PLoS One: feltárása molekuláris mechanizmusa gyomorrák Marker annexin A4 rákos sejtek szaporodásának exon mátrixok

absztrakt katalógusa

A gyomorrák egy rosszindulatú betegség, amely abból ered, gyomornyálkahártya. A potenciális biomarker gyomorrák fehérje annexin A4 (ANXA4), intracelluláris Ca ^{2 + szenzor. ANXA4 elsősorban található hámsejtek, és ismert, hogy részt vesznek a különböző biológiai folyamatokat, beleértve az apoptózis, a sejtciklus és antikoaguláns. Tekintetében, hogy a rák, ANXA4-túlexpressziója volt megfigyelhető rákok különböző eredetű, beleértve a gyomor tumorok társított Helicobacter pylori
fertőzés. H. pylori katalógusa indukál ANXA4 kifejezés és az intracelluláris [Ca 2 +] _{i-emelési, és fontos rizikófaktora a rákkeltő, amelynek eredménye a gyomorrák. Annak ellenére, hogy ez a korreláció, a szerepe ANXA4 előrehaladásában gyomor tumorok továbbra is tisztázatlan. Ebben a vizsgálatban, megvizsgáltuk, hogy a ANXA4 közvetíthet az arány a sejtek növekedését, és hogy ANXA4 downstream jeleket vesz részt tumorigenezis. Megfigyelését követően üteme sejtnövekedés valós időben, megállapítottuk, hogy ANXA4 elősegíti a sejtek szaporodását. A transzkripciós gén profilja ANXA4 overexpresszáló sejtek mértük, és elemeztük a humán exon tömbök. Ebből a transzkripciós gén adatok megmutatjuk, hogy overexpressziója ANXA4 szabályozza a gének, amelyekről ismert, hogy kapcsolatban áll a rák, például az aktiválási hialuronán által közvetített motilitás receptor (RHAMM), Akt, és ciklin-dependens kináz 1 (CDK1), valamint elnyomása p21. Az ilyen gének szabályozásában további indukálja a rákos sejtek szaporodását. Azt is megállapították, Ca 2 + lehetne szabályozni az átviteli downstream jelek ANXA4. Azt javasoljuk, hogy ANXA4 kiváltja egy jelsorozatot, ami fokozott hámsejt proliferáció, végül előmozdítása kialakulásában. Ezek az eredmények arra tehát olyan új betekintést gyomorrák terápia, elsősorban a módosításával ANXA4 tevékenység. Katalógusa}}

Citation: Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) feltárása molekuláris mechanizmusa gyomorrák Marker annexin A4 a rákos sejtek szaporodásának exon tömbök. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10,1371 /journal.pone.0044615 katalógusa

Vágó: Eric Y. Chuang, Tajvani Nemzeti Egyetem, Tajvan katalógusa

Beérkezett: június 6, 2012; Elfogadva: augusztus 6, 2012; Megjelent: szeptember 7, 2012 katalógusa

Copyright: © Lin et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a Nemzeti Tudományos Tanács Tajvan (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), a tajvani Nemzeti Egyetem élvonalbeli Irányító kutatási projekt (10R70602C3) és a Nemzeti egészségügyi Intézet, Tajvan (NHRIEX100-9819PI). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a második vezető oka a rákos halálesetek világszerte, és azt mutatja, nagy gyakorisága miatt az ázsiai populációk. Bár az előfordulási gyomorrák csökken, a teljes 5 éves túlélés aránya továbbra is alacsony [1]. Meghatározó a leghatékonyabb gyomorrák terápiák és a fejlődő korai stádiumú diagnosztikai eszközök fontos stratégiákat érintő klinikai kimenetelt. Az átfogó vizsgálat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek hátterében a gyomor carcinogenesis segítséget nyújthat a fejlődő hasznos terápiás stratégiák a betegség. Katalógusa

