PLoS ONE: DNA metilacije u eksona 1. Regije i složen regulaciji Twist1 izražavanja u želudac stanica raka

Sažetak pregled

Twist1 pretjerana ekspresija se često opaža u različitim oblicima raka, uključujući rak želuca (GC). Iako DNA metilacije na Twist1 pregled gena je prijavljena u stanicama raka, mehanizmi kojima se temelji aktivacije transkripcije i dalje neizvjesna. U ovom istraživanju, prvo smo ispitali Epigenetske promjene na Twist1 pregled pomoću Twist1 pregled transkripcija-pozitivne i -negativno stanične linije koje su izvedene iz naše osnovana difuzna tipa modela GC miša. Liječenje s demetiliranje DNA sredstvo 5-aza-DC ponovno aktivira Twist1 ekspresije u Twist1 ekspresijskim-negativne GC stanicama. Prema metilacije-specifičnog PCR i bisulfita analize sekvenciranja, metilacije na CpG području bogatom unutar Twist1 pregled kodiranja ekson 1, a ne njegove promotorske regije, usko je povezana s transkripcije odsutnost Twist1
ekspresija u mišjim GC stanicama. Kromatina imunoprecipitacijski testovi otkrili da je aktivno histona oznaka H3K4me3 obogaćen je Twist1 ekspresije pozitivnih stanica, a neaktivne histona oznaka H3K9me3 obogaćen je Twist1 izraz negativnih stanica. Izraz razine Suv39h1 pregled i Suv39h2 pregled, histon methyltransferases za H3K9me3, obrnuto su korelaciji s Twist1 pregled, ekspresija i obaranje Suv39h1 pregled ili Suv39h2
izazvana Twist1 pregled izraz. Štoviše, Sp1 faktor transkripcije vezan na eksonu 1 CpG bogate regije u Twist1 ekspresijskim-pozitivne stanične linije, i Twist1 pregled ekspresija je umanjen mitramicina koja koji ometa Sp1 vezanje na CpG bogatih regulatornih sekvenci. Naše studije tvrde da je Twist1 pregled, prijepis u GC stanicama može regulirati kroz potencijalne suradnje DNA metilacije, histona modifikacije u kompleksu sa SP1 vezivanje na CpG-bogatih regija unutar eksona 1. regiji. Pregled

Izvor: Sakamoto a, Akiyama Y, Shimada s, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka s (2015) DNA metilacije u eksona 1 regije i kompleks Regulacija Twist1 izražavanja u želudac stanica raka. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630 pregled

Urednik: Tae-Young Roh, Pohang sveučilište znanosti i tehnologije (POSTECH), Republika Koreja Netlogu

Primljeno: 21. rujna 2015; Prihvaćeno: 6. prosinca 2015; Objavljeno: 22. prosinac 2015 pregled

Copyright: © 2015 Sakamoto i sur. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan od strane financijske potpore-u-Aid za znanstvena istraživanja (c) (24590444) i (a) (25253081), a A3 Predviđanja program (AA005) iz Japana društva za promicanje znanosti (JSPS), a praktična istraživanja inovacijskog kontrolu raka (15Ack0106017h0002) iz Japana agencije za medicinska istraživanja i razvoj, Amed; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html. pregled

suprotstavljenih interesa: autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

kratica. BS, bisulfit sekvenciranje; CGI, otok CpG; Chip, kromatina imunoprecipitaciju; DCKO, dvostruko uvjetovana knockout miš; DGC, difuzni tip karcinoma želuca; GAPDH, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze; GC, rak želuca; H3K4me3, histona H3 lizin 4 tri-metilacije; H3K9me3, histona H3 lizin 9 tri-metilacije; H3K27me3, histona H3 lizin 27 tri-metilacije; MSP, lančana reakcija polimeraze metilacija specifičan; RT-PCR, Reverse lančane reakcije polimeraze transkripcijom; QRT-PCR, kvantitativna RT-PCR; TSGs, tumor supresorski geni; TSS, prijepis startno mjesto; 5-aza-DC, 5-aza-2'-deoxycitidine pregled

Uvod pregled

Twist1, djelujući kao osnovni spirala-loop-helix transkripcijski faktor, direktno se veže na E-box elemenata (NCANNTGN ) na određene ciljne gene [1]. Twist1 Opće je poznato da su bitni za formiranje mesoderm tijekom ranog embrionalnog razvoja vinske mušice i miša [2, 3]. Kod ljudskih tumora, izvanmaternične Twist1 izraz je izvijestio da je povezan s malignim progresijom, invazije, epitelnih-to-mechencymal tranzicije, metastazama i stemness, što ukazuje na potencijalne onkogene funkcije Twist1 [4-6]. Dakle, to je vrlo važno da se razjasne transkripcijski regulatorni mehanizmi za Twist1 u stanice raka. Pregled

