PLoS ONE: Otkrivanje molekularni mehanizam rak želuca Marker Aneksinu A4 proliferacije stanica raka Korištenje eksona nizovi

Sažetak pregled

Rak želuca je zloćudna bolest koja nastaje iz želuca epitela. Potencijalni biomarker za rak želuca je protein aneksin A4 (ANXA4), unutarstanični Ca ^{2 + senzor. ANXA4 ponajprije se nalazi u epitelnim stanicama, a poznato je da je uključena u različitim biološkim procesima, uključujući apoptozu, stanični ciklus i antikoagulacije. U odnosu na rak, ANXA4-prekomjerna ekspresija uočen kod karcinoma različitog porijekla, uključujući i želučanih tumora povezanih s Helicobacter pylori pregled infekcije. H. pylori pregled izaziva ANXA4 izražavanje i unutarstaničnih [Ca 2 +] _{i nadmorske visine, te je važan čimbenik rizika za karcinogeneze koja rezultira raka želuca. Unatoč toj korelaciji, uloga ANXA4 u progresiji želučanih tumora ostaje nejasno. U ovoj studiji smo istraživali da li ANXA4 može posredovati stopu rasta stanica i da li su ANXA4 nizvodno signali koji su uključeni u nastanku tumora. Nakon promatranja stopu rasta stanica u realnom vremenu, utvrdili smo da ANXA4 potiče proliferaciju stanica. Profil transkripcije gena ANXA4-ekspresijom stanica je mjeriti i analizirati ljudskim eksona polja. Iz ovog transkripcije podacima gena, pokazali smo da prekomjerna ekspresija ANXA4 regulira gene koji se zna da su povezani s rakom, primjerice aktivaciju hijaluronske posredovana motiliteta receptor (RHAMM), AKT i ciklin-ovisne kinaze 1 (CDK1), kao potiskivanje p21. Regulacija tih gena dodatno potiče proliferaciju stanica raka. Također smo otkrili Ca 2 + može regulirati prijenos nizvodno signale ANXA4. Predlažemo da ANXA4 aktivira signalnu kaskadu, što dovodi do povećane proliferacije stanica epitela, u konačnici promiče karcinogeneze. Ovi rezultati, dakle, može pružiti novi uvid za želučane terapije protiv raka, posebno putem modifikacije ANXA4 aktivnosti pregled}}

Izvor:. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Otkrivanje molekularni mehanizam rak želuca Marker Aneksinu A4 u proliferacije stanica raka Korištenje eksona polja. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10,1371 /journal.pone.0044615 pregled

Urednik: Eric Y. Chuang, National University Tajvan, Taiwan pregled

Primljeno: 6. lipnja 2012. godine; Prihvaćeno: 6. kolovoz 2012; Objavljeno: 7. rujna 2012 pregled

Copyright: © Lin i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalnog vijeća za znanost Tajvana (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), Nacionalna Sveučilište Tajvan rezanje-rub Upravni Research Project (10R70602C3) a National Health Research Institute, Tajvan (NHRIEX100-9819PI). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu i pokazuje visoku prevalenciju u azijskim populacijama. Iako je incidencija karcinoma želuca je u opadanju, ukupna stopa preživljenja od 5 godina i dalje je niska [1]. Određivanje najučinkovitiji želučanog terapije raka i razvoj u ranoj fazi dijagnostičkih alata su važne strategije u utječu na klinički ishod. Sveobuhvatni istraživanje molekularnih mehanizama koji su temelj želučane karcinogeneze mogao pružiti pomoć u razvoju korisnih terapeutskih strategija za ovu bolest. Pregled

Helicobacter pylori pregled je želučani patogen i to je prevladavajući etiološki faktor za želučane karcinogeneze , Otprilike polovica svjetske populacije zaraženo H. pylori pregled, a više od 60% bolesnika s rakom želuca imaju povijest H. pylori pregled -positivity [2], [3], [4]. Nedavna istraživanja su pokazala da je H. pylori pregled može izazvati obje proliferaciju želučanih stanica raka i sluznice upalnih odgovora [5], [6]. Stoga, kako bi se istražila molekularne mehanizme u podlozi želučane karcinogeneze, potrebno je istražiti ulogu i mehanizme H. pylori
u želučanom karcinogeneze. pregled