Helicobacter pylori katalógusa egy gyomor kórokozó és az uralkodó etiológiai faktort gyomor karcinogenezis . Mintegy fele a világ népességének fertőzött H. pylori katalógusa, és több mint 60% -a gyomorrákos betegek kórtörténetében H. pylori
-positivity [2], [3], [4]. A legújabb vizsgálatok azt mutatták, hogy a H. pylori
indukálhatja mind az elterjedése a gyomor rákos sejteket, és a nyálkahártya gyulladásos válaszokat [5], [6]. Így annak érdekében, hogy vizsgálja meg a molekuláris mechanizmusok mögöttes gyomor carcinogenesis, meg kell vizsgálni a szerepe és mechanizmusai H. pylori
a gyomorrák kialakulásában. katalógusa

annexinek mindenütt expresszálódik a legtöbb élőlény, beleértve az állatokat, növényeket, gombákat és egysejtűek. Ez együtt jár a különféle fiziológiai funkciókat [7]. Ennek alapján a szerkezet a saját konzervált mag domént, annexinek kell tekinteni, intracelluláris Ca ^{2+ érzékelők és foszfolipid-kötő fehérjék. Ők már megfigyelhető, hogy ösztönözze a membrán-kereskedelem és a hordozó aggregációs válaszul a megnövekedett intracelluláris [Ca 2 +] _{i [8], [9]. Az emberben, annexinek már megfigyelték, hogy egy sor sejtfunkciók, hogy már rejlő citoszkeletális szervezet, exocitózis, endocitózis, ioncsatorna-szabályozás, a gyulladás, az apoptózis, fibrinolízis és koaguláció [8]. Annexinek is tekinthető, hogy részt vesz a rák, a cukorbetegség és a gyulladást. [10] A közelmúltban egyre több tanulmány kiderült, hogy gyanúba bevonása annexinek a karcinogenezis, valamint elősegíti a proliferáció [11], [12], invázió [13], valamint az áttétek [14], [15]. Azonban a kapcsolat minden tagja a annexinek család rák nem jellemezték.}}

Annexin A4 (ANXA4) egy tagja a annexinek család társított az emésztőrendszerben. Ez jól kifejezve hámsejtekben [16]. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a ANXA4 kell tekinteni egy potenciális gyomor biomarker alapuló azonosítás szövetekben gyomorrák betegek proteomikai vizsgálatokban. Up-szabályozása ANXA4 kifejezetten megtalálható H. pylori
-fertőzött tumor szövetekben [17], [18]. Továbbá, számos tanulmány arról számolt be kapcsolatát ANXA4 kifejezés és a rák. Ezt a kapcsolatot számoltak be hasnyálmirigy adenokarcinóma [19], világos sejtes karcinómája petefészek [20], [21], a vese-karcinóma [22], a kolorektális karcinóma [23] és a prosztatarák [24]. A vesesejtes karcinóma, up-regulációját ANXA4 részt vesz terjesztése tumorsejtek, elősegítve a sejtek migrációját [22]. Kolorektális rákos betegek, magas expresszióját ANXA4 járt egy alacsony túlélési ráta és számoltak mint potenciális biomarker tumor diagnózis [23]. Amennyiben a sejtműködés, ANXA4 idézhet kalcium jelátvitel, antikoaguláns és ellenállás apoptózis [25], [26]. Ezek az események azt mutatják, hogy ANXA4 van daganatkeltő funkció szabályozásában sejt növekedési üteme. Katalógusa

Ebben a tanulmányban azt hivatott megvilágítani a molekuláris mechanizmust, amely ANXA4 indukál kialakulásában. Ehhez figyeltük a növekedési ütem a gyomor rákos sejteket különböző expressziós szinteket ANXA4. Azt is értékelték a transzkripciós expressziós profilját ANXA4 overexpresszáló sejtek és használt exon tömbök elemzésére jelátviteli a ANXA4. Ezekből a tanulmányokból azonosítottunk 9 rákkal kapcsolatos gének ANXA4 downstream jelek Ingenuity Út Analysis (IPA) adatbázisban. Továbbá, azt bizonyította, hogy ANXA4 szabályozza az aktiválás RHAMM, AKT, CDK1 és elnyomása p21, és ezért javasolta ANXA4 szabályozott sejtburjánzás jellemző. Katalógusa

Eredmények katalógusa

A aktiválása ANXA4 Elősegíti sejt proliferáció katalógusa

korábban már beszámoltunk, hogy ANXA4 túlzottan kifejeződik H. pylori
fertőzött gyomor tumorszövetben [17]. Ahhoz, hogy tovább vizsgálják a kapcsolat ANXA4 és karcinogenitás célunk volt meghatározni, hogy ANXA4 elősegíti a sejtek szaporodását. Sejteket akár teljes hosszúságú ANXA4 katalógusa cDNS növelése ANXA4 kifejezés vagy specifikus siRNS célja, hogy elhallgattassa ANXA4 kifejezést. A transzfekciót követően figyeltük a növekedési ütem a AGS gyomorrák-sejteken, a valós idejű sejt analízis (RTCA) rendszer. Sejtek számát rögzítettük a sejt index (CI) értékét. A növekedési görbék AGS sejteket módosított transzfekció után. A túlzott mértékű expressziója ANXA4 jelentősen növelte a sejt növekedési ráta AGS sejtekben, mint a kontroll sejtek ( p
<0,001; 1A ábra), mivel ANXA4 kiütése jelentősen csökkent a növekedés üteme ( p
<0,001; 1B ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy ANXA4 potenciálisan elősegíti a sejtek szaporodását. Katalógusa

