PLOS ONE: méthylation de l'ADN dans la Région 1 Exon et règlement complexe de TWIST1 expression dans le cancer gastrique Cells

Résumé

TWIST1 surexpression est fréquemment observé dans divers cancers, dont le cancer gastrique (GC). Bien que méthylation de l'ADN du gène TWIST1
a été rapporté dans les cellules cancéreuses, les mécanismes sous-jacents activation de la transcription restent incertaines. Dans cette étude, nous avons d'abord examiné les modifications épigénétiques de la TWIST1
utilisant Twist1 de lignes de transcription positif et cellulaires séronégatifs qui sont dérivés de notre modèle GC de souris de type diffus établie. Traitement avec un agent de déméthylation de l'ADN 5-aza-dC réactivée TWIST1 expression dans des cellules d'expression de GC-négatives Twist1. Selon PCR spécifique de la méthylation et l'analyse de séquençage bisulfite, la méthylation dans la région riche en CpG dans les TWIST1
exon 1 codant, plutôt que sa région de promoteur, a été étroitement liée à la répression transcriptionnelle du TWIST1
expression dans des cellules de souris GC. des analyses d'immunoprécipitation de la chromatine a révélé que la marque d'histone actif H3K4me3 a été enrichie en cellules d'expression positive Twist1 et inactive marque histone H3K9me3 a été enrichie en cellules d'expression négative Twist1. Les niveaux d'expression SUV39H1
et Suv39h2
, histone méthyltransférase pour H3K9me3, étaient inversement corrélées avec TWIST1 de l'expression, et knockdown de SUV39H1
ou Suv39h2
induite TWIST1 de l'expression. En outre, Sp1 facteur de transcription lié à l'exon 1 CpG région riche en Twist1 lignées cellulaires expression positive, et TWIST1 de l'expression a été diminuée par mithramycine, qui qui interfère avec la liaison Sp1 à des séquences régulatrices riches en CpG. Nos études ont suggéré que le TWIST1 de la transcription dans les cellules du GC peut être régulée grâce à la coopération potentielle de méthylation de l'ADN, la modification des histones dans un complexe avec liaison Sp1 aux régions riches en CpG dans la région exon 1.

Citation: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) méthylation de l'ADN dans la Région 1 Exon et règlement complexe de TWIST1 expression dans les cellules du cancer gastrique. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10.1371 /journal.pone.0145630

Editeur: Tae-Young Roh, POSTECH (POSTECH), REPUBLIQUE DE COREE

Reçu le 21 Septembre 2015; Accepté 6 Décembre 2015; Publié le 22 Décembre, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Sakamoto et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Ce travail a été soutenu par des subventions-in-Aid pour la recherche scientifique (C) (24,590,444) et (A) (25253081), et le Programme Foresight A3 (AA005) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS), et la recherche pratique pour le contrôle Innovative Cancer (15Ack0106017h0002) de l'Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

intérêts concurrents: Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

abréviations:. BS, le séquençage bisulfite; CGI, îlot CpG; ChIP, immunoprécipitation chromatine; DCKO, double souris knock-out conditionnel; DGC, diffuse-type de cancer gastrique; GAPDH, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase; GC, cancer de l'estomac; H3K4me3, l'histone H3 lysine 4 tri-méthylation; H3K9me3, l'histone H3 lysine 9 de tri-méthylation; H3K27me3, l'histone H3 lysine 27 tri-méthylation; MSP, la réaction en chaîne par polymérase spécifique de la méthylation; RT-PCR, réaction en chaîne inverse polymérase-transcription; qRT-PCR, RT-PCR quantitative; STG, les gènes suppresseurs de tumeur; TSS, site de départ de la transcription; 5-aza-dC, 5-aza-2'-deoxycitidine

Introduction

TWIST1, agissant comme une hélice-boucle-hélice facteur de base de transcription, se lie directement à des éléments E-box (NCANNTGN ) sur des gènes cibles spécifiques [1]. TWIST1 est largement connu pour être essentiel pour la formation de mésoderme au cours du développement embryonnaire précoce de la drosophile et la souris [2, 3]. Dans les cancers humains, l'expression ectopique TWIST1 est rapporté à être associée à la progression maligne, l'invasion, la transition épithélio-mechencymal, les métastases et stemness, ce qui indique des fonctions oncogènes potentiels de TWIST1 [4-6]. Ainsi, il est très important de clarifier les mécanismes de régulation de la transcription pour TWIST1 dans les cellules cancéreuses.