Epigenetske promjene, kao što su DNA metilacije i histona modifikacije, su usko povezani s utišavanja gena [7-9]. Iako Epigenetske promjene na CGI (otok CpG) promotorske regije gena za suzbijanje tumora (TSGs) su dobro poznato da je povezan s njihovom genske inaktivacije [10], mehanizmi epigenetičke regulacije onkogena slabo razumio. Nekoliko skupina istraživača je pokazalo da Twist1 pregled je ponovno aktivira obradom sa de-metilacije lijeka, 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC), u stanicama raka [11, 12]. Netipična DNA metilacije na CGI promotora u ljudskom Twist1 pregled često je otkriven u osnovnim raka, uključujući rak želuca (GC) [11-14]. Ipak, postoji mnogo nalaza koji DNA metilacije na Twist1 pregled promotorska regija nije u korelaciji s ekspresijom gena u različitim oblicima raka [12, 14]. Dok Twist1 pregled metilacije može biti koristan biomarker za predviđanje kliničke ishode bi ponovilo, i preživljavanje u bolesnika s karcinomima [12, 13, 15], ostaje sporno da li je Twist1 pregled metilacija na promotorske regije vodi utišavanje gena. pregled

regulaciji transkripcije gena je povezana s lizin (K) metilacije uzorke u histona repa, koji se sastoje od tri različite lizin metilacije stanja (mono-, di- i tri-). Tri-metilacija H3K4 (H3K4me3) odnosi se na aktivaciju gena, i da H3K9me3 i H3K27me3 gen potiskivanje [7-9]. Iako su ove tri histona H3-methyaltion obrasci povezani s CGI metilacije kao dobro, transkripcijski regulatorni mehanizmi za Twist1 pregled temeljnih histona modifikacija se slabo razumije u stanice raka. Pregled

GC je drugi najveći česte uzrok smrti od raka u svijetu [16]. GC je razvrstan u dvije glavne histoloških tipova; difuzna i crijevna, što su dvije različite kancerogene putevi [17]. Difuzni tip raka želuca (DGC) poznato je da pokazuju često invaziju i metastaziranje, što je rezultiralo lošom prognozom [18]. Gubitak E-kadherina i p53 je prijavljen u difuzno tipa želučane karcinogeneze [19-21]. Nekoliko izvješća pokazalo učestalo izražajnost Twist1 u ljudske DGCs [22, 23]. Pregled

Mi smo ranije projektirana dvostruku uvjetnu nokaut (DCKO) miš linija kako bi se E-kadherina i p53, koji su posebno deaktiviran u želucu [ ,,,0],19]. Sve DCKO miševi razvili kobne DGCs roku od godinu dana, fenotipovi napušenosti invazivnost i česte metastaze u limfne čvorove. Važno je napomenuti da je izraz gena obrasci DGCs u DCKO miševa određena na microarray analize bile su vrlo slične onima u ljudskim primarnim DGCs osim onih crijevnih. Dakle, naš DCKO mišji model je moćan alat za istraživanje uloge funkcije gena u DGC karcinogeneze i za razvoj terapijskog strategije. U ovom istraživanju, uspostavili smo Twist1 izraz-pozitivne i -negativno stanične linije DGC koji su izvedeni iz DCKO miševa. Kao posljedica analize epigenetičkim promjena, zajednički regulatorni mehanizam Twist1 Netlogu bio rasvijetljen, a ocijenjena je u oba miša i čovjeka DGCs u ovoj studiji. Pregled

Materijali i metode pregled

Etika Izjava pregled

Sve in vivo
postupci su odobreni od strane Care odbora Tokyo medicinske i Sveučilište Dental (Odobrenje br 0160073A) životinja. Što se tiče normalnih ljudskih sluznica uzoraka želučane, pismeni informirani pristanak dobiven je od svih ispitanika, a istraživanje je odobrilo Etičko povjerenstvo Tokyo medicinske i Sveučilište Dental (No.1115). Pregled

Cell kultura i uzorci tkiva

Mi smo ranije uspostavio E-kadherina /p53 DCKO ( Atp4b-Cre pregled ^{+ pregled; Cdh1 pregled loxP /loxP pregled; Trp53 pregled loxP /loxP pregled) mišji model [19]. Od svojih kanceroznih tkiva, osnovali smo pet miša DGC stanične linije i nazvali ih MDGCs (Shimada S, neobjavljena opažanja). MDGC-1 i MDGC-3 stanice uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (DMEM) koji sadrži razinu glukoze, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma i MDGC-7 MDGC-8 i MDGC-9 uzgaja u Hamovom F12, uz dodatak 5% konjskog seruma. DNK analiza je provedena kako bi se otkrila krnjeg Cdh1
i Trp53 pregled aleli (S1 sl). Osam ljudske GC stanica (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 i HSC60) također su korišteni u ovom istraživanju. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY i KATO-III su kupljeni od Riken banke stanica (Tsukuba, Japan). NUGC4 i AGS stanice dobivene su iz Human Science Research potencijala banke (Osaka, Japan) i ATCC (American Type Collection). HSC60 stanice su dobivene od dr Kazuyoshi Yanagihara (Cancer National Research Center, Tokyo, Japan) [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS i HSC60 stanice su uzgojene u RPMI 1640 i GCIY se kultivira u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju, a obje su bile dopunjene sa 10% fetalnog goveđeg seruma. Za de-metilacije studija, mišjih i ljudskih GC stanice tretirane su svaki dan sa 500 nM 5-aza-deoksicitidin (5-aza-DC, Sigma, # A3656), tijekom 72 sata. liječi smo ove GC stanice s 100 nM trihostatin A (TSA, WAKO;È-11993) za 24 sata ili 100 nM mitramicin A (Wako;„-17101) za 24 sata}

Osamnaest primarni GC tkiva i odgovara. nekancerozne želučanih sluznica su dobiveni iz 15 DCKO miševa. Što se tiče ljudskih tkiva u želucu, koristili smo tri non-kancerogen želučanu sluznicu od GC pacijenata. Također smo dobili pet normalnu želučano sluznicu od Atp4b-Cre pregled ^{- pregled; Cdh1 pregled loxP /loxP pregled; Trp53 pregled loxP /loxP pregled miševa koji su korišteni kao negativna kontrola u našoj prethodnoj studiji [19]. U ovom istraživanju, nazvali smo "normalni želučana sluznica", ako su primjerci dobiveni od kontrolnih miševa, a "ne-kancerogen želuca sluznica", ako su primjerci nabavljeni su od DCKO miševa i GC pacijenata s humanim u ovoj studiji. Pregled}

reverzne transkripcije (RT) -PCR i kvantitativnom RT-PCR (QRT-PCR) pregled

Ukupna RNA izolirana je uz RNeasy Mini kita (Qiagen;J.134) i cDNA je pripremljena iz RNA korištenjem Superscript III kit (Invitrogen;´80044) prema protokolu proizvođača. Završna točka RT-PCR provodi s više ciklusa brojevima, 28-35 ciklusa. Kao unutarnju kontrolu, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze ( GAPDH pregled) amplificiran je 21 ciklusa kako bi se osigurala kvaliteta cDNA i količinu za svaku RT-PCR. U umnoženi proizvodi su učitani na 2% agaroznom gelu ili kvantificirati pomoću kvantitativne RT-PCR korištenjem LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics,/07516001). Amplificirani programi za PCR se ponovi 40 ciklusa za GAPDH i 45cycles na druge gene, osim za GAPDH. PCR produkti klonirani su u T-vektor pMD20 pomoću moćni TA-kloniranje (Takara BIO INC,ɚ8), a zatim izravno sekvencirani. Sekvencijama i PCR veličine proizvoda prikazani su u tablici S1. Pregled

Metilacija Analiza pregled

ekstrahira smo genomske DNA iz mišjih i GC humanih stanica metodom fenol-kloroform, a zatim provodi bisulfit izmjena i postupak MSP. Bisulfit liječenje DNA se izvodi s EZ metilacije DNA-Gold (ZYMO istraživanja; # D5006), a zatim metilacija specifičan PCR (MSP) je provedena. Ukratko, PCR reakcija je provedena u 35 ciklusa od 25 ul smjese sadrže bisulfite modificirani DNK, 2.5μl 10x PCR pufer, 1,25 ul 25 mM dNTPs, 25 pmol /L svakog primera i 1 U Jumpstart RedTaq polimeraze (Sigma; # D0563). Uvjeti za PCR bili su kako slijedi: 95 ° C tijekom 5 minuta; 35 ciklusa od 95 ° C za 1minutes, 53 ° C za 2minutes, i 72 ° C za 1.5minutes; i finalna ekstenzija na 72 ° C tijekom 5 minuta. Kao i za mišje GC tkiva DNK je ekstrahirana iz formalinom fiksiranih parafin uklopljenih (FFPE) tkiva. Bisulfit DNK umnožena s bočne PCR klicama, a zatim grupiraju MSP je provedeno [25, 26]. Sekvencijama i PCR veličine proizvoda prikazani su u tablici S2 pregled

kromatina imunotaloženje (chip) Test pregled

Test čip provedena je pomoću čip-IT Express kit (Active Motiv;Ȓ08). u skladu s protokolom proizvođača. Imunoprecipitiran DNA obogaćenje se normalizira kao na ulaz. Antitijela se koriste u ovom istraživanju bili su protiv histona H3K4me3 (Active Motiv;Ə15), anti-H3K9me3 (Active Motiv;ƍ65), anti-H3K27me3 (Active Motiv;Ƈ55), anti-H3K36me2 (abcam; # ab9049) anti-Sp1 (abcam, # ab13370) i ​​anti-histona H3 (Active Motiv,'.163) protutijela. Normalni zec IgG (Cell Signaling Technology,Đ9s) je korišten kao negativna kontrola za čip. Sekvencijama i PCR veličine proizvoda prikazani su u tablici S2. Pregled

obaranje analizu pomoću male smetaju RNA pregled

siRNA-based obaranje Suv39h1 pregled i Suv39h2
je bila provedena korištenjem elektroporacije (Neon transfekcijskog sistema, Invitrogen) prema uputama proizvođača. MDGC stanice su transfektirane s 50 nM siRNA prema Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226) ili negativna kontrola siRNA (Mission Universal siRNA negativne kontrole, Sigma). Nakon 48 sati uzgoja, stanice se prikupe za RT-PCR, Western blot analiza, migracije, invazije, i ispitivanjem razmnožavanja. Pregled

Western blot analiza pregled

GC stanice su lizirane s RIPA puferom Pierce (Thermo Znanstveni;΃00). Proteini su odvojeni na SDS-poliakrilamidnim gelovima i zatim preneseni na polivinilidenfluorid (PVDF) membranu, a zatim inkubiranjem s antitijelima otopljeni u Tris-puferiranoj slanoj otopini (TBS) koja sadrži 2% obrano mlijeko i 10% Tween 20. Primarna antitijela se koriste u ovom studija su mišje monoklonsko anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz biotehnologije, # sc-81.417), zečje poliklonalno anti-Sp1 (1: 200, aktivni Motiv,'.058) i mišje monoklonsko anti-α-tubulin ( 1: 200, Santa Cruz, # SC-8035) antitijela. Sekundarnih antitijela su alkalna fosfataza-konjugiranog anti-zečji IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,
.706.518) i anti-mišjim IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,
.706.520). Mrlje su razvijene s ImmunoStar AP supstrata (Bio-Rad Laboratories,ª5018) pregled

Imunohistokemija pregled

FFPE sekcije (4 uM) su deparafmizirani u ksilenu, rehidrira u gradiranog etanola otopinama i zatim Antigen preuzimanje. je provedeno u 10 mM pufera limunske kiseline od mikrovalnoj. Imunohistokemija je provedena upotrebom anti-Twist1 antitijela (Santa Cruz, 1:20) kao što je prethodno opisano [19]. Ekspresija Twist1 definirana je kao pozitivan nuklearnog bojanja u više od 10% stanica, a intenzitet je zabio kao- (negativno), + (slaba) i ++ (umjerena do jaka) tri istražitelja samostalno. Pregled

Rezultati

Twist1 izraz u mišjih i humanih stanica GC

iz DGC tkiva DCKO miševa, Twist1 pregled transkripcija-pozitivne stanične linije (MDGC-7, MDGC- 8 i postavljeno MDGC-9) i negativne stanične linije (MDGC-1 i MDGC-3) (slika 1A i S2A Sl) i ekspresija Twist1 proteina potvrđena je u svakoj staničnoj liniji (Slika 1B). Twist1 ekspresija je bila pojačana na razini mRNA i proteina u Twist1 ekspresijskim-negativne MDGC stanica nakon tretiranja s demetiliranje DNA sredstvom 5-aza-DC (Slika 1C i 1D), dok je ekspresija nije promijenjena nakon tretmana s inhibitora HDAC TSA (S2B Slika). U osam ljudskih GC stanične linije ispituje, Twist1 pregled ekspresija regulirani u četiri staničnih linija (Slika 1E, lijevo), tri (Kato-III, GCIY i AGS) od kojih je pokazala ponovni aktivaciju Twist1 pregled ekspresija nakon liječenja s 5-aza-DC pomoću RT-PCR (na primjer, slika 1E, desno). Kao i za Twist1 pregled izraz pozitivnih GC stanične linije, nakon 5-aza-DC liječenja, 2.1- i 3.2-fold up-regulacije Twist1 pregled je otkriven u MKN45 i MKN7, odnosno, by QRT-PCR, dok Twist1 izraz nije se promijenio u MDGC-9 stanica (Slika 1f). pregled