ANXA4 Növeli kifejezése a membrán fehérjék, RHAMM és Lamp2 katalógusa

Azt is megvizsgálták a különbség génexpresszió között ANXA4 overexpresszáló sejtek és kontroll expresszáló sejtek egy üres vektor. Megvizsgáltuk ezt exon tömb elemzése, mely egy pontosabb képet gén szintű kifejeződését segítségével négy szondát egy exon, összehasonlítva a hagyományos 3 'tömbök [27]. Ábra S1, a X katalógusa tengelyen a szórásdiagramon megjeleníti az intenzitásuk szonda kifejezés mért egy kísérletről, és a Y- katalógusa tengely jeleníti intenzitását szonda kifejezés mért a másik kísérletben . Ezek az eredmények azt mutatják, a korreláció eredményei mindkét kísérlet, és ezért jelez közötti összhang a duplikált microarray. A gén expressziós szintje számított az mért intenzitások keresztül szonda készletek. Összességében, a kifejezés a 1052 gént találtunk, hogy szignifikánsan eltérő ( P
< 0,05) között ANXA4 overexpresszáló sejtek és kontroll sejtek.

ANXA4 egy plazma membrán kötő fehérje, ezért javasolja, hogy más plazmamembrán fehérjék lehet szabályozni ANXA4 és együtt transzdukálhatósága downstream jelátvitelt. Hogy vizsgálja meg a jelátviteli transzdukciós szabályozza ANXA4 megvizsgáltuk plazmamembrán fehérjék exon tömb elemzése. Negyvenhét plazmamembrán fehérjék figyeltek, hogy egy ≥1.5-szoros változást ANXA4 overexpresszáló sejtek (táblázat S1). Ezek közül hialuronánt által közvetített motilitás receptor ( HMMR
) mutatta a legnagyobb növekedést a kifejezés (2,4-szeres; táblázat S1). Sőt, a korábbi tanulmány kimutatta, hogy a sejtfelszíni expresszióját lizoszomális-asszociált membrán protein 2 ( Lamp2
), egy lizoszomális marker, up-által szabályozott ANXA4 és részt vesz a exocitózis (ábra S2 és a File S1) . Itt, a transzkripciós kifejezése a Lamp2 katalógusa is növekedést mutatott kifejezése (1,8-szeres táblázat S1) mérve exon array analízis. Ebben a vizsgálatban, ANXA4 volt overexpresszált vagy elhallgattatott (2A ábra), majd elemezzük immunblot, hogy ellenőrizze a fehérje expresszióját RHAMM és Lamp2. ANXA4 túltermelése fokozott expressziója RHAMM (2B) és Lamp2 (2C ábra), és ezzel összhangban ez a kiütése ANXA4 expresszió csökkent az expressziós szintje (2B és 2C). Katalógusa

ANXA4 túltermelése szabályozza Rák val kapcsolatos Gene Expression katalógusa

Mi használtuk Ingenuity Út Analysis (IPA) adatbázisban, hogy végre egy olyan gén funkciója elemzése exon tömb adatokat, és megállapította, hogy 25 a 42 gének voltak jogosultak a hálózati funkció analízis (≥2-szeres eltérés kifejezése, t katalógusa vizsgálat, P katalógusa < 0,05) (1. táblázat). Három funkcionális hálózatok jelentős összefüggést mutattak ANXA4 szabályozott géneket. A legerősebben a kapcsolódó hálózat volt a rák, a sejtciklus és a reproduktív rendszer betegség katalógusa ( P katalógusa < 0,05; 3A), valamint a legjobban betegségek vagy rendellenességek ben rák katalógusa ( P katalógusa < 0,05; 3B). Voltak 9 gén besorolt ​​rákkal összefüggő gének ANXA4 overexpresszáló sejtek köztük 7 géneket, amelyeket fel szabályozott kísérleteinkben. Ezek a gének eukarióta transzlációs iniciációs faktor 4E ( EIF4E
), szukcinát-dehidrogenáz komplex, alegység C, integrális membránfehérje, 15 kDa ( SDHC
), a ciklin-dependens kináz 1 ( CDK1 katalógusa), törölni limfoid leukémia 2 ( dLEU2 katalógusa), kromatin módosító fehérje 5 ( CHMP5 katalógusa), időtlen kölcsönható fehérje ( TIPIN katalógusa), PDZ- kötő kináz ( PBK katalógusa). Chorionic somatomammotropin hormon 1 (piacentaiaktogén) ( CSH1 katalógusa) és interferon alfa-2 ( IFNA2 katalógusa) arra leszabályozott által ANXA4. Eredményeink alapján azt javasoljuk, hogy ANXA4 funkcióval bír indukáló sejtburjánzást. Sőt, CDK1 katalógusa és PBK katalógusa (3B és 1. táblázat) tekintették, hogy részt vegyen a ANXA4 proliferációs indukáló modell. Mivel CDK1 aktiválás társul a sejtproliferációt a fejlődő gyomor MALT lymphoma [28]. A kölcsönös aktiválása CDK1 és PBK már korábban is beszámoltak [29]. Ebben a vizsgálatban a fel-szabályozása CDK1 katalógusa és PBK katalógusa megfigyelt ANXA4 overexpresszáló sejtek által hitelesített kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qRT-PCR) elemzés (S3 kép) .

ANXA4 szabályozza az aktiválása az Akt aktiválását, CDK1 és a visszaszorításáról P21

CDK1 aktiválás, amely szabályozza a p21, gátolja a G2 /M fázis leállását, ezáltal elősegítve mitózis és a sejt proliferáció [30 ]. Azt is leírták, hogy az Akt blokkolja az aktiváló p21, ami annak felhalmozódását a citoplazmában, és következésképpen elősegíti a sejtek proliferációját [31]. Használata immunoblot analízissel azt tapasztaltuk, hogy overexpressziója ANXA4 növelte a foszforiláció szerin 473 az Akt és a treonin 161-CDK1 és a csökkent expressziója P21 (4a ábra). Ezen túlmenően, a kiütése ANXA4 expresszió csökkent foszfo-Akt és foszfo-CDK1 és fokozott expressziója P21 (4b ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy foszforilált Akt, foszfo-CDK1 és p21 által szabályozott ANXA4 és downstream jelek ANXA4. Katalógusa

Ca ^{2 + közvetíti ANXA4 jelátviteli transzdukciós katalógusa}

A karcinogenezis Ca ^{2+ vesz részt okoz jelátviteli közvetíteni sokféle biológiai folyamatban, beleértve a invázió, proliferáció, az angiogenezist és a metasztázist [32]. Leírták, hogy az annexinek közvetíteni képes néhány fiziológiai mechanizmusokat a Ca 2 + -függő módon [9]. A korábbi vizsgálatok, intracelluláris [Ca 2 +] _{i emelkedést indukált H. pylori
fertőzés, amely viszont, up-szabályozza ANXA4 kifejezés [17], [33]. Annak meghatározására, hogy a növekedés az intracelluláris [Ca 2 +] i közvetíti az átviteli downstream jelek ANXA4, AGS sejteket kezeltük ionomicin. Ionomicin egy Ca 2+ ionofor és adtunk a táptalaj a mi AGS sejt modell indukálni tartós Az intracelluláris [Ca 2 +] i [34]. A fehérje kifejezései ANXA4, Lamp2, RHAMM, p21, foszforilált AKT és foszforilált CDK1 mértük immunfoltelemzéssel (5A ábra). Hasonló a mi megfigyeléseket ANXA4 túltermelése fokozott [Ca 2 +] i szint jelentősen felfelé szabályozott kifejeződését RHAMM ( P katalógusa < 0,01) és foszfor-AKT (Ser 473) ( P katalógusa < 0,05), és szignifikánsan leszabályozott expressziója p21 ( P katalógusa < 0,01) (5B). CDK1 aktiválás kismértékben növelte az [Ca 2 +] i-emelési. Azonban, a megemelkedett [Ca 2 +] I szintje nem volt hatása a kifejezés a ANXA4 és Lamp2. Korábbi vizsgálatunkban, ANXA4 és Lamp2 lehet lokalizálni plazmamembrán után H. pylori fertőzés katalógusa intracelluláris [Ca 2 +] i-emelési (ábra S4 és a File S1). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Ca 2+ csak megváltoztatja intracelluláris helyét ANXA4 és Lamp2, de nem szabályozza a kifejezés. Katalógusa}}