changements épigénétiques, tels que la méthylation de l'ADN et la modification des histones, sont étroitement liées à silençage génique [7-9]. Bien que des altérations épigénétiques au CGI (île CpG) région promotrice des gènes suppresseurs de tumeurs (STG) sont bien connus pour être associés à leur inactivation génique [10], les mécanismes de régulation épigénétique des oncogènes sont mal comprises. Plusieurs groupes ont montré que TWIST1
a été réactivé par traitement avec un médicament de méthylation, 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC), dans des cellules cancéreuses [11, 12]. méthylation de l'ADN Aberrant au promoteur de CGI dans humain TWIST1
a été fréquemment détecté dans les cancers primaires, y compris du cancer gastrique (GC) [11-14]. Néanmoins, il y a beaucoup de conclusions qui méthylation de l'ADN à la la région du promoteur de TWIST1 est pas en corrélation avec l'expression du gène dans divers cancers [12, 14]. Alors que TWIST1 de la méthylation peut être un biomarqueur utile pour prédire les résultats cliniques pour la récidive et la survie chez les patients atteints de cancers [12, 13, 15], il reste controversé si le TWIST1
méthylation au niveau de la région promotrice entraîne l'inactivation du gène.

la régulation transcriptionnelle des gènes est en corrélation avec les modèles de la lysine (K) de la méthylation dans la queue d'histone qui se composent de trois états lysine de méthylation différentes (mono-, di- et tri-). Tri-méthylation de H3K4 (H3K4me3) est liée à l'activation des gènes et celle de H3K9me3 et H3K27me3 gène de répression [7-9]. Bien que ces modèles H3-de methyaltion trois histones sont liées à CGI méthylation ainsi, les mécanismes de régulation de la transcription pour TWIST1
sous-jacente la modification des histones sont mal compris dans les cellules cancéreuses.

GC est le deuxième plus fréquent cause de décès par cancer dans le monde [16]. GC est classé en deux principaux types histologiques; diffus et intestinale, ce qui a deux voies distinctes cancérigènes [17]. cancer gastrique de type diffus (DGC) est connu pour montrer l'invasion et les métastases fréquentes, ce qui entraîne un mauvais pronostic [18]. Perte de la E-cadhérine et p53 a été rapporté dans le type diffus carcinogenèse gastrique [19-21]. Plusieurs rapports ont montré une surexpression fréquente de TWIST1 en DGCS humains [22, 23].

Nous avons déjà conçu un KO à double condition (DCKO) de la ligne de la souris à la E-cadhérine et p53, qui sont spécifiquement inactivé dans l'estomac [ ,,,0],19]. Toutes les souris DCKO développés DGCS mortels d'ici un an, les phénotypes étant élevé invasivité et les métastases fréquentes vers les ganglions lymphatiques. Il est à noter que les profils d'expression génique de DGCS chez les souris DCKO détectées sur l'analyse de puces à ADN ont été très semblables à ceux de DGCS primaires humaines autres que l'intestin. Ainsi, notre modèle de souris DCKO est un outil puissant pour étudier le rôle de la fonction des gènes dans la cancérogenèse DGC et pour développer une stratégie thérapeutique. Dans cette étude, nous avons établi des lignées de cellules GCR TWIST1 expression-positifs et séronégatifs qui sont dérivés des souris DCKO. En conséquence de l'analyse des altérations épigénétiques, le mécanisme réglementaire commun de TWIST1
a été élucidé, et évalué dans les deux murines et humaines DGCS dans cette étude.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

Tous in vivo
procédures ont été approuvées par le Comité de Tokyo Université médicale et dentaire (Permission n ° 0160073A) animal Care. Comme pour les échantillons des muqueuses gastriques humains normaux, le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les sujets, et l'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de Tokyo Université médicale et dentaire (No.1115).

cultures et des échantillons de tissu cellulaire

Nous avons déjà établi un E-cadhérine /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) modèle de souris [19]. De ses tissus cancéreux, nous avons établi cinq lignées cellulaires de souris GCR et les MDGCs nommé (Shimada S, observation non publiée). MDGC-1 et les cellules MDGC-3 ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant du glucose élevé supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10%, et MDGC-7, MDGC-8 et MDGC-9 ont été cultivées dans du milieu F12 de Ham supplémenté avec 5% sérum de cheval. analyse de l'ADN a été réalisée afin de détecter l'tronqué Cdh1
et Trp53 de allèles (S1 Fig). Huit lignées de cellules humaines GC (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 et HSC60) ont également été utilisés dans cette étude. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY et KATO-III ont été achetés chez RIKEN banque de cellules (Tsukuba, Japon). cellules NUGC4 et AGS ont été obtenues auprès du Human Sciences Research Resources Bank (Osaka, Japon) et ATCC (American Type Collection Cell). cellules HSC60 ont été obtenus du Dr Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japon) [24]. cellules KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS et HSC60 ont été cultivées dans du RPMI 1640, et GCIY a été cultivé dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco, tous deux ont été complétées avec du sérum de veau fœtal à 10%. Pour les études de méthylation, de souris et des cellules humaines GC ont été traitées quotidiennement avec 500 nM de 5-aza-désoxycytidine (5-aza-dC, Sigma, # A3656) pendant 72 heures. Nous avons traité ces cellules avec 100nM GC trichostatine A (TSA, Wako;È-11993) pendant 24 heures ou 100 nM mithramycine A (Wako;„-17101) pendant 24 heures}