Annexins posvuda su izraženi u većini organizama, uključujući i životinja, biljaka, gljiva i protisti. Ona je povezana sa raznim fiziološkim funkcijama [7]. Na temelju strukture njihovog očuvanom jezgrom domeni, annexins se smatra da su intracelularni Ca ^{2 + senzori i obvezujuće fosfolipida proteini. Primijećeno je da stimulira trgovine membrane i agregaciju kesice odgovor na povećanu unutarstaničnim [Ca 2 +] _{i [8], [9]. Kod ljudi, annexins je primijećeno da imaju niz staničnih funkcija koje su implicirana u organizacije citoskeleta, eksocitozu, endocitoze, regulaciju ionskih kanala, upala, apoptoze, fibrinolize i koagulacije [8]. Annexins također smatra da su uključeni u raka, dijabetesa i upale [10]. U posljednje vrijeme, sve više i više studije su se pojavili koji upućuju na uključenost annexins u procesu karcinogeneze, kao i promicanje proliferaciju [11], [12], invazija [13] i metastaze [14], [15]. Međutim, odnos između svih članova annexins obitelji s rakom nije bila obilježena. Pregled}}

Aneksin A4 (ANXA4) je član annexins obitelji povezane s probavnim sustavom. To je vidljivo izražena u epitelnim stanicama [16]. Nedavna istraživanja su pokazala da ANXA4 se smatra potencijalni želučani biomarkera na temelju njegove identifikacije u tkivima pacijenata oboljelih od raka želuca u proteomskom studija. Up-regulaciju ANXA4 posebno naći u H. pylori pregled -infected tumorskih tkiva [17], [18]. Osim toga, mnoge studije su izvijestili odnos između izraza ANXA4 i raka. Ovaj odnos je prijavljen u pankreasnog adenokarcinoma [19], karcinom jasan stanica jajnika [20], [21], karcinoma bubrega [22], kolorektalni karcinom [23] i rak prostate [24]. U karcinoma bubrežnih stanica, up-regulacija ANXA4 je uključen u širenje tumorskih stanica, promovira migraciju stanica [22]. U bolesnika s kolorektalnim karcinomom, visoka ekspresija ANXA4 bila povezana s niskom stopom preživljavanja, a bio prijavljen kao potencijalni biomarker tumora dijagnozu [23]. Ukoliko su stanične funkcije, ANXA4 mogao izazvati kalcija signalizaciju, antikoagulans i otpornost na apoptozu [25], [26]. Ovi događaji pokazuju da ANXA4 ima tumore funkciju reguliranjem stopu rasta stanica. Pregled

U ovom istraživanju željeli smo da se razjasni molekularni mehanizam kojim ANXA4 inducira karcinogeneze. Da bi se to postiglo, pratili smo stopu rasta od želučanih stanica raka s različitim razinama ekspresije ANXA4. Isto smo transkripcijski profile ekspresije ANXA4-ekspresirane stanice i koristi egzona polja za analizu nizvodno signaliziranja ANXA4. Iz tih istraživanja, utvrdili smo 9 raka povezanih gena iz ANXA4 nizvodno signala pomoću domišljatosti Put Analiza (IPA) baze podataka. Nadalje, pokazali smo da ANXA4 regulira aktivaciju RHAMM Akt CDK1 i suzbijanje p21, i stoga je predložio ANXA4 regulirano staničnu proliferaciju put. Pregled

Rezultati

aktivaciji ANXA4 Promiče proliferacija stanica pregled

Mi smo ranije izvijestili da ANXA4 je izraženo u H. pylori pregled zaražene želuca tumorsko tkivo [17]. Kako bi se dodatno istražiti odnos između ANXA4 i karcinogeneze, željeli smo utvrditi da li ANXA4 potiče proliferaciju stanica. Stanice su transfektirane s full-length ANXA4 pregled cDNA za povećanje ANXA4 izraz ili specifične siRNA namjera ušutkati ANXA4 izraz. Nakon transfekcije, pratili smo stopu rasta AGS stanica raka želuca pomoću analiza u realnom vremenu stanica (RTCA) sustav. Stanični broj je zabilježen kao indeks stanica (CI) vrijednosti. Krivulje rasta AGS stanica su modificirani sljedeće ubacivanja. Hiperekspresija ANXA4 značajno povećava stopu rasta stanica u AGS stanica u usporedbi s kontrolnim stanicama ( P pregled i 0,001; Slika 1A), a ANXA4 obaranje značajno smanjio rast ( P pregled <0,001; Slika 1B). Ovi rezultati ukazuju na to da ANXA4 ima potencijal za promicanje proliferaciju stanica. Pregled