Vita katalógusa

A rákkutatás azonosítása biomarkerek és utólagos tisztázását azok mechanikus kapcsolatok tumorogenezisben is hozzájárulnak a hasznos diagnosztikai eszközök és az eredmény optimális terápiás stratégiák. A közelmúltban egyre több tanulmányok kimutatták, hogy a biomarker jelölt fehérjéket a annexinek család potenciálisan műszeres progressziójában különféle rákok; például ANXA1 számára világos sejtes veserák, ANXA2 gyomorrák és végbélrák, ANXA4 bélrák, ANXA8 emlőrák, ANXA10 hepatocelluláris rák, ANXA11 a petefészekrák és a vastagbélrák [35]. ANXA4, tagja a annexinek család, Megfigyelték, hogy túl expresszálódik gyomor tumor szövetekben, és szintén kapcsolatban van a gyomorrák kapcsolatos H. pylori fertőzés katalógusa [17]. Ezen kívül egy másik annexinek családtag, ANXA2, is megfigyelték, hogy túl expresszálódik gyomorrák és kapcsolatban van a rossz klinikai eredmény, így egy potenciális prognosztikai tényező [36]. Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, bevonása ANXA4 a tumorigenezisben; Azonban a pontos mechanizmus, a folyamat még nem tisztázott. Annak érdekében, hogy tovább értékeljük a sejtműködés a ANXA4 progressziójában gyomorrák, feltártuk a kapcsolat a kettő között, és ezt követően kimutatták, hogy ANXA4 szabályozhatják a rákkal kapcsolatos gének és hirdetik az utat sejtburjánzást. Katalógusa

a jelen vizsgálatban azt találtuk, hogy a karcinogenezis-asszociált proteinek, mint RHAMM, Akt, P21, PBK, és CDK1 szabályozza a overexpressziója ANXA4. Sematikus ábrázolása ANXA4 kiváltott downstream jelek kapcsolódó sejtproliferáció 6. ábrán mutatjuk be HMMR katalógusa (RHAMM) egy onkogén, amely overexpresszióját számos rákos megbetegedések, beleértve a gyomorrák, és szerepet játszik számos celluláris folyamatok, mint például a cell Signaling, a sejtproliferációt, és a tumorgenezis [37], [38].

leírták, hogy RHAMM indukálja a RAS jelátviteli kaszkád és aktiválja AKT [39]. A RAS jelátviteli kaszkád átalakítja lefelé haladó jelek aktiválásával foszforilált AKT keresztül foszfatidil-3-kinázok. Ez az aktiválás az AKT is leírták, mint a marker a gyomorrák progressziója [40]. Korábban már beszámoltunk, hogy a H. pylori
fertőzés társul ANXA4 túlexpressziója [17]. H. pylori
nem lehet megvalósítani a citotoxin asszociált gén A (CagA) bejuttatására a gazdasejtekbe, ami AKT aktiválását, és ezáltal elősegíti a sejtek proliferációját [41]. Ami a sejt túlélését, AKT elnyomja apoptózis stimulálásával NF-kB [42]. A legújabb vizsgálatok azt is kimutatták, hogy ANXA4 kölcsönhatásba lép P105 (az NF-kB p50 prekurzor protein), és elnyomja a transzkripciós aktivitását az NF-kB indukáló anti-apoptotikus hatását [25]. Összefoglalva, ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy ANXA4 fontos szerepet játszik a sejt túléléséhez és szaporodásához.

CDK1-ciklin B1 komplexek szabályozzák a sejtciklus G2 /M fázisában, és ugyancsak szerepet játszanak előmozdításában tumorigenezisben [43]. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a fokozott expressziója CDK1 társul a progresszió a H. pylori
-asszociált gastritis, hogy nyálkahártya-asszociált limfoid szövet limfóma [28]. Ebben a vizsgálatban a CDK1 aktiválás volt, akár szabályozott által ANXA4. Ezek az események arra utalnak, hogy ANXA4 közvetíthetik a downstream jelátviteli út, ami tumorképzésért gyomorrákos betegek egy H. pylori fertőzés katalógusa.

Azon kívül, hogy részvétele a progresszió a rák, ANXA4 is kapcsolódik a szerzett kemorezisztenciájának rákellenes gyógyszerek [44], [45], [46]. Egy paclitaxel-rezisztens sejtvonal (H460 /T800), ANXA4 expressziója megnő, és a sejtmagban [44]. A világos sejtes karcinóma, a petefészek és a mesothelioma sejtek ANXA4 expresszálódása fokozódott és rezisztenciával összefüggő kezelés karboplatin, és van úgy, hogy egy biomarker hajlamot ciszplatin [45], [46]. Sőt, ANXA4 egy intracelluláris Ca ^{2+ érzékelő, és a Ca 2+ játszik fontos szerepet a neurotoxicitás és a szívelégtelenség [47], [48]. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a megnövekedett mennyiségű ANXA4 nemcsak rákkal kapcsolatos, hanem az Alzheimer-kór, szívelégtelenség és a sejt sérülés által okozott etanol [49], [50], [51].}

Ca ^{2+ hírvivő rendszer is szükséges a sejtproliferáció folyamat, és szabályozzák a sejtciklus [52], [53]. Leírták, hogy a Ca 2 + aktiválhatja AKT útvonal elősegítése sejtek túlélését [54]. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a kifejezés a RHAMM, foszfo-Akt és a elnyomása P21 jelentősen növekedtek, [Ca 2 +] _{i-magasság (5. ábra). H. pylori fertőzés katalógusa társul ANXA4 túltermelése és a sejten belüli [Ca 2 +] i-emelési (ábra S4 és a File S1) [17], [33]. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy H. pylori fertőzés katalógusa okozhat, néhány jelátviteli a ANXA4 stimulálásával intracelluláris [Ca 2 +] i-emelési. Mindazonáltal a részlet mechanizmus a folyamat lehet bonyolult és továbbra sem világos. Ezek nyújthatna felderítése gyomor tumorogenezisben alapjául szolgáló folyamat H. pylori
stimuláció. Mindent összevetve, ez a bizonyíték arra utal, hogy a Ca 2 + segítheti ANXA4 transzdukálására jelző- és elősegíti tumorképzésért gyomor betegek H. pylori fertőzés katalógusa.}}

Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy a hangtompító a ANXA4 csökken hámsejt proliferáció, míg a túltermelése növeli elterjedése. Továbbá ANXA4 indukál lefelé haladó jelek, amelyek elősegítik a sejtek növekedését. Feltételezésünk szerint a lefelé haladó jelek és aktiválása gazdasejt felosztás nem patogén események H. pylori
indukált kialakulásában. A jelenlegi klinikai terápia, AKT, p21 és CDK1 volna használni, mint egy rákellenes gyógyszer célpont. Akt inhibitor, Perifosine, egy orális rákellenes ágens és anti-proliferációs aktivitás számos tumor modellekben [55], [56], [57]. A paclitaxel (Taxol) és a vinkrisztin indukálhat, és növeli a p21 expressziós csökkentéséhez G2 /M letartóztatás és blokkolják a sejtburjánzást [58], [59], [60], [61]. Flavopiridol gátolja a több CDK-k, beleértve a CDK1 apoptózist indukálni és anti-angiogenezis [62]. Ezek a tanulmányok azt jelzik, hogy a magassági ANXA4 betegeknél lehet tekinteni, mint egy gyógyszer célpontja gyomorrák terápiában. A több gyógyszerek kombinációban esetleg többet hatékony kezelés blokkolja jeleket az út. Mindent összevetve, ez a kutatás során új betekintést a fejlesztés terápiás stratégiák gyomorrák. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Sejtvonalak és tenyésztési körülmények katalógusa

Az emberi gyomor adenokarcinóma sejtek AGS (CRL-1739, ATCC) tenyésztettünk 90% -os RPMI 1640 közegben (Biological Industries, Beth-Haemek, Izrael), amelyet kiegészített 1% penicillin /sztreptomicint és 10% magzati borjú szérumot (Biological Industries, Beth-Haemek, Izrael) . A sejteket 37 ° C hőmérsékleten, szabályozott, nedvesített atmoszférában inkubátorban, amely 5% CO _2.

Plazmidok és transzfekciókat

Teljes hosszúságú ANXA4
WAS PCR-rel sokszoroztuk a primer pár ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') és a ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), és az amplifikációs terméket helyezünk a HindIII /EcoRI helyeire pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4 katalógusa specifikus siRNS és negatív kontroll siRNS Stealth (Lopakodó RNSi ™) szereztünk Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). A sejteket hat-üregű lemezeken, vagy bevont fedőlemezek 24 órán át. A sejteket ezután tranziensen transzfektáltuk pcDNA 3.1 (+) / ANXA4 katalógusa (8 ug egy hat lyukú lemez; 0,4 ng /ml egy 96-lyukú E-lemez) vagy a ANXA4 katalógusa siRNS (100 pmol egy hat lyukú lemez; 10 pmol egy 96-lyukú E-lemez) Lipofectamine 2000 (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A hatékonyság expressziós vektort és siRNS transzfekció analizáltuk immunoblot. A transzfekciót követően 48 óra, a differenciális expresszió fehérjék és gének nem volt kimutatható.

