PLoS One: DNS metiláció az Exon 1 régióra és bonyolult szabályozás a Twist1 Expression gyomorrákban Cells

absztrakt

Twist1 túltermelődése gyakran megfigyelhető különböző rákokban, beleértve a gyomorrák (GC). Bár a DNS-metilációs a Twist1
gén számoltak be rákos sejtek, a mechanizmusok mögöttes transzkripciós aktivációs bizonytalan marad. Ebben a tanulmányban először megvizsgálta epigenetikus változások a Twist1 katalógusa a Twist1 katalógusa transzkripció-pozitív és -negatív sejtvonalak származnak Patinás diffúz típusú GC egérmodellben. A kezelés egy olyan DNS-demetilezési ágens 5-aza-dC újra aktiválódnak Twist1 expresszió Twist1 expresszió-negatív GC sejteket. Szerint a metiláció-specifikus PCR és biszulfit szekvenálás elemzés metilezése a CpG-gazdag régiót belül Twist1
kódoló exon 1, nem pedig annak promoter régió volt, szorosan kötődtek a transzkripciós silencing a Twist1
kifejezés egér GC sejtekben. A kromatin immunprecipitációs vizsgálatok során kiderült, hogy az aktív hiszton védjegy H3K4me3 gazdagodott Twist1 kifejezés-pozitív sejteket, és az inaktív hiszton védjegy H3K9me3 gazdagodott Twist1 kifejezés negatív sejtekben. Az expressziós szintje Suv39h1 katalógusa és Suv39h2 katalógusa, hiszton metiltranszferázok az H3K9me3 voltak fordítottan arányos Twist1 katalógusa kifejezés, és kiütése Suv39h1 katalógusa vagy Suv39h2
indukált Twist1 katalógusa kifejezést. Sőt, Sp1 transzkripciós faktor kötődik az 1. exon CpG-gazdag régió Twist1 expresszió-pozitív sejtvonalak, és a Twist1
expressziót csökkent mitramicin, amely amely zavarja Sp1 kötődését a CpG-gazdag szabályozó szekvenciákat. A vizsgálatok arra utalnak, hogy a Twist1 katalógusa transzkripció GC sejteket lehet szabályozni lehetséges együttműködési DNS metiláció, hiszton módosítás komplexet Sp1 kötődés CpG-gazdag régióiban exon 1 régióban. Katalógusa

idézet: Sakamoto a, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) a DNS metiláció az Exon 1 régióra és bonyolult szabályozás a Twist1 Expression gyomorrákban Cells. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630 katalógusa

Szerkesztő: Tae-Young Roh, Pohang Egyetem Természettudományi és Technológiai (POSTECH), Koreai Köztársaság katalógusa

Beérkezett: szeptember 21, 2015; Elfogadva: december 6, 2015; Megjelent: december 22, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Sakamoto és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: Ezt a munkát támogatták-in-Aid for Scientific Research (C) (24590444) és (a) (25253081) és az A3 Foresight Program (AA005) a Japán Társaság a Promotion of Science (JSP), és a gyakorlati kutatás innovatív Rákellenes (15Ack0106017h0002) Japán Ügynökség Egészségügyi Kutatási és Fejlesztési, Amed; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html. katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Rövidítések: BS, hidrogén szekvenálás CGI, CpG-sziget; Chip, kromatin immunprecipitációt; DCKO, dupla feltételes knockout egér; DGC, diffúz típusú gyomorrák; GAPDH, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz; GC, gyomorrák; H3K4me3, hiszton H3 lizin 4 tri-metiláció; H3K9me3, hiszton H3 lizin 9 tri-metiláció; H3K27me3, hiszton H3 lizin 27 tri-metiláció; MSP, metiláció-specifikus polimeráz láncreakció; RT-PCR, reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció; QRT-PCR, kvantitatív RT-PCR-rel; HKT, tumor szuppresszor gének; TSS, átirat start hely; 5-aza-DC, 5-aza-2'-dezoxicitidin