Dix-huit tissus GC primaire et correspondante. muqueuses gastriques non cancéreuses ont été obtenues à partir de 15 souris DCKO. En ce qui concerne les tissus de l'estomac de l'homme, nous avons utilisé trois muqueuses gastriques non-cancéreuses de patients atteints de GC. Nous avons également obtenu cinq muqueuses gastrique normale de Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
souris qui ont été utilisés comme témoins négatifs dans notre précédente étude [19]. Dans cette étude, nous avons appelé "mucosae normale gastrique" si les spécimens ont été obtenus à partir de souris témoins, et "les muqueuses gastriques non-cancéreux" si les spécimens ont été obtenus à partir de souris DCKO et les patients du GC humains dans cette étude.}

transcription inverse (RT) -PCR et RT-PCR quantitative (qRT-PCR)

ARN total a été isolé avec un kit RNeasy (Qiagen;˥34) et l'ADNc a été préparé à partir d'ARN en utilisant un kit SuperScript III (Invitrogen;´80044) selon les protocoles du fabricant. Point final RT-PCR réalisée avec un nombre de cycles multiples, 28-35 cycles. En tant que contrôle interne, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase ( GAPDH
) a été amplifié avec 21 cycles pour assurer la qualité et la quantité d'ADNc pour chaque RT-PCR. Les produits amplifiés ont été chargés à 2% de gels d'agarose ou quantifiés par RT-PCR quantitative en utilisant le LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics;/07516001). Les programmes d'amplification pour PCR ont été répétées pendant 40 cycles pour Gapdh et 45cycles pour d'autres gènes, sauf pour Gapdh. Les produits de PCR ont été clones dans le vecteur T pMD20 en utilisant un kit de clonage TA de Mighty (BIO INC TaKaRa;ɚ8) et ensuite séquencées directement. Les séquences d'amorce et les tailles des produits de PCR sont indiqués dans le tableau S1.

Méthylation Analyse

Nous avons extrait l'ADN génomique de souris et des lignées de cellules humaines CG par la méthode au phénol-chloroforme, puis effectuer bisulfite la modification et la procédure MSP. Le traitement au bisulfite de l'ADN a été réalisée avec EZ méthylation de l'ADN-Gold (RECHERCHE Zymo; # D5006), et a été menée alors PCR (MSP) spécifique de la méthylation. En bref, la réaction de PCR a été réalisée pendant 35 cycles dans un mélange de 25 ul comprenant de l'ADN au bisulfite modifié 2.5μl de tampon de PCR 10X 1,25 ul de 25 mM de dNTP, 25 pmol /l de chaque amorce et 1 U de JumpStart RedTaq polymérase (Sigma; # D0563). Les conditions de PCR étaient les suivantes: 95 ° C pendant 5 minutes; 35 cycles de 95 ° C pendant 1 minute, 53 ° C pendant 2 minutes et 72 ° C pendant 1,5 minutes; et une extension finale à 72 ° C pendant 5 minutes. En ce qui concerne les tissus GC de souris, l'ADN a été extrait des tissus (FFPE) inclus dans la paraffine fixés au formol. Bisulfite ADN a été amplifié avec des amorces de PCR flanquant et MSP puis imbriqué a été réalisée [25, 26]. Les séquences d'amorces et la taille des produits de PCR sont présentés dans le tableau S2

chromatine immunoprécipitation (ChIP) dosage

Le test de ChIP a été réalisée en utilisant un kit ChIP-IT Express (Active Motif;Ȓ08). selon le protocole du fabricant. l'enrichissement de l'ADN immunoprécipité a été normalisée à l'entrée. Les anticorps utilisés dans cette étude étaient anti-histone H3K4me3 (Active Motif,Ə15), (Active Motif,ƍ65) anti H3K9me3, anti-H3K27me3 (en Active Motif,Ƈ55), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) anti-Sp1 (Abcam; # ab13370) et (active Motif,Ƈ63), l'anti-histone H3 anticorps. lapin normal IgG (Cell Signaling Technology;Đ9s) a été utilisé comme témoin négatif pour ChIP. Les séquences d'amorces et la taille des produits de PCR sont présentés dans le tableau S2.