Antitestek

Az egér monoklonális antitestek, amelyek ebben a vizsgálatban a következő volt: CDK1 P34 (SC-51578) a Santa Cruz Biotechnology (santa Cruz, CA, USA); Lamp2 (ab25631) és a RHAMM (ab67003) ebből ABCAM (Cambridge, UK); és α-tubulin (T5168) a Sigma (Dorset, Egyesült Királyság). A nyúl poliklonális antitestek a következők voltak: ANXA4 (SC-28827), a p21 (sc-397), és pCDK1 P34 (Thr 161; SC-101654) a Santa Cruz Biotechnology; és AKT (9272) és az Pakt (Ser473; 9271S) a Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).

immunoblot

A sejtlizátumokat készítettünk AGS sejtek tranziensen transzfektáltunk a expressziós vektorok pcDNA 3.1 (+) / ANXA4 katalógusa (8 mg) vagy a ANXA4 katalógusa siRNS (100 pmol). Annak megállapításához, a különbségek a fehérje expressziós körülmények között magas intracelluláris [Ca ^{2 +] _{i, ionomicin (5 uM) adtunk a sejteket 1 órán át. Hatásainak tanulmányozására gátlásának Akt foszforiláció, a sejteket éheztettük 1,5 órán követően egy 48-H transzfekció és kezelünk 5 uM az Akt inhibitor VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Németország) 1 órán át. Mintákat elválasztottuk 10% SDS-PAGE, majd átvisszük polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra (Millipore, Billerica, MA, USA). Blokkolás után 5% -os zsírtalan tejjel, és Tris-pufferelt sóoldattal (TBS), amely 0,1% Tween 20-at (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) 1 órán át szobahőmérsékleten enyhe ringató, a következő primer antitesteket alkalmaztuk: anti-ANXA4 ( 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-Akt (1:500), anti-Pakt (Ser473; 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500), és anti-RHAMM antitest (1:400). A membránokat inkubáltuk szekunder kecske anti-egér konjugált IgG antitesteket (Sigma) vagy kecske anti-nyúl konjugált IgG-t (Rockland, Gilbertsville, PA), ill. a-tubulin antitesttel (1:4000) alkalmaztunk belső kontrollként. Az immun-blot segítségével fejlesztett továbbfejlesztett kemilumineszcens (ECL) detektálási kit (Millipore), és láthatóvá tettük az X-ray filmek. Az intenzitás a megfigyelt sávok normalizáltuk az intenzitása a α-tubulin sávban. Denzitometriás analízist Kodak 1-D Image Analysis szoftver verzió 3.6 (Eastman Kodak, London, Egyesült Királyság). Katalógusa}}

Exon Array A hibridizáció és analízis katalógusa

A tanulmány a downstream gének ANXA4 összehasonlítottuk a génexpressziós profilok között a transzfektált sejtek pcDNA3.1 (+) / ANXA4
és a kontroll transzfektált sejtek egy üres vektor alkalmazásával exon tömb. A teljes celluláris RNS-t extraháljuk TRIzol® reagens (Invitrogen), és RNS tisztaságát igazoltuk spektrofotometria (A260 /A280 arány), valamint a kapilláris elektroforézis (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). RNS-feldolgozás és a hibridizáció alkalmazásával hajtottuk végre a Affymetrix Humán Exon 1.0 ST tömbök (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja. Minden tömb 28869 jól annotált gén 764885 különböző próbát. A tömb tartalmaz mintegy 26 próbák minden gén. Affymetrix szonda állítja információk jelennek meg NetAffx webhelyén (http://www.affymetrix.com) [63]. Microarray analízis (n = 2 per csoport) végeztük a Partek Genomics Suite 6.5 verzióban (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). A nyers adatok (CEL fájlokat) normalizálódtak a robusztus multichip átlagoló (RMA) algoritmus és elemeztük t katalógusa vizsgálatok. Elemzés a funkció és a biológiai mechanizmusa a differenciáltan expresszált gének alkalmazásával végeztük a találékonyság Pathway Analysis (IPA) szoftver verzió 7,5; 3 pontot vagy annál tekintettük statisztikailag szignifikáns ( P katalógusa < 0,01) jegyzetekkel az információt. Elküldtük a tömb adatokat a GEO adatbázist, és a sorozat rekord szám GSE33620. Katalógusa

kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) hotelben

A exon tömb használatával mért Partek szoftver az IPA adatbázis megerősítette qRT-PCR-rel. RNS-t izoláltunk AGS sejtekből TRIzol® reagens (Invitrogen), és a RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Első cDNS-szálat szintetizáltunk teljes mRNS felhasználásával reverz transzkripciós kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). A primereket (táblázat S2) alkalmazásával terveztük DNAStar szoftver (DNAStar, Inc., Madison, WI, USA) és PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Génexpressziós mértük Bio-Rad iQ5 valós idejű PCR-érzékelő rendszer egy SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) volt, és normalizáltuk GAPDH expressziót.

Cell Proliferation Assay

AGS sejteket töltöttünk minden lyukban egy 16-lyukú mikrotiter E-lemez. Mindegyik mérőhelyen mikroelektronikai szenzor tömbök tövénél felismerni a sejt index (CI). A transzfekciós kísérletekhez inkubáció után 24 órán, AGS sejteket transzfektáltunk expressziós vektorokat vagy siRNS 6 órán és monitorozni, összesen 84 órán át. Az E-lemezt helyeztünk a Real-Time Cell Analyzer (RTCA) rendszert, és inkubáltuk egy inkubátorban, amely 5% CO _{2 37 ° C-on. A szint sejtburjánzás képviseletében a CI, amely alapján az elektromos impedancia mérése a xCELLigence rendszer (Roche, Mannheim, Németország). Katalógusa}

Statisztikai elemzés katalógusa

Az adatokat átlag ± szórás (SD). Különbség a független csoportok elemeztük két mintás Student t katalógusa teszt. Nyert adatok a sejt proliferációs vizsgálati analizáltuk a kétmintás Kolmogorov-Smirnov teszt. A P katalógusa értéke kisebb, mint 0,05 jelzett statisztikailag szignifikáns. Katalógusa

alátámasztó információk
ábra S1.
szórásdiagramon a szonda intenzitások az ismételt exon array kísérletek. A szonda intenzitás két ismételt kísérleteket külön szerepel egy X katalógusa tengelyen és Y katalógusa tengelyen. Mindegyik próba képviselte egyetlen pont a szórásdiagramon. Ezek az eredmények azt mutatták, a következetesség a duplikált exon array kísérletek. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0044615.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
ANXA4 részt vesz plazmamembrán javítási felvételével sejten kívüli membrán. Reprezentatív áramlási citometriás vizsgálatok igazolták a Lamp2 H. pylori
-fertőzött sejteket. (A) ANXA4 overexpresszáló sejteket képest (B) ANXA4 katalógusa -silenced sejteket. Az eredmények azt jelzik, hogy a ANXA4 elősegíti Lamp2 kifejezés a felületen a H. pylori
-fertőzött sejteket. ANXA4 túltermelése, Over-ANXA4; Kontroll siRNS, siControl; ANXA4 katalógusa siRNS si ANXA4 katalógusa.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0044615.s002 katalógusa (TIF) hotelben ábra S3.
ANXA4 indukál downstream jelátvitelt. A qRT-PCR assay ANXA4 overexpresszáló AGS sejtek (fekete doboz) végeztünk, hogy igazoljuk a kapott adatok exon tömbök (szürke doboz). A relatív mRNS szintje CDK1 katalógusa és PBK katalógusa mértük, és normalizálják GAPDH katalógusa mRNS szinteket. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF) hotelben ábra S4.
intracelluláris Ca ^{2 + magasság, ANXA4 és Lamp2 lokalizáció után H. pylori fertőzés
. (A) H. pylori
-fertőzött AGS sejteket feltöltjük Fluo-3 /AM ellenőrzésére intracelluláris Ca 2+ szintek áramlási citometriával. (B) A dinamikus lokalizációja ANXA4 az élő sejtben. Valós idejű fluoreszcens képeket mutatja lokalizációja EGFP-ANXA4 H. pylori
-fertőzött AGS és az SC-M1 sejtek (sárga nyíl) festettük Hoechst 33258. (C) Lamp2 fluoreszcencia felületén H.}

• PLoS One: a hatás XPD /ERCC2 polimorfizmus Gyomor rák kockázatát között különböző etnikumok: rendszeres felülvizsgálatát és meta-Analysis
• PLoS One: kiválasztott fehérje savas és gazdag cisztein (SPARC) elnyomja angiogenezis alulszabályozza a VEGF expresszióját és MMP-7 Gyomor Cancer