ANXA4 Povećava izraz membranskih proteina, RHAMM i LAMP2 pregled

Također smo ispitali razlike u ekspresiji gena između ANXA4-ekspresijom stanice i kontrolne stanice koje eksprimiraju praznim vektorom. Ispitali smo to pomoću eksona analize polju, koji nudi točniji pogled na ekspresiju gena na razini pomoću četiri sonde po eksona, u usporedbi s konvencionalnim 3 'polja [27]. Na slici S1, X pregled, -axis od rasuli parceli prikazuje intenzitet izražavanja probe mjerena u jednom eksperimentu i Y pregled os prikazuje intenzitet izražavanja sonda izmjerene u drugom eksperimentu , Ovi rezultati ukazuju na povezanost rezultata oba eksperimenta i stoga pokazuju konzistentnost između dvostrukim niza. Razinu ekspresije gena izračunati su iz mjerenih intenziteta pomoću proba kompleta. Sve u svemu, izraz 1.052 gena pokazali su se značajno razlikuje ( P izvoznici < 0,05). Između ANXA4-ekspresijom stanice i kontrolnih stanica pregled

ANXA4 je plazma membrana vezujući protein, tako da smo Predlažem da drugi plazma membranski proteini mogu biti regulirano ANXA4 i raditi zajedno kako bi se zaraziti svoje nizvodno signalizaciju. Kako bi istražili signalnu transdukciju uredjena ANXA4, istražili smo membranske proteine ​​plazme od eksona analize polja. Ovih sedam plazma membranskih proteina uočene su da imaju ≥1.5 puta promjene u stanicama ANXA4-ekspresijom (tablica S1). Među njima, receptor pokretljivosti hijaluronan posredovane ( HMMR pregled) pokazuje najveći porast u izrazu (2.4-puta, Tablica S1). Osim toga, naša prethodna studija pokazala je da je na površini stanice izraz lizosomskog povezane membranskog proteina 2 ( LAMP2 pregled), marker lizosomskog je up-regulirana ANXA4 i sudjeluje u eksocitozu (Slika S2 i File S1) , Evo, transkripcijski izraz LAMP2 Netlogu također pokazala porast ekspresije (1,8 puta, Tablica S1) ako se mjeri eksona array analizu. U ovom istraživanju, ANXA4 prekomjerno ili ušutkani (slika 2A) i zatim se analizira imuno provjeriti ekspresiju proteina RHAMM i LAMP2. ANXA4 prekomjerna ekspresija povećana ekspresija RHAMM (slika 2b) i LAMP2 (Slika 2C) i, u skladu s tim, obaranje ANXA4 izražavanja smanjena njihova razina ekspresije (Slika 2b i 2c). Pregled

raka ANXA4 Prekomjerna ekspresija regulira su povezane s Gene Expression pregled

Mi smo koristili genijalnosti Put Analiza (IPA) baze podataka za obavljanje analiza funkcija gena podataka o eksona array i otkrili da je 25 od ukupno 42 gena nisu bile pogodne za mrežne funkcije analize (≥2 puta diferencijal izraz, t pregled test, P izvoznici < 0,05) (Tablica 1). Tri funkcionalne mreže su značajno povezane s genima ANXA4 regulirano. Najviše snažno povezana mreža je rak, stanični ciklus i reproduktivni sustav bolest pregled ( P izvoznici < 0,05; Slika 3A), a na vrhu ljestvice bolesti ili poremećaja koji se rak pregled ( P pregled i 0.05; slika 3B). Bilo je 9 geni klasificirana kao gena vezanih za rak u stanicama ANXA4-ekspresijom uključujući 7 gena koji su up-regulirana u našim eksperimentima. Ovi geni su eukariotske prevođenje iniciranje faktora 4E ( EIF4E pregled), sukcinat dehidrogenaze kompleks, podjedinica C, integralni membranski protein, 15 kDa ( SDHC pregled), ciklinski ovisna kinaza 1 ( CDK1 pregled), izbrisati limfocitne leukemije 2 ( DLEU2 pregled), kromatina modifikaciju proteina 5 ( CHMP5 pregled), bezvremenski interakciji proteina ( TIPIN pregled), PDZ- obvezujući kinaze ( PBK pregled). Korionski somatomamotropinski hormona 1 (posteljice laktogen) ( CSH1 pregled) i interferon alfa 2 ( IFNA2 pregled) su dolje regulirana ANXA4. Na temelju naših rezultata, predlažemo da ANXA4 ima funkciju u poticanju proliferaciju stanica. Štoviše, smatra se CDK1 pregled i PBK pregled (slika 3B i Tablica 1) da se uključe u ANXA4 proliferacije inducira modela. Budući da aktivacija CDK1 povezana sa staničnom proliferacijom u razvoju želučani MALT limfom [28]. Međusobna aktiviranje CDK1 i PBK je prethodno opisano [29]. U ovom istraživanju, up-regulacija CDK1 Netlogu i PBK pregled promatrati u ANXA4-ekspresijom stanica je ovjeren od strane kvantitativnom realnom vremenu lančanom reakcijom polimeraze (QRT-PCR) analiza (Slika S3) . pregled

ANXA4 regulira aktivaciju AKT, CDK1 i suzbijanje p21 Netlogu

aktivacije CDK1, što je regulirano p21, inhibira G2 /M fazi uhićenje, čime se potiče mitozu i proliferaciju stanica [30 ]. Također je izvijestio da Akt blokira aktivaciju p21, što uzrokuje njegovo nakupljanje u citoplazmi, a time i promicanje proliferaciju stanica [31]. Pomoću imunoblot analize, mi smo opazili da prekomjerna ekspresija ANXA4 povećava fosforilaciju serina 473 na AKT i treonina 161 na CDK1 i smanjio ekspresiju p21 (slika 4A). Osim toga, obaranje ANXA4 ekspresije smanjen fosfo-Akt i fosfo-CDK1 i povisuje ekspresiju p21 (slika 4b). Ovi podaci ukazuju da fosfo-AKT, fosfo-CDK1 i P21 su regulirani ANXA4 i nizvodno signali ANXA4. Pregled

Ca ^{2 + posreduje ANXA4 nizvodne signalne Transdukcija pregled}

U karcinogeneze, ca ^{2+ sudjeluje u prijenosu signala uzrokuje da posreduju širok raspon bioloških procesa, uključujući invazije, proliferaciju, angiogeneze i metastaziranje [32]. To je izvijestio da je annexins može posredovati neke fiziološke mehanizme u Ca 2 + ovisna način [9]. U prethodnim istraživanjima, unutarstanični [Ca 2 +] _{i nadmorska visina je izazvana H. pylori infekcija pregled, koji, opet, se regulira ekspresiju ANXA4 [17], [33]. Kako bi se utvrdilo je li povećanje unutarstaničnog [Ca 2 +] i posreduje prijenos daljnjih signala iz ANXA4, AGS stanice su tretirane s ionomicinom. Ionomicina je Ca 2+ ionofora i doda u medij za kulturu u našem modelu AGS stanica inducirati produženo povišenje unutarstanične [Ca 2 +] i [34]. Proteinski izrazi ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT i fosfo-CDK1 mjerene su analizom imunoblot (slika 5A). Slično našim promatranjima s ANXA4 prekomjernom ekspresijom, povećana [Ca 2 +] i razine značajno je povećana ekspresija RHAMM ( P izvoznici < 0,01) i fosfo-AKT (Ser 473) ( P izvoznici < 0,05) i značajno dolje regulira ekspresiju p21 ( P izvoznici < 0,01) (slika 5B). aktivacija CDK1 neznatno je povećan [Ca 2 +] i nadmorska visina. Međutim, povišen [Ca 2 +] I razina nije imao učinka na ekspresiju ANXA4 i LAMP2. U našem prethodnom istraživanju, ANXA4 i LAMP2 može lokalizirati na plazma membrane nakon H. pylori pregled infekcija intracelularne [Ca 2 +] i nadmorska visina (Slika S4 i File S1). Ovi rezultati ukazuju na to da Ca 2 + samo mijenja unutarstanični položaj ANXA4 i LAMP2, ali ne regulira njihov izričaj. Pregled}}

Rasprava pregled

U istraživanju raka, identifikacija biomarkera i naknadno pojašnjenje njihovih mehanizmu odnosa s tumorogenezom može doprinijeti razvoju korisnih dijagnostičke alate i rezultirati optimalnim terapijske strategije. U posljednje vrijeme, sve više i više studije su pokazale da proteini biomarker kandidati u annexins obitelji su potencijalno značajnu ulogu u progresiji raznih vrsta raka; npr, ANXA1 za jasan stanica raka bubrega, ANXA2 raka želuca i raka debelog crijeva, ANXA4 za rak debelog crijeva, ANXA8 za rak dojke, ANXA10 za hepatocelularnog karcinoma, ANXA11 za rak jajnika i rak debelog crijeva [35]. ANXA4, član annexins obitelji uočeno je da dolazi do preekspresije u želučanim tumorskih tkiva, a koji je povezan s rakom H želuca. pylori pregled infekcija [17]. Osim toga, još jedan član obitelji annexins, ANXA2, također je uočeno da se pojačana ekspresija u karcinomu želuca i odnosi se na slabom kliničkom ishod, što potencijalno prognostički faktori [36]. Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju na uključenost ANXA4 u nastanku tumora; Međutim, njegov točan mehanizam u procesu ostaje nejasno. Kako bi se dodatno procijeniti staničnu funkciju ANXA4 u progresiji karcinoma želuca, istraživali smo vezu između dva i nakon toga je pokazao da ANXA4 mogu regulirati gena povezana s rakom i propagiraju put do stanične proliferacije. Pregled

ova studija, otkrili smo da su karcinogeneze povezane proteini kao što su RHAMM, Akt, p21, PBK i CDK1 regulirana prekomjerna ekspresija ANXA4. Shematski prikaz ANXA4 induciranih nizvodno signala koji se odnose na proliferaciju stanica je prikazana na slici 6. HMMR pregled (RHAMM) je onkogena koji je izraženo u nekoliko vrsta raka, uključujući rak želuca, te je uključena u mnoge stanične procesi, kao što su stanične signalizacije, staničnom proliferacijom i tumorigenezu [37], [38]. pregled

objavljeno je da RHAMM inducira RAS signalnu kaskadu i aktivira Akt [39]. RAS signalne kaskade prenosi nizvodne signale aktivacijom fosfo-Akt preko fosfoinozitid-3-kinaze. Aktivacija AKT je također bio prijavljen kao marker za želučane progresiju raka [40]. Mi smo ranije izvijestili da je H. pylori pregled infekcija povezana s ANXA4 prekomjernom ekspresijom [17]. H. pylori pregled može isporučiti citotoksin povezana gen (CAGA) u stanicu domaćina, što rezultira aktivacijom AKT, a čime se potiče proliferaciju stanica [41]. U smislu preživljavanja stanica, AKT potiskuje apoptozu stimuliranjem NF-kB [42]. Nedavna istraživanja su također pokazala da ANXA4 interakciju s P105 (s NF-kB p50 prekursora proteina) i potiskuje transkripcijsku aktivnost NF-kB da se inducira anti-apoptotički djelovanje [25]. Uzeti zajedno, ova opažanja upućuju na to da ANXA4 igra važnu ulogu u preživljavanju stanica i rast stanica.

CDK1-ciklin B1 kompleksi regulaciju staničnog ciklusa u G2 /M fazi i također je uključen u promoviranje tumorogenezi [43]. Nedavna studija pokazala je da povećana ekspresija CDK1 je povezana s razvitkom iz H. pylori
-associated gastritis do limfoma limfnog tkiva povezanog sa sluznicom [28]. U ovom istraživanju, CDK1 aktivacija je up-regulirana ANXA4. Ovi događaji ukazuju da ANXA4 može posredovati nizvodno signala, što dovodi do nastanka tumora u bolesnika s rakom želuca s H. pylori pregled infekcija. pregled

Uz svoj angažman u progresiju raka, ANXA4 je također bio povezan s stečene kemijska otpornost na citostatike [44], [45], [46]. U staničnoj liniji paklitaksel otporan (H460 /T800) ANXA4 ekspresija kojeg je povećana i lokalizirana u jezgri [44]. Karcinomom čistom stanica stanica jajnika i mezotelioma, ANXA4 ekspresija je povišena a povezane s rezistencijom na liječenje karboplatinu, a smatra se biomarker osjetljivosti na cisplatin [45], [46]. Štoviše, ANXA4 intracelularni Ca ^{2+ senzor, i Ca 2+ igra važnu ulogu u neurotoksičnosti i zatajenja srca [47], [48]. Nedavne studije pokazale su da je povećana količina ANXA4 nije samo povezana s rakom, ali i Alzheimerove bolesti, otkazivanje srca i stanica lezije uzrokovane etanolu [49], [50], [51]. Pregled}

Ca ^{2+ glasnik sustav je također potrebna za proces stanične proliferacije i može regulirati stanični ciklus [52], [53]. To je izvijestio da je Ca 2 + mogu aktivirati AKT put za promicanje preživljavanja stanica [54]. U ovom istraživanju, otkrili smo da je izraz RHAMM, fosfo-AKT i suzbijanje p21 je značajno povećana [Ca 2 +] _{i visini (slika 5). H. pylori pregled infekcija povezana s ANXA4 prekomjernom ekspresijom i unutarstanične [Ca 2 +] i nadmorska visina (Slika S4 i File S1) [17], [33]. Ovi rezultati pokazuju da je H. pylori pregled, infekcija može izazvati neke nizvodno signalizaciju ANXA4 poticanjem unutarstaničnih [Ca 2 +] i nadmorska visina. Ipak detalj mehanizam u procesu može biti složen i ostaje nejasno. To bi moglo omogućiti rasvjetljavanje želučane tumorigenezi procesa koji leže H. pylori
stimulaciju. Uzeti zajedno, ovi dokazi sugeriraju da Ca 2 + može pomoći ANXA4 za prijenose signalizaciju i promicati tumorigenezi u želučanim bolesnika s H. pylori pregled infekcija. pregled}}

U zaključku, naši rezultati pokazuju da je utišavanje od ANXA4 smanjuje proliferaciju epitelnih stanica, dok je pojačana ekspresija povećava proliferaciju. Nadalje, ANXA4 izaziva nizvodno signale koje promiču rast stanica. Pretpostavljamo da su ti nizvodno signali i aktivacija diobe stanice domaćina mogu biti patogeni događanja u H. pylori
pobuđenog karcinogeneze. U kliničkog liječenja, AKT, p21 i CDK1 korišteni su kao cilj lijeka protiv karcinoma. inhibitor AKT, Perifosine, oralna sredstvo protiv raka i ima anti-proliferacije aktivnost na nekoliko tumorskih modela [55], [56], [57]. Paklitaksel (Taxol) i vinkristin može izazvati i povećati ekspresiju p21 smanjiti G2 /M uhićenje i blok proliferaciju stanica [58], [59], [60], [61]. Flavopiridol je inhibitor nekoliko CDK uključujući CDK1 da inducira apoptozu i anti-angiogenezu [62]. Ove studije pokazuju da je visina ANXA4 u bolesnika može se smatrati metom lijek za želučane terapije protiv raka. Korištenje više lijekova u kombinaciji može pružiti više učinkovit tretman za blokiranje signala na putu. Uzeti zajedno, ova studija mogla pružiti nove uvide u razvoj strategija liječenja raka želuca.

Materijali i metode

stanične linije i uvjetima kulture

Ljudski želudac adenokarcinoma AGS stanice (CRL-1739, ATCC) uzgojene su u 90% 1640 mediju (Biological Industries, Bet-Haemek, Izrael), koji je dopunjen sa 1% penicilina /streptomicina i 10% fetalnog goveđeg seruma (Biološki Industries, Bet-Haemek, Izrael) , Stanice su uzgojene na 37 ° C u kontroliranoj vlažnoj atmosferi u inkubatoru koji sadrži 5% CO _{2. Pregled}

plazmida i Transfekcija pregled

pune duljine ANXA4 pregled bio pojačati pomoću PCR korištenjem par početnica ANXA4 pregled F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') i ANXA4 pregled R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), a produkt amplifikacije je bila umetnuta u Hindlll /EcoRI pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4 pregled specifičnih siRNA i negativna kontrola Stealth siRNA (Stealth RNAi ™) su kupljeni od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Stanice su uzgajane u pločicama sa šest jamica premazanim ili poklopcima za 24 h. Stanice su zatim bile transfecirane sa pCDNA 3.1 (+) / ANXA4 pregled (8 ug u šest jažica, 0.4 ug /mL u 96 jažica E-ploče) ili ANXA4 pregled siRNA (100 pmol u šest jažica 10 pmol za 96 jažica E-ploče) primjenom lipofektamina 2000 (Invitrogen), u skladu s uputama proizvođača. Djelotvornost ekspresije vektora i siRNA transfekcije analizirana je pomoću imunoblota. Nakon transfekcije za 48 h, diferencijalna ekspresija proteina ili gena je otkriven pregled