Analyse Knockdown utilisant de petits ARN interférents

knockdown à base de siRNA-de SUV39H1
et Suv39h2
a été réalisée en utilisant un (système de transfection au néon, Invitrogen) électroporation selon les instructions du fabricant. cellules MDGC ont été transfectées avec 50 nM siRNA de SUV39H1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), ou siRNA contrôle négatif (Mission siRNA Universal Negative Control, Sigma). Au bout de 48 heures en culture, les cellules ont été récoltées pour la RT-PCR, l'analyse par transfert de Western, la migration, l'invasion et essai de prolifération.

Analyse Western Blot

GC cellules ont été lysées avec un tampon RIPA Pierce (Thermo scientifique;΃00). Les protéines ont été séparées sur des gels de SDS-polyacrylamide, puis transférés au fluorure de polyvinylidène (PVDF) membranes, suivie d'une incubation avec des anticorps dissous dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) contenant 2% de lait écrémé et de 10% de Tween 20. Les anticorps primaires utilisés dans cette étude étaient monoclonal de souris anti-TWIST1 (1: 100, Santa Cruz Bio-technologie, # sc-81417), anticorps polyclonal de lapin anti Sp1 (1: 200, Motif actif;Ɔ58) et anticorps monoclonal de souris anti-α-tubuline ( 1: 200, Santa Cruz; # sc-8035) anticorps. Les anticorps secondaires étaient alcaline IgG anti-lapin conjugué à la phosphatase (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,ª6518) et des IgG anti-souris (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,ª6520). Les transferts ont été développés avec ImmunoStar AP Substrate (Bio-Rad Laboratories;ª5018)

immunohistochimie

sections FFPE (4 uM) ont été déparaffinées dans le xylène, réhydratés dans des solutions d'éthanol graduées, puis la récupération Antigen. a été réalisée dans un tampon d'acide citrique à 10 mM par micro-ondes. L'immunohistochimie a été réalisée en utilisant des anticorps anti-Twist1 (Santa Cruz, 1:20) comme décrit précédemment [19]. Expression de TWIST1 a été définie comme une coloration nucléaire positive dans plus de 10% des cellules, et l'intensité a été marqué as- (négatif), + (faible) et ++ (modérée à forte) par trois enquêteurs indépendamment.

Résultats

expression TWIST1 dans murin et des lignées de cellules humaines GC

de tissus GCR de souris DCKO, transcription positif cellules des lignes de Twist1 (MDGC-7, MDGC- 8 et MDGC-9) et les lignées cellulaires négatives (MDGC-1 et MDGC-3) ont été mis en place (figure 1A et la figure S2A) et l'expression de la protéine a été confirmée TWIST1 dans chaque lignée cellulaire (figure 1B). TWIST1 expression a été renforcée aux niveaux d'ARNm et de protéines dans les cellules MDGC d'expression négative Twist1 après le traitement par déméthylation de l'ADN agent de 5-aza-dC (Figure 1C et 1D), tandis que son expression n'a pas été modifié après un traitement avec un inhibiteur d'histone désacétylase TSA (SA2 Figue). Dans les huit lignées de cellules GC humains examinés, TWIST1 de l'expression a été downregulated dans quatre lignées cellulaires (figure 1E, à gauche), trois (KATO-III, GCIY et AGS) qui montre la ré-activation de TWIST1 de l'expression après le traitement avec 5-aza-dC par RT-PCR (exemple, la figure 1E, à droite). Comme pour Les lignées de cellules GC d'expression positive de Twist1, après 5-aza-dC traitement, 2.1- et 3,2 fois la régulation de TWIST1
a été détecté dans MKN45 et MKN7, respectivement, par qRT-PCR, alors que l'expression TWIST1 n'a pas été modifiée dans le MDGC-9 cellules (Fig 1F).

CGI méthylation et l'expression de TWIST1
en GC lignées cellulaires

TWIST1
a une région CGI dense à partir du promoteur à l'ensemble de l'exon 1, cette région étant fortement conservée chez les vertébrés, y compris les souris et l'homme (S3 figure). Pour clarifier le CGI dans la souris et humain TWIST1
, nous avons effectué une analyse informatique utilisant le navigateur UCSC Genome (http://genome.ucsc.edu/index.html) et MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /) qui est largement utilisé comme identification de CGI et des amorces MSP [27]. Nous avons analysé environ 1,4 kb région comprenant le promoteur et la totalité de l'exon 1. Le navigateur UCSC Genome sur la souris et l'analyse humaine présentait une CGI dans la région examinée (données non présentées). Cependant, les deux sites putatifs CGI ont été détectés dans la région de la souris et humain quand on a utilisé les critères de CGI avec une teneur en GC de 50% et a observé /attendu rapport CpG de 0,8 par MethPrimer (figure 2A et 2C). Ces deux régions CGI putatifs ont été localisés au niveau du promoteur et l'exon 1. Etant donné que la méthylation au niveau de la région promotrice a été rapportée dans divers cancers humains [12, 14], nous avons d'abord examiné l'état de méthylation au niveau de la région dans murin et les lignées cellulaires GC humaines par MSP. Cependant, l'état de méthylation dans la région promotrice de TWIST1
ne correspondait pas à son expression dans des lignées cellulaires de GC a examiné (région P1, figure 2A). Pour déterminer les régions méthylés critique associées à l'expression dans les cellules TWIST1 MDGC, nous avons encore réalisé MSP dans la région de CGI dans l'exon 1 (E1-1, E1-2 et E1-3), et le site de la rive CpG prédite située à environ 1,6 kb à partir TSS (site de transcription de démarrage, S1) (figure 2A). En conséquence, CGI méthylation dans la région (E1-1 et E1-2) autour du TSS dans TWIST1
exon 1 a été trouvé pour correspondre à l'expression du gène dans les cellules MDGC, bien qu'il n'y avait pas de corrélation entre elles dans la région prédite à terre (S1) et l'extrémité de la région de l'exon 1 (E1-3) (figure 2B, à gauche) dans des cellules MDGC. Aucune méthylation a été détectée à des régions CpG dans trois muqueuses gastrique normale sans expression TWIST1 de Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
souris (figure 2B). Dans les muqueuses gastriques humaines, no TWIST1 de la méthylation a également été trouvée dans trois muqueuses gastriques non-cancéreuses de patients atteints de GC (figure 2D) dont l'une a montré très faible expression (données de Twist1 non représentés ). Nous avons également examiné quatre muqueuses gastrique non-cancéreuse supplémentaire des patients du GC, alors qu'aucune méthylation a été détectée à la région E1-2 dans tous les cas (données non présentées). séquençage bisulfite (BS) a démontré que la région de CGI dans l'exon 1 a montré méthylation dense dans Twist1 MDGC-3 cellules d'expression négative mais pas dans TWIST1 positif MDGC-9 cellules (BS-c, la figure 2A et 2B, à droite), alors qu'il avait aucune différence dans les modèles de méthylation entre eux à la rive CpG et les régions du promoteur (BS-a et BS-b, S4A Fig). Parmi les lignées de cellules humaines, GC KATO-III et GCIY sans TWIST1 de l'expression a montré dense méthylation de CGI dans la région de l'exon 1 (E1-2) qui est compatible avec ceux de la souris TWIST1
(Fig 2C et 2D, à gauche). À la fois la méthylation et la méthylation de la région E1-2 ont été détectés dans les cellules MKN45 et MKN7 par MSP et le séquençage au bisulfite (figure 2D), qui sont exprimés basal TWIST1 mais leurs niveaux d'expression ont été augmentés après le traitement 5-aza-dC (fig 1F). Ainsi, nos données indiquent que la méthylation dans la région exon 1 de TWIST1
détectés dans cette étude est corrélée à son expression.}

la méthylation et l'expression de TWIST1 en DCKO souris GC des échantillons de tissus

Nous avons examiné l'état de méthylation de TWIST1
utilisant 18 tissus GC primaires de 15 souris DCKO. Parce que les régions du GC étaient très petites et leur ADN à partir d'échantillons FFPE ont montré des concentrations faibles, nous avons effectué MSP imbriquée [25, 26]. TWIST1
était significativement méthylé (9/18, 50%) en glucocorticoïdes primaire par rapport à des tissus non cancéreux (1/10, 10%) correspondant, étant une différence statistiquement significative (P < 0,05, tableau 1). Les données représentatives de MSP sont représentés sur la figure 3A. Parmi eux, 4 sur 10 (40%) des cas étaient intramuqueux et 5 de 8 (62,5%) étaient invasive GCS (tableau 1). Dans cette étude, Les cas de méthylation positif de Twist1 démontré bandes MSP non méthylés et qui, en raison de la présence de stroma /fibroblaste normal et des cellules inflammatoires dans les coