. Белковые выражения ANXA4, LAMP2, RHAMM, р21, фосфо-AKT и фосфо-CDK1 были измерены с помощью иммуноблот-анализа (рис 5А). Подобно нашим наблюдениям с ANXA4 оверэкспрессии, увеличение [Са 2 +] <суб> I уровни значительно повышающей регуляции экспрессии RHAMM ( P
&л; 0,01) и фосфо-AKT (Ser 473) ( P
&л; 0,05) и значительно понижающей регуляции экспрессии p21 ( P
&л; 0,01) (рис 5B). активация CDK1 слегка увеличена на [Са 2 +] <суб> я возвышении. Тем не менее, повышенный уровень [Ca 2 +] <суб> I уровни не имели никакого влияния на экспрессию ANXA4 и LAMP2. В нашем предыдущем исследовании, ANXA4 и LAMP2 можно локализовать в плазменной мембране после H. Pylori
инфекция с внутриклеточным [Са 2 +] <югу> я высота (рис S4 и S1 File). Эти результаты свидетельствуют о том, что Са 2+ просто меняет внутриклеточный расположение ANXA4 и LAMP2, но не регулирует их выражение.
Обсуждение
<р> В исследовании рака, выявление биомаркеров и последующее уточнение их механистических отношений с онкогенеза может способствовать разработке полезных диагностических инструментов и привести к оптимальной терапевтической стратегии. В последнее время все больше и больше исследований показали, что биомаркеры-кандидаты белки в семье аннексины являются потенциально важную роль в прогрессировании различных онкологических заболеваний; например, ANXA1 для ясного почечно-клеточного рака, ANXA2 для рака желудка и колоректального рака, ANXA4 для колоректального рака, ANXA8 для рака молочной железы, ANXA10 для гепатоцеллюлярной рака, ANXA11 для рака яичников и рака толстой кишки [35]. ANXA4, член семейства аннексинов, было обнаружено, что избыточно экспрессируется в желудочном опухолевых тканях и также связано с желудочным связанных с раком H. Pylori
инфекции [17]. Кроме того, еще один член аннексины семья, ANXA2, также наблюдалось, чтобы быть избыточно экспрессируется при раке желудка и связана с плохим клиническим исходом, что делает его потенциальным прогностическим фактором [36]. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют об участии ANXA4 в онкогенеза; Однако, точный механизм в процессе, остается неясным. Для того, чтобы дополнительно оценить клеточную функцию ANXA4 в прогрессии рака желудка, мы исследовали связь между этими двумя, а затем показали, что ANXA4 может регулировать гены связанных с раком и распространять путь к пролиферации клеток.
<Р> В в настоящем исследовании, мы обнаружили, что канцерогенез-ассоциированные белки, такие как RHAMM, AKT, р21, ПБК и CDK1 регулируются гиперэкспрессией ANXA4. Схематическое представление ANXA4-индуцированных вниз по течению сигналов, связанных с клеточной пролиферации показано на рисунке 6. HMMR
(RHAMM) является онкоген, который избыточно экспрессируется в нескольких видов рака, включая рак желудка, и участвует во многих клеточных процессы, такие как клеточной сигнализации, клеточной пролиферации и онкогенеза [37], [38].
<р> было сообщено, что RHAMM индуцирует сигнальный каскад RAS и активизирует AKT [39]. Сигнальный каскад РАН трансдуцирует вниз по течению сигналы путем активации фосфо-AKT через фосфоинозитид 3-киназ. Эта активация AKT также сообщалось в качестве маркера для прогрессирования рака желудка [40]. Ранее мы уже сообщали, что H. Pylori
инфекция связана с ANXA4 избыточной экспрессии [17]. H. пилори
может доставить Цитотоксин связанный ген (CagA) в клетки-хозяева, в результате чего в активации AKT, и тем самым способствуя пролиферации клеток [41]. С точки зрения выживания клеток, подавляет апоптоз AKT стимулируя NF-kB [42]. Недавние исследования также показали, что ANXA4 взаимодействует с p105 (белка-предшественника p50, NF-kB) и подавляет транскрипционную активность NF-kB, чтобы индуцировать антиапоптозную эффект [25]. Взятые вместе, эти наблюдения указывают на то, что ANXA4 играет важную роль в выживаемости клеток и роста клеток.
-associated гастрит на слизистую оболочку-ассоциированной лимфомы лимфоидной ткани [28]. В этом исследовании, активация CDK1 была вверх регулируется ANXA4. Эти события позволяют предположить, что ANXA4 может посредничать вниз по течению сигнального пути, что приводит к онкогенеза у больных раком желудка с H. Pylori
инфекция.
<р> В дополнение к его участию в прогрессировании рака, ANXA4 также был связан с приобретенным химиорезистентности к противоопухолевым препаратам [44], [45], [46]. В клеточной линии паклитакселом долговечного (Н460 /T800), ANXA4 экспрессия увеличивается и локализованы в ядре [44]. В ясном карциномой клеток яичников и мезотелиомы, экспрессия ANXA4 повышается и связанный с устойчивостью к лечению с карбоплатином, и считается биомаркером восприимчивости к цисплатина [45], [46]. Кроме того, ANXA4 является внутриклеточным Ca 2 + датчик и Са 2 + играет важную роль в нейротоксичности и сердечной недостаточности [47], [48]. Недавние исследования показали, что повышенное количество ANXA4 не только связанные с раком, но и болезнь Альцгеймера, сердечная недостаточность и повреждение клеток, вызванное этанолом [49], [50], [51].
<Р> Са 2+ система мессенджер также необходим для процесса пролиферации клеток и может регулировать клеточный цикл [52], [53]. Сообщалось, что Са 2 + может активировать AKT путь, чтобы способствовать выживанию клеток [54]. В этом исследовании мы обнаружили, что экспрессия RHAMM, фосфо-AKT и подавление p21 были значительно увеличены на [Са 2 +] <югу> я высота (рисунок 5). H. Pylori
инфекция связана с ANXA4 оверэкспрессии и внутриклеточным [Са 2 +] <югу> я высота (рис S4 и File S1) [17], [33]. Эти результаты указывают на то, что H. Pylori
инфекция может вызвать некоторую нижестоящую передачу сигналов от ANXA4, стимулируя внутриклеточные [Са 2 +] <суб> я возвышении. Тем не менее механизм детали в процессе работы могут быть сложными и остается неясным. Это может послужить выяснению желудка процесса онкогенеза, лежащей в основе H. пилори
стимуляции. Взятые вместе, эти данные показывают, что Са 2+ может помочь ANXA4 для трансдукции сигнализации и содействовать туморогенез в желудочных больных с H. Pylori
инфекция.
-индуцированное канцерогенеза. В современной клинической терапии, АКТ, р21 и CDK1 использовались в качестве мишени противоопухолевого препарата. ингибитор AKT, Perifosine, является пероральным противораковым средством и обладает активностью против пролиферации в нескольких моделях опухолей [55], [56], [57]. Паклитаксел (таксол) и винкристин может вызывать и увеличивать экспрессию р21, чтобы уменьшить G2 /M арест и пролиферацию клеток блок [58], [59], [60], [61]. Флавопиридол является ингибитором нескольких CDKs включая CDK1 индуцировать апоптоз и анти-ангиогенеза [62]. Эти исследования указывают на то, что повышение ANXA4 у пациентов, можно было бы рассматривать в качестве мишени для лекарственного средства для терапии рака желудка. Использование нескольких препаратов в комбинации может обеспечить более эффективное лечение для блокировки сигналов в пути. В совокупности это исследование может обеспечить новое понимание в разработке терапевтических стратегий для рака желудка.
Материалы и методы
плазмид и Трансфекция
<р> Полноразмерные <ЕМ> ANXA4
было амплифицировали с помощью ПЦР с использованием пары праймеров, ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') и ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), и продукт амплификации встраивали в HindIII /EcoRI-сайты pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
-специфический миРНК и отрицательный контроль Stealth миРНК (Stealth RNAi ™) были приобретены у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США). Клетки культивировали в шесть-луночных планшетах или на покрытых покровных стеклах в течение 24 ч. Затем клетки трансфицированы с pcDNA 3.1 (+) /<ЕМ> ANXA4
(8 мкг в течение шести-луночного планшета; 0,4 мкг /мл в течение 96-и E-пластины) или ANXA4
миРНК (100 пмоль за шесть-луночного планшета, 10 пмоль для 96-луночного E-пластины) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Эффективность экспрессии вектора и миРНК трансфекции анализировали с помощью иммуноблоттинга. После трансфекции в течение 48 ч, была обнаружена дифференциальная экспрессия белков и генов
<р> Клеточные лизаты получали из клеток AGS, которые были транзиторно трансфицированных векторы экспрессии pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 мкг) или ANXA4
миРНК (100 пмоль). Для определения различий в экспрессии белка в условиях высокой внутриклеточной [Са 2 +] <суб> I, иономицин (5 мкМ) добавляли к клеткам в течение 1 ч. Для изучения влияния ингибирования фосфорилирования Akt, клетки подвергали голоданию в течение 1,5 ч после 48-ч трансфекции и обрабатывали 5 мкМ ингибитора AKT VIII (Merck KGaA, Дармштадт, Германия) в течение 1 ч. Образцы были разделены на 10% SDS-PAGE, а затем переносили на поливинилиденфторид (ПВДФ) мембраны (Millipore, Billerica, MA, USA). После блокирования в 5% обезжиренного молока и трис-буферном растворе (TBS), содержащего 0,1% твин-20 (JT Baker, Филипсбург, Нью-Джерси, США) в течение 1 ч при комнатной температуре и при легком покачиванием, были применены следующие первичные антитела: анти-ANXA4 ( 1:1000), анти-p21 (1:500), анти-AKT (1:500), анти-рАКТ (Ser473; 1:500), анти-CDK1 (1:1000), анти-pCDK1 (Thr 161; 1:500), и анти-RHAMM антитело (1:400). Мембраны инкубировали с вторичным козьим антителом против мышиного IgG, конъюгированных антител (Sigma) или козы к антителам кролика, конъюгированным IgG (Рокленд, Gilbertsville, штат Пенсильвания), соответственно. альфа-тубулина антитело (1:4000) использовали в качестве внутреннего контроля. Иммуноблоты были разработаны на основе использования усовершенствованных chemiluminiscence (СТЭК) комплект обнаружения (Millipore) и визуализировали на рентгеновской пленке. Интенсивность наблюдаемых полос была нормирована на интенсивность α-тубулина полосы. Денситометрический анализ проводился с использованием Kodak 1-D анализа изображений программное обеспечение версии 3.6 (Eastman Kodak, Лондон, Великобритания).
Экзон Массив гибридизация и анализ
<р> Изучить вниз по течению гены ANXA4, мы сравнили экспрессия гена профили между клетками, трансфецированные пкДНК3.1 (+) /<ЕМ> ANXA4
и контрольных клеток, трансфицированных пустым вектором с использованием массива экзона. Общую клеточную РНК экстрагировали с использованием TRIzol® реагента (Invitrogen), и чистота РНК была подтверждена с помощью спектрофотометрии (отношение А260 /А280), а также с помощью капиллярного электрофореза (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, США). обработка РНК и гибридизацию проводили с использованием Affymetrix Human Экзон 1.0 ST массивы (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя. Каждый массив имеет 28,869 хорошо аннотированные гены с 764,885 различных зондов. Массив содержит около 26 зондов для каждого гена. Информация о Affymetrix зонда наборов отображаются на веб-сайте NetAffx (http://www.affymetrix.com) [63]. анализ микрочипов (п = 2 на группу) проводили с использованием Partek Genomics Suite, версия 6.5 (Partek Inc., Сент-Луис, штат Миссури, США). Исходные данные (CEL файлы) были нормализованы с использованием алгоритма надежные многокристальный усреднения (РМА) и проанализированы с помощью т
тесты. Анализ функции и биологического механизма дифференциально выраженных генов проводили с использованием изобретательности Pathway Analysis (IPA) программное обеспечение версии 7.5; балл 3 или выше считалось статистически значимым ( P
&л; 0,01) для аннотирования информации. Мы представили данные массива в базу данных GEO, и номер серии запись GSE33620.
Количественная ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)
<р> Данные экзон массива, полученные с помощью программного обеспечения Partek и база данных ИПА была подтверждена QRT-PCR. РНК выделяли из AGS клеток с использованием TRIzol® реагента (Invitrogen) и RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Первой нити кДНК синтезировали из общего количества мРНК с использованием обратной транскрипции набора (Invitrogen, Carlsbad, CA). Праймеры (Таблица S2) были разработаны с использованием программного обеспечения DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA) и PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). экспрессии генов измеряли с использованием в режиме реального времени система обнаружения ПЦР Bio-Rad iQ5 с SYBR Green СУПЕРМИКС (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), и нормализовалась к выражению GAPDH.