CGI metilacije i izražavanja Twist1 pregled u GC stanične linije

Twist1 pregled ima gustu CGI regiju promotora na cijeli eksona 1, to područje je vrlo očuvan među kralješnjaka, uključujući miševa i kod ljudi (S3 sl). Da pojasnimo CGI u miševa i kod ljudi Twist1 Netlogu, proveli smo računalnu analizu pomoću UCSC genoma Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) i MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /) koji se često koriste kao identifikacije CGI i MSP primera [27]. Analizirali smo oko 1,4 kb regije, uključujući promotor i cijelog eksona 1. UCSC Genome preglednik na mišu i ljudskog analizu koja je pokazala jednu CGI u regiji ispituje (podaci nisu prikazani). Međutim, navodni dvije CGI stranice su otkrivene u regiji miševa i kod ljudi kad smo se kriterijima CGI sa sadržajem GC od 50%, a uočeno /očekuje CpG omjer 0,8 po MethPrimer (slika 2A i 2C). Ta dva pretpostavljenih CGI područja su smještena na promotor i eksona 1. Budući da je metilacije na promotorske regije opisan je u različitim humanim karcinomima [12, 14], se najprije ispitali stanje metilacija u regiji mišjih i humanih stanica GC od strane MSP. Međutim, status metilacija na promotorske regije Twist1 pregled ne odgovara na njegovu ekspresiju u bilo staničnim linijama GC ispituje (regiju P1, Slika 2A). Za određivanje kritičnih metilirani regije povezane s Twist1 izražavanja u MDGC stanica, mi i dalje obavlja MSP na CGI regiji eksona 1 (E1-1, E1-2 i E1-3), a predviđeni CpG obale na mjestu koje se nalazi oko 1,6 kb iz TSS (prijepis startno mjesto, S1) (Slika 2). Kao rezultat toga, CGI metilacije u regiji (E1-1 i E1-2) oko TSS u Twist1 pregled eksona 1 je utvrđeno da odgovaraju ekspresije gena u MDGC stanicama, iako nije bilo korelacije između ih u predviđenom shore području (S1) i na kraju eksona 1. regiji (E1-3) (Sl 2B, lijevo) u MDGC stanicama. Ne metilacije je otkrivena u bilo CpG regijama u tri normalne želučane sluznice bez Twist1 izraza iz Atp4b-Cre pregled ^{- pregled; Cdh1 pregled loxP /loxP pregled; Trp53 pregled loxP /loxP pregled miševa (Slika 2B). U ljudskom želučane sluznice, nema Twist1 pregled metilacije se također naći u tri ne-kancerozne želučane sluznice GC bolesnika (Slika 2D), jedan od kojih je pokazala vrlo slaba Twist1 pregled izraz (podaci nisu prikazani ). Također smo ispitali još četiri nekanceroznog želučanu sluznicu sa GC pacijenata, dok se ne metiliranje je otkriven na E1-2 regiji u svim slučajevima (podaci nisu prikazani). Bisulfit sekvenciranje (BS) pokazali su da CGI područje u eksonu 1 pokazala gustu metiliranje u Twist1 ekspresijskim negativnih MDGC-3 stanicama, ali ne i u Twist1 pozitivne MDGC-9 stanice (BS-c, Slika 2A i 2B, desno), dok nije bilo razlika u metilacije uzoraka između njih na CpG obalu i promotor regije (BS-a i BS-b, S4A sl). Među ljudskim staničnim linijama GC, Kato-III i GCIY bez Twist1 pregled izraz pokazao gustu CGI metilacije na području eksona 1 (E1-2), koji je u skladu s onima mišem Twist1 pregled (Slika 2C i 2D, lijevo). I metiliranje i unmethylation u E1-2 regiji otkrivene su u MKN7 i MKN45 stanicama s MSP i bisulfita sekvenciranje (Slika 2D), koje su basally izraženi Twist1 ali njihovi razinama su povećane nakon 5-aza-DC liječenja (Slika 1F). Dakle, naši podaci pokazuju da metilacije u eksona 1. regije Twist1
otkrivena u ovoj studiji je povezana s njegovom izrazu. Pregled}

Twist1 pregled metilacije i izraz u DCKO miša GC uzorci tkiva

ispitali smo status metilacije Twist1 pregled pomoću 18 osnovnih GC tkiva iz 15 DCKO miševa. Zbog GC regije bile su vrlo male i njihov DNK iz uzoraka FFPE imali niske koncentracije, proveli smo ugnežđeni MSP [25, 26]. Twist1 pregled bitno je metiliran (9/18, 50%) u osnovnim GCS u odnosu na odgovarajuće ne-kancerogene tkiva (1/10, 10%), što je statistički značajna razlika (p < 0,05, tablica 1). Reprezentativni podaci po MSP su prikazani na slici 3A. Među njima, 4 od 10 (40%) slučajeva bile intramucosal i 5 od 8 (62,5%) bile su invazivne GCS (tablica 1). U ovom istraživanju, Twist1 pregled metilacije-pozitivnih slučajeva pokazalo nemetilirane MSP bendova kao i, što zbog prisutnosti normalnog strome /fibroblasta i upalnih stanica u dijelovima rak tkiva, iako nismo mogli uskratiti mogućnost djelomičnog metilacije kao MKN45 i MKN7 i tumora heterogenosti. pregled

Twist1 ekspresija proteina je otkriven u 7 od 18 (38,9%) GCS u odnosu na odgovarajuće ne-kancerogen želučanu sluznicu imunohistokemijski. Reprezentativne slike prikazane na slici 3B. Mi dodatno analizirati odnos između Twist1 pregled govora i metilacije razinama u tim slučajevima. Među 18 primarni GC pregledao devet slučajeva su pokazali povezanost između Twist1 pregled metilacije i izraz (Slika 3C). Tri od četiri slučaja s Twist1 slabom ekspresijom izlagao svoje metilacije, moguće da je niska ekspresija Twist1 može biti uzrokovan njegovom metilacije. Međutim, preostalih pet slučajeva ne pokazuje metilacije i izraza (tablica 1). Pregled

histona metilacije se odnose na reguliranje Twist1 pregled izraz pregled

Sljedeći istraživali da li ili ne lizin razinu metilacije histona H3 doprinosi Twist1 pregled izražavanja. Kromatina imunoprecipitacijski (chip) testovi provedeni su na predviđenoj CpG obale (CP1.3k), promotora (CP1) i eksona 1 (CE1-1 i CE1-2) i 2 (CE2) regije (Slika 2a). Na CP1 i CE1-2 regijama aktivni histona oznaka H3K4me3 obogaćcn Twist1 ekspresijskim-pozitivne stanice (MDGC-7 i MDGC-9), ali inaktivan histona oznaka H3K9me3 obogaćcn Twist1 ekspresijskim-negativnih stanica (MDGC-1 i MDGC -3) (Slika 4A i 4B). Chip ispitivanja prikazana kao H3K4me3 i H3K9me3 signala u MDGC-1 i MDGC-3 stanicama s 5-aza-DC liječenja, pokazuje povišene razine H3K4me3 u tim stanicama (Slika 4C). Naprotiv, u H3K27me3 i H3K36me2 razine nisu bili povezani sa Twist1 izražavanja na bilo MDGC stanica ispitanih u ovom istraživanju. Što se tiče ljudskih GC staničnim linijama, sličan regija nalazi od promotora za eksona 1 pokazali H3K4me3 obogaćenje u Twist1 pregled izraz pozitivnih MKN45 stanica, a H3K9me3 u Twist1 pregled izražavanja negativnih Kato-III stanice (Sl 2C i 4D). pregled

Suv39h1 pregled i Suv39h2 pregled, a histona mctiltransfcrazu, regulira H3K9me3 pregled

Postoji mnogo histona methyltransferases povezan s H3K4, H3K9 i H3K27 [28]. Stoga, kako bi se utvrdilo koji histona izmjena enzimi odgovorni za H3K4me3 ili H3K9me3 obogaćenje na Twist1 pregled eksona 1 regija u GC stanicama, ispitali smo deset H3K4me3 ( Mll1 pregled, Mll2
, Mll3 pregled, Mll4 pregled, Setd1a pregled, Setd1b pregled, Ash1 pregled, Ash1l pregled Smyd3 pregled i Meisetz pregled), sedam H3K9me3 ( Suv39h1 pregled, Suv39h2 pregled, G9a pregled, Setdb1
, Clld8 pregled, GLP pregled i Riz1 pregled), a jedan H3K27me3 ( Ezh2
) vezani geni. I podaci su prikazani na Slici 5A. Među njima, razina ekspresije Suv39h1 pregled i Suv39h2 pregled su obrnuto korelirani s Twist1 pregled izražavanja. Međutim, razina ekspresije preostalih 16 histona methylatasferase gene ispitati nisu bili povezani s Twist1 pregled izražavanja u MDGC stanicama. Izvršili smo siRNA-based obaranje Suv39h1 pregled ili Suv39h2 pregled u odgovarajućim izrazom pozitivne MDGC-1 i MDGC-3 stanice elektroporacijom (Slika 5b). Obaranje Suv39h1 pregled ili Suv39h2 pregled u tim staničnim linijama dovelo do povećanja Twist1 pregled izraz vidljivi na RT-PCR (Slika 5b) i QRT-PCR (MDGC- 1, slika 5C) pregled

Udruga SP1 sa regulaciji transkripcije Twist1

konsenzusa 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /a) (C /T) -3 'sekvenca je poznata kao motiv vezivanja SP1 transkripcijskog faktora, a odnos između CGI metiliranje i SP1 vezanje u promotora je opisano [29, 30]. Više vezna mjesta SP1 su predviđeni u CpG području bogatom unutar Twist1 pregled eksona 1 s TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) i JASPAR (http://jaspar.binf.ku.dk) , Uloga SP1 na transkripciju Twist1
zatim je ispitan s obzirom na epigenetičke modifikacije gena. Otkrili smo ekspresiju SP1 mRNA i proteina u svim mišjih i ljudskih GC stanicama ispitanih, čak iu Twist1 izraz negativnih MDGC-1, MDGC-3, KATOIII i GCIY stanica (Slika 6a). pregled

Kako bi se utvrdilo da li ili ne Sp1 veže na područje Twist1 pregled, promotor i eksona 1 u GC stanicama, proveli smo čip esej SP1 pomoću MDGC stanice (Sl 2a). SP1 dužan regijama Twist1 pregled promotor (CP1) i eksona 1 (CE1-2) u Twist1 ekspresije pozitivnih staničnih linija (MDGC-7 i MDGC-9) (Sl 6b). Nasuprot tome, Twist1 izraz-negativne stanične linije (MDGC-1 i MDGC-3) pokazali su nemoguće otkriti razine SP1 obvezujuće signale na CP1 i CE1-2 regijama. SP1 ne vežu na bilo regijama predviđenoj CpG obali (CP1.3k) i eksona 2 (CE2) regija u tim Twist1 izraz pozitivnih i -negativno MDGC stanica. Dcmctilacija s 5-aza-DC povećao Sp1 vežu na Twist1 pregled, promotora i eksona 1 regijama u Twist1 izraz negativnih MDGC-1 i MDGC-3 stanicama (Slika 6b). Mitramicin A je poznato da interferiraju s Sp1 vezanje na CpG bogatih regulatorne sekvence [31, 32]. Uočeno je da Twist1 pregled izražavanje dolje regulirano nakon tretmana s mitramicina A u svom izričaju pozitivnih GC stanicama (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 i MKN45 stanice) (Slika 6c i S6 sl). Mitramicin nije pokazala nikakav učinak na SP1 izražavanja u ovim stanicama (podaci nisu prikazani). Up-regulaciju Twist1 pregled od 5-aza-DC je smanjena za mitramicina tretman u MDGC-3 stanicama (p = 0,04, Slika 6D). Pregled

Rasprava pregled

mehanizmi kojima se temelji epigenetičku regulaciju onkogena slabo razumio. Odnos statusa metilacije na Twist1 pregled regije promotora i izraz Twist1 pregled je sporno, a tu su i gotovo nitko od izvješća o izmijenjenom histona promjenama u Twist1 pregled izražavanja. Dakle, i dalje je neizvjesno hoće li ili nisu Epigenetske promjene vezane za Twist1 pregled aktivacije u stanicama raka. Kao novim nalazima u ovoj studiji, rasvijetlio mi Twist1
regulatorni mehanizam u podlozi temeljni epigenetičku strojeva koji metilacije DNA, histona izmjena i Sp1 djelovati u dogovoru s Twist1 ekspresiju u GC stanicama. Pregled