Antitijela

monoklonska antitijela miša korišteni u ovom istraživanju bile su kako slijedi:. CDK1 34. stranici (sc-51.578) od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); LAMP2 (ab25631) i RHAMM (ab67003) iz Abcam (Cambridge, UK); te α-tubulina (T5168) od Sigme (Dorset, UK). Kunić poliklonska antitijela su kako slijedi: ANXA4 (sc-28.827), p21 (sc-397), te pCDK1 34. stranici (Thr 161, SC-101.654) od Santa Cruz Biotechnology; i AKT (9272) i pakt (Ser473, 9271S). od Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) pregled

Imunobloting pregled

Stanični lizati pripremljeni su iz AGS stanicama koje su prijelazno transficirane s izraz vektori pcDNA 3.1 (+) / ANXA4 pregled (8 ug) ili ANXA4 pregled siRNA (100 pmol). Utvrditi razlike u ekspresiji proteina pod uvjetima visoke intracelularne [Ca ^{2 +] _{i, ionomicin (5 uM), dodan je u stanicama za 1 h. Proučiti učinke inhibicije AKT fosforilacije, stanice su izgladnjivane tijekom 1,5 h nakon 48-h transfekcije i pomiješa se s 5 uM inhibitora AKT VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) tijekom 1 sata. Uzorci su razdvojeni sa 10% SDS-PAGE i zatim se prenosi na polivinilidenfluorid (PVDF) membranu (Millipore, Billerica, MA, USA). Nakon blokiranja u 5% nemasnog mlijeka i tris-puferiranoj fiziološkoj otopini (TBS) koja sadrži 0.1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi s blagim potresivanjem, primijenjeni su sljedeći Primarna antitijela: anti-ANXA4 ( 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-pakt (Ser473, 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500) i anti-RHAMM antitijelo (1:400). Membrane su inkubirane sa sekundarnim kozjim anti-mišjim konjugiranim IgG protutijela (Sigma) ili kozjim anti-zečjim IgG konjugiranim (Rockland, gilbertsville, PA), redom. a-tubulin antitijela (1:4000) je korišten kao internom kontrolom. Imunobugačenja razvijali su poboljšane chemiluminiscence (ECL) Otkrivanje kit (Millipore) i vizualizirati na X-ray filmova. Intenzitet promatranih vrpci je normalizirana na intenzitetu α-tubulina sastava. Denzitometrijska analiza provedena je pomoću Kodak 1-D analiza slike softver verzije 3.6 (Eastman Kodak, London, UK). Pregled}}

egzona Array Križanje i analiza pregled

Kako bi proučili downstream gene ANXA4, usporedili smo profila genske ekspresije između stanice transficirane s pcDNA3.1 (+) / ANXA4 pregled i kontrolnim stanicama koje su transfektirane s praznim vektorom pomoću eksona niz. Ukupna stanična RNK je ekstrahirana korištenjem TRIzol® reagensa (Invitrogen), te je čistoća RNA potvrđena spektrofotometrijski (omjer A260 /A280) te kapilarnom elektroforezom (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Obrada RNA i hibridizacija su izvedeni primjenom Affymetrix Human egzona 1.0 ST polja (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) u skladu s uputama proizvođača. Svaki niz ima 28,869 dobro obilježene gena s 764,885 različitih sondi. Niz sadrži oko 26 sondi za svaki gen. Affymetrix sonda Postavlja informacije su prikazane na NetAffx web stranice (http://www.affymetrix.com) [63]. Analize mikropolja (n = 2 po skupini) izvedena je pomoću Partek Genomics Suite verzija 6.5 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Sirovi podaci (cel datoteke) su normalizirane pomoću robusne čipova usrednjavanje (RMA) algoritam i analizirani pomoću t
ispitivanja. Analiza funkcije i biološkog mehanizma u različito izraženim genima je izvedena pomoću genijalnosti Put softver za analizu (IPA) verzija 7.5; rezultat od 3 ili iznad se smatra statistički značajna ( P izvoznici < 0,01) za obilježavanje informacije. Mi smo dostavila podatke polja za GEO bazu podataka, a broj serija zapis GSE33620. Pregled