<р> AGS клетки были загружены в каждую лунку 16-луночного микротитрационного E-пластины. Каждая лунка содержала микроэлектронные массивы датчиков на базе для определения индекса клеток (CI). Для трансфекции, после инкубации в течение 24 ч, AGS клетки трансфицировали векторами экспрессии или миРНК в течение 6 ч и контролировали в общей сложности 84 ч. E-планшет помещали в системе в режиме реального времени Cell Analyzer (RTCA) и инкубировали в инкубаторе, содержащем 5% CO <суб> 2 при температуре 37 ° C. Уровень пролиферации клеток был представлен как CI, который был основан на электрического импеданса, измеренного с помощью системы xCELLigence (Roche, Mannheim, Германия).
Статистический анализ
<р> Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Разница между независимыми группами анализировали с использованием двух Стьюдента т
тест. Данные, полученные из анализа пролиферации клеток анализировали с использованием двух образцов тест Колмогорова-Смирнова. A P
значение менее 0,05 указано статистической значимости.
Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Точечная диаграмма интенсивностей зонда в повторных экспериментах массива экзонов. были представлены отдельно Интенсивности зондовые двух повторных экспериментов на элемент X
Оу и Y
Оу. Каждый зонд был представлен одной точкой в график рассеяния. Эти результаты показали последовательность в наших экспериментах массив дубликатом экзонным
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0044615.s001
(TIF) Рисунок S2
.
ANXA4 участвует в ремонте плазматической мембраны путем набора экзоцитоза мембраны. Представитель проточной цитометрии анализ показал наличие LAMP2 в H. пилори
-infected клетки. (A) ANXA4-гиперэкспрессией клетки по сравнению с (В) ANXA4
-silenced клетки. Результаты показывают, что ANXA4 способствует экспрессии ЛАМПА2 на поверхности H. пилори
-infected клетки. ANXA4 избыточная экспрессия, Over-ANXA4; Контроль миРНК, siControl; . ANXA4
миРНК, си ANXA4
DOI: 10.1371 /journal.pone.0044615.s002
(TIF) Рисунок S3
.
ANXA4 индуцирует вниз по течению трансдукции сигнала. QRT-ПЦР-анализ на ANXA4-гиперэкспрессией AGS клетки (черные ящики) проводили для подтверждения данных, полученных из экзона массивов (серые коробки). Уровни относительной мРНК CDK1
и ПБК
были измерены и нормированы на GAPDH
уровни мРНК
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF) Рисунок S4
.
внутриклеточного Са 2 + высота, ANXA4 и локализация LAMP2 на H. пилори
инфекции. (A) H. Pylori
-infected AGS клетки были загружены Fluo-3 /AM для мониторинга внутриклеточного Ca 2 + уровни с помощью проточной цитометрии. (В) Динамическая локализация ANXA4 в живой клетке. В режиме реального времени флуоресцентные изображения, показывающие локализацию EGFP-ANXA4 в H. пилори
-infected AGS и клетки SC-M1 (желтая стрелка) окрашивали Hoechst 33258. (С) LAMP2 флуоресценции на поверхности H.
Отметка потенциальных молекулярных предикторов ответа на биологическую терапию при язвенном колите
Сырой корм для домашних животных представляет опасность для людей и животных
Если вам больше 50,
Пептид паучьего яда может помочь снять боль при синдроме раздраженного кишечника
Лейкоциты и их роль в головном мозге
Наличие определенных кишечных бактерий у матери может защитить ребенка от пищевой аллергии
Кишечные бактерии связаны с метаболическими изменениями и аутизмом в новом исследовании
Исследователи из Калифорнийского технологического института сделали важное открытие, которое может объяснить, как кишечные бактерии могут способствовать поведению, схожему с аутизмом. Команда обнару
Вибрация всего тела помогает уменьшить воспаление,
благодаря микробиому кишечника Вибрация всего тела, по-видимому, улучшает многие симптомы сахарного диабета II типа. при этом глюкоза и деструктивное воспаление нарастают. Процедура помогает организму
Заболевания десен и риск рака пищевода и желудка
Американские исследователи опубликовали свои новые данные о заболеваниях десен в исследовательском письме в последнем выпуске журнала. Кишечник названный, Парадантоз, потеря зуба, и риск аденокарцин