To je široko poznato je da DNA metilacije na CGI promotorske regije je kritična za utišavanja gena i neprirodnih CGI metilacije rezultira gubitkom ekspresije različitih TSGs [10]. Twist1 je ponovno aktiviran u oba miša i čovjeka GC stanica s 5-aza-DC liječenja u ovoj studiji, što znači da transkripcijsko aktiviranje Twist1 također modulira metilacije DNA. CGI metilacije Twist1 pregled promotorska regija je pronađena u različitim oblicima raka, kao što su želuca, dojke, debelog crijeva i pluća one [11, 12, 14], od kojih se većina nije pokazala povezanost između Twist1
metilacije i izražavanja. Uočili smo da je CGI metilacije u Twist1 pregled eksona 1, osim u području promotora korespondira sa njegove ekspresije gena u miša GC stanicama. Kao i za ljudske GC stanicama, Twist1 pregled ekspresije negativne stanične linije bile potpuno metiliran, no njihova ekspresija-pozitivne stanične linije izložene oba metiliranje i unmethylation Twist1 pregled, koji su svi gore regulira- Twist1 pregled ekspresija nakon 5-aza-DC liječenja (Slika 1F). Ovi podaci pokazuju da MKN45 i MKN7 stanice djelomično pokazala metiliranje Twist1 pregled i pol razine Twist1 pregled ekspresija basally otkrivene su u tim stanicama, koje su izraženi s unmethylated DNA alel. Nedavna izvješća pokazuju da CpG obala metilacije se odnosi na ekspresiju gena [7, 33]. Međutim, status metilacije na predviđenoj CpG obale mjestu regiji nije bio u korelaciji s Twist1 pregled izražavanja. Naši podaci pokazuju da je Twist1 pregled je epigenetically ušutkao metilacije DNA u miša i čovjeka GC staničnim linijama. Pregled

Prema računalnom analizom miševa i kod ljudi CGIS od promotora do Cijelo područje kodiranja u Twist1 pregled gena, dvije navodni CGI područja bili smješteni na promotora i eksona 1 do MethPrimer analize. Ovdje smo primijetili da CGI metilacije na eksona 1, a ne njegove promotorske regije, bio je u korelaciji s Twist1 pregled izražavanja u GC stanicama. Takvi različiti obrasci metilacije povezane s utišavanja gena su zabilježene u nekoliko gena [26, 34, 35]. Na primjer, SOX2 pregled i AP2α pregled izloženi navodni dva CGIS na promotora i eksona 1, a metilacije na eksona 1. regije je pokazalo da se u značajnoj mjeri povezan njegove ekspresije gena u GCS i dojke raka [34, 35]. To je izvijestio da je CGI metilacije oko translacije startnog mjesta u beta retinoičnom kiselinom receptora (RAR-SS) gena dramatično korespondira sa njegovom izrazu u mišjim karcinoma pluća u odnosu na metilacije na promotorske regije koji se nalazi u istoj CGI [26]. Dakle, naši rezultati pokazuju da CGI metilacije na eksona 1. regije u Twist1 pregled je važno za njegovo utišavanja gena u GC stanicama. Međutim, to je nepoznat mehanizam ovog proturječne metilacije između promotora i eksona 1 regijama. Nekoliko faktora transkripcije vezna mjesta, kao što su SP1 elemenata i histona modifikacije su izvijestili da zaštiti CGI metilacije [36, 37]. Važno je da ispita ove elemente i epigenetičko strojeva u CGI regijama Twist1
dalje.

U primarnoj GCS od DCKO miševa, 50% GCS izlagao Twist1 pregled metilacije by ugniježđena MSP. Naši DCKO miševi pokazuju parijetalni stanica povezanih atipična žarišta u želucu i intramucosal DGCs se sastoji od slabo diferenciranih stanica i pečatni prsten stanica često su otkrivene na 6 mjeseci. Stoga smo prethodno predložio da naši DGCs u DCKO miševi razvili kroz parijetalni stanica linije [19]. Twist1 pregled je metiliran u 40% intramucosal raka, dok je učestalost metilacije u ne-kancerozne želučane sluznice, uključujući atipične žarišta bila je rijetka (10%), što ukazuje da je Twist1 pregled metilacije je rani događaj u DGC karcinogeneze u našem modelu miša. Među 18 osnovnih GCS ispitanih, pet slučajeva bili su Twist1 pregled methylation- i izraz-negativna.

• PLoS ONE: Statini stanjiti Helicobacter pylori CagA Premještaj i smanjiti učestalost raka želuca: in vitro i za stanovništvo Case-Control Studies
• PLoS ONE: endoskopske resekcije usporedbi s gastrektomije se liječilo rane raka želuca: sustavni pregled i meta-Analysis