Kvantitativna Real-time PCR (QRT-PCR) pregled

eksona array Podaci dobiveni pomoću Partek softver i baza podataka IPA je potvrdila QRT-PCR. RNA je izolirana iz AGS stanica korištenjem TRIzol® reagensa (Invitrogen) i RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema naputku proizvođača. Prvog lanca cDNA sintetiziran je iz ukupne mRNA uporabom reverzne transkripcije kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primer (tablica S2) su izrađeni pomoću DNAStar software (DNAStar, Inc., Madison, WI, USA) i PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Genska ekspresija je mjerena pomoću Bio-Rad iQ5 u realnom vremenu sustav detekcije PCR s SYBR Green Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), a normalizirana je GAPDH izražavanja. Pregled

Test proliferacije stanica pregled

AGS stanice su napunjene u svaku jamicu mikrotitarske pločice E-16-jažica. Svaki dobro sadržane mikroelektroničkih senzor polja u podnožju otkriti indeks stanica (CI). Za transfekcijske eksperimente, nakon inkubacije 24 h, AGS stanice su transfektirane s ekspresijskim vektorima ili iRNK za 6 h i prati za ukupno 84 sati. E-ploča je stavljena u Real-Time stanica Analyzer (RTCA) sustava i inkubiraju u inkubatoru koji sadrži 5% CO _{2 pri 37 ° C. Razina stanične proliferacije je prikazan kao CI, koji se temeljio na električnoj impedancije izmjerena pomoću xCELLigence sustav (Roche, Mannheim, Njemačka). Pregled}

Statistička analiza pregled

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Razlika između nezavisnih skupina su analizirani pomoću dvosmjernog Student t
test. Podaci dobiveni iz pokusa proliferacije stanica su analizirani primjenom dva uzorka Kolmogorov-Smirnovljevim testom. P pregled vrijednost manja od 0,05 pokazuje statističku značajnost. Pregled

popratne podatke
Slika S1. pregled Scatter plot sonde intenziteta u ponovljenom eksperimentima eksona polje. Sonde za intenziteti dva ponovljenih eksperimenata su prikazani odvojeno na X pregled, -axis i Y pregled -axis. Svaka sonda je zastupao jedne točke u rasuli parceli. Ovi rezultati su pokazali konzistentnost u našim pokusima duplikat eksona array pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0044615.s001 pregled (TIF) pregled Slika S2. pregled ANXA4 sudjeluje u membrane popravak plazma zapošljavanjem ekzocitotičko membrane. Predstavnik protočnom citometrijom analiza pokazuje prisutnost LAMP2 u H. pylori
-infected stanice. (A) ANXA4-ekspresijom stanice su u usporedbi s (B) ANXA4 pregled -silenced stanice. Rezultati pokazuju da ANXA4 potiče ekspresiju LAMP2 na površini H. pylori
-infected stanice. ANXA4 prekomjerna ekspresija, Over-ANXA4; Kontrola siRNA, siControl; . ANXA4 pregled siRNA, si ANXA4
doi: 10,1371 /journal.pone.0044615.s002 pregled (TIF) pregled slika S3. pregled ANXA4 izaziva nizvodno prijenosu signala. QRT-PCR od ANXA4-ekspresijom AGS stanice (crne kutije), provedena je kako bi potvrdili podatke dobivene od eksona polja (sive kutije). Razine relativna mRNA CDK1 Netlogu i PBK pregled mjerene su i normalizira na GAPDH pregled razine mRNA pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF) pregled slika S4. pregled intracelularne Ca ^{2 + nadmorska visina, ANXA4 i LAMP2 lokalizaciju na H. pylori
infekcije. (A) H. pylori pregled -infected AGS stanice su napunjene sa fluo-3 /AM pratiti intracelularne Ca 2+ razine protočnom citometrijom. (B) Dinamički lokalizacija ANXA4 u žive stanice. Real-time fluorescencije slika prikazuje lokalizaciju EGFP-ANXA4 u h. pylori pregled -infected AGS i SC-M1 stanice (žuta strelica) obojene s Hoechst 33258. (C) LAMP2 fluorescencije na površini H.}

• PLoS ONE: Utjecaj XPD /ERCC2 polimorfizama na rak želuca rizik među različitih nacionalnosti: sustavni pregled i meta-Analysis
• PLoS ONE: izlučenog proteina kisela i Bogata cistein (SPARC) slabi angiogenezu Down-reguliranje ekspresije VEGF i MMP-7 u želučanom Cancer