Bevezetés

Twist1, jár, mint egy alap helix-loop-helix transzkripciós faktor, közvetlenül kötődik az E-box elemek (NCANNTGN ) meghatározott cél gének [1]. Twist1 széles körben ismert, hogy alapvető fontosságú a mesoderma képződése során az embrionális fejlődés korai Drosophila és az egér [2, 3]. Az emberi rákok, ectopiás Twist1 kifejezés azt jelentette, hogy vonják be a rosszindulatú progresszió, invázió, epithelialis-to-mechencymal átmenet, metasztázis és stemness, jelezve potenciális onkogén funkcióit Twist1 [4-6]. Így nagyon fontos, hogy tisztázza a transzkripciós szabályozó mechanizmusokat Twist1 a rákos sejtekben. Katalógusa

Az epigenetikai változások, mint például a DNS metiláció és hiszton módosítás szorosan kapcsolódik géncsendesítést [7-9]. Bár epigenetikai változások a CGI (CpG-szigetre) promoter régió a tumorszuppresszor gének (HKT) jól ismert, hogy összefüggésben azok gén inaktiválását [10], a mechanizmusok epigenetikai szabályozás onkogének nehezen érthető. Számos csoport kimutatta, hogy A Twist1
újra aktivált kezeléssel egy de-metilezési drog, 5-aza-2'-dezoxicitidin (5-aza-DC), a rákos sejtekben [11, 12]. Aberrált DNS metiláció a CGI promoter humán Twist1 katalógusa már eddig is gyakran kimutatható primer daganatok, beleértve a gyomorrák (GC) [11-14]. Ennek ellenére vannak sok megállapítást, hogy a DNS metilezése a Twist1
promoter régiót nem korrelál a gén expresszióját különböző rákokban [12, 14]. Míg Twist1 katalógusa metiláció hasznos lehet a biomarker megjósolni a klinikai eredményeket, mint a kiújulás és a túlélés daganatos betegeknél [12, 13, 15], továbbra is ellentmondásos-e vagy sem a Twist1 katalógusa metilezése a promoter régió vezet hangtompító a gén.

transzkripciós gének szabályozásában korrelál a lizin (K) metilációs minták a hiszton farok, hogy áll három különböző lizin metiiációs Államok (mono-, di- és tri-). Tri-metiláció H3K4 (H3K4me3) kapcsolatos gének aktiválását, és hogy a H3K9me3 és H3K27me3 a gén elnyomás [7-9]. Bár e három hiszton H3-methyaltion minták kapcsolódnak CGI metiláció is, a transzkripciós szabályozó mechanizmusokat Twist1 katalógusa mögöttes hiszton módosítás kevéssé ismert a rákos sejtekben. Katalógusa

GC a második leggyakoribb halálok a rák a világ [16]. GC sorolják két fő szövettani típus; diffúz és a bél, amelyek két különböző rákkeltő útvonal [17]. Diffúz típusú gyomorrák (DGC) ismert, hogy gyakran mutatnak invázió és metasztázis, ami egy rossz prognózist [18]. Elvesztése E-cadherin és a p53 számoltak be diffúz típusú gyomor karcinogenezis [19-21]. Számos jelentés bizonyította gyakori túltermelése Twist1 humán DGCs [22, 23]. Katalógusa

Korábban kifejlesztettünk egy kettős feltételes knockout (DCKO) egértörzset, hogy az E-cadherin és a p53, amelyeket kifejezetten inaktivált a gyomorban [ ,,,0],19]. Minden DCKO egereknek végzetes DGCs egy éven belül, a fenotípus, hogy magas invazív és gyakori áttétes nyirokcsomók. Érdemes megjegyezni, hogy a gén expressziós mintázata DGCs a DCKO egerekben észlelt microarray nagyon hasonlítanak a humán primer DGCs eltérő bél is. Így a DCKO egér modell egy hatékony eszköz szerepét vizsgálva a gén funkciója a DGC karcinogenitási és a fejlődő terápiás stratégiát. Ebben a vizsgálatban, hoztuk létre Twist1 expresszió-pozitív és -negatív DGC sejtvonalak származnak a DCKO egerekben. Ennek következtében elemzés a epigenetikai változások, a közös szabályozási mechanizmusa Twist1
volt tisztázott, és értékelték mind egér és humán DGCs ebben a vizsgálatban.

Anyagok és módszerek

Etikai nyilatkozat katalógusa

Minden in vivo katalógusa eljárásokat jóváhagyta az Animal Care Bizottságának tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem (Engedély szám 0160073A). Ami a normális emberi gyomor nyálkahártyája mintákat, írásos beleegyezését adta az összes tárgyak, és a vizsgálat által jóváhagyott Etikai Bizottsága Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem (No.1115). Katalógusa

Sejtkultúrák és szövetminták

Mi korábban létrehozott egy E-cadherin /p53 DCKO ( Atp4b-Cre katalógusa ^{+ katalógusa; Cdh1 katalógusa loxP /loxP katalógusa; Trp53 katalógusa loxP /loxP katalógusa) egér modell [19]. Már a rákos szövetekben, hoztuk létre öt egér DGC sejtvonalak és elemzi azokat MDGCs (Shimada S, nem közölt megfigyelés). MDGC-1 és MDGC-3 sejteket tenyésztettünk Dulbecco-féle módosított Eagle-féle közegben (DMEM), amely magas glükóz kiegészítve 10% magzati borjúszérummal, és MDGC-7, MDGC-8 és MDGC-9-ben tenyésztettük Ham-féle F12 kiegészítve 5% ló szérumot. DNS elemzést végeztünk annak érdekében, hogy érzékeli a csonka Cdh1 katalógusa és Trp53 katalógusa allél (S1 ábra). Nyolc humán GC-sejtvonalak (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 és HSC60) is alkalmaztunk ebben a vizsgálatban. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY és KATO-III vásároltunk a RIKEN sejtbank (Tsukuba, Japán). NUGC4 és AGS sejteket nyertünk a Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japán) és az ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 sejteket kaptunk Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japán) [24]. KATO III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS és HSC60 sejteket tenyésztettünk RPMI 1640, és GCIY tenyésztettünk Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben, amely két, kiegészítve 10% magzati borjúszérummal. A de-metilezési tanulmányok, rágcsáló és humán GC sejteket naponta kezeltük 500 nM 5-aza-dezoxicitidin (5-aza-DC, Sigma; # A3656) 72 órán keresztül. Kezeltük ezeket GC sejtek 100 nM trichosztatin A (TSA, Wako;È-11993) 24 órán át, vagy 100 nM mitramicin A (Wako;„-17101) 24 órán át.}

Tizennyolc primer GC szövetekben és a megfelelő nem rákos gyomor nyálkahártyája kaptuk 15 DCKO egerekben. Ami a humán gyomor szövetek, használtuk három nem-rákos gyomor nyálkahártyája GC betegeknél. Mi is kapott öt normál gyomor nyálkahártyája be a Atp4b-Cre katalógusa ^{- www.Booked.hu; Cdh1 katalógusa loxP /loxP katalógusa; Trp53 katalógusa loxP /loxP katalógusa egereket használtuk negatív kontrollként a korábbi tanulmány [19]. Ebben a vizsgálatban, mi az úgynevezett "normális gyomor nyálkahártyája" Ha a mintákat kaptuk a kontroll egerek, és a "nem-rákos gyomor nyálkahártyája" Ha a mintákat vettünk DCKO egerek és emberi GC betegek ebben a vizsgálatban.}

Fordított transzkripció (RT) -PCR és kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR)

Teljes RNS-t izoláltunk egy RNeasy Mini kit (Qiagen;˥34), és a cDNS-t készítettünk RNS Superscript III készlet (Invitrogen;´80044), a gyártó protokollja szerint. End-pont RT-PCR a többszörös ciklus szám, 28-35 cikluson keresztül. Mint belső kontroll, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz ( GAPDH
) amplifikáltuk 21 ciklusban, hogy biztosítsák cDNS minőség és a mennyiség minden egyes RT-PCR-rel. Az amplifikált termékeket töltöttünk be 2% -os agaróz gélen, vagy mennyiségileg kvantitatív RT-PCR-LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics;/07516001). Az amplifikációs programok PCR megismételtük 40 cikluson GAPDH és 45cycles más gének kivételével GAPDH. PCR-termékeket klónoztuk pMD20 T-vektor segítségével Mighty TA-klónozó reagenskészlet (Takara Bio INC;ɚ8), majd közvetlenül szekvenáltuk. A primer szekvenciák és a PCR-termék mérete mutatja S1 táblázat.

metiiációs elemzésre

kivont genomiális DNS-t a rágcsáló és humán GC sejtvonalak a fenol-kloroformos eljárással, majd végzett biszulfit módosítását és az MSP eljárást. Biszulfit-kezeiés DNS végeztük EZ DNS metiláció-Gold (ZYMO RESEARCH; # D5006), majd a metiláció-specifikus PCR-t (MSP) végeztünk. Röviden, a PCR-reakciót végeztünk 35 cikluson át egy 25 pl keveréket, amely hidrogén-szulfit-módosított DNS-t, 2.5μl 10x PCR-puffer, 1,25 pl 25 mM dNTP-k, 25 pmol /l minden egyes primerből és 1 U JumpStart RedTaq polimeráz (Sigma; # D0563). A feltételek a PCR a következők voltak: 95 ° C-on 5 percen át; 35 ciklus 95 ° C-on 1minutes, 53 ° C-on 2minutes, és 72 ° C-on 1.5minutes; és egy végső extenzió 72 ° C-on 5 percig. Ami az egér GC szövetek, DNS-t extraháltunk formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetekben. Biszulfit-DNS-t amplifikáltuk szegélyező PCR-primerekkel, majd egymásba ágyazott MSP végeztük [25, 26]. A primer szekvenciák és a PCR-termék mérete mutatja S2 táblázatban. Katalógusa

A kromatin immunprecipitációt (chip) assay katalógusa

A chip vizsgálatot végeztünk egy chipet-IT Express kit (Active Motif;Ȓ08) szerint a gyártó protokollja. Immunprecipitált DNS dúsítás normalizáltuk, hogy a bemenet. Az antitestek, amelyek ebben a vizsgálatban az anti-hiszton H3K4me3 (aktív motívum;Ə15), anti-H3K9me3 (aktív motívum;ƍ65), anti-H3K27me3 (aktív motívum;Ƈ55), anti-H3K36me2 (ABCAM; # ab9049) , anti-SP1 (ABCAM; # ab13370), és anti-hiszton H3 (aktív motívum;Ƈ63) antitesteket. Normál nyúl IgG-t (Cell Signaling Technology;Đ9s) alkalmaztunk negatív kontrollként a chip. A primer szekvenciák és a PCR-termék mérete mutatja S2 táblázatban. Katalógusa

Knockdown analízissel kis interferáló RNS-ek katalógusa

siRNS-alapú kiütése Suv39h1 katalógusa és Suv39h2
végeztük elektroporációs (neon transzfekciós rendszer, Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. MDGC sejteket transzfektáltunk 50 nM siRNS a Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), vagy a negatív kontroll siRNS (küldetés siRNS Universal negatív kontroll, Sigma). 48 óra elteltével a tenyésztést, a sejteket összegyűjtöttük az RT-PCR, Western-blot-analízissel, a migráció, invázió, és proliferációs vizsgálati eljárásban.

Western-blot analízis

GC sejteket lizáltuk Pierce RIPA-pufferben (Thermo Scientific;΃00). A fehérjéket SDS-poliakrilamid gélen, majd polivinilidén-fluorid (PVDF) membránokra, majd inkubáltuk antitestekkel oldjuk Tris-pufferelt sóoldattal (TBS), amely 2% -os sovány tej és 10% Tween 20. A használt primer ellenanyagok ebben vizsgálatban egér monoklonális anti-Twist1 (1: 100, santa Cruz Bio-technológia; # SC-81417), nyúl poliklonális anti-SP1 (1: 200, az Active Motif;Ɔ58), és az egér monoklonális anti-α-tubulin ( 1: 200, santa Cruz, # sc-8035) antitesteket. A szekunder ellenanyagokat lúgos foszfatázzal konjugált anti-nyúl IgG-t (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6518), és anti-egér IgG-t (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6520). A blotokat ImmunoStar AP szubsztrátoldatot (Bio-Rad Laboratories;ª5018).

Immunhisztokémia

FFPE szakaszok (4

• PLoS One: A statinok mérséklik Helicobacter pylori CagA Translocation és csökkentik előfordulása gyomorrák: In Vitro és népesség alapú eset-Control Studies
• PLoS One: Az endoszkópos Rezekciós Összehasonlítva resectio Treat Korai gyomorrák: rendszeres felülvizsgálatát és meta-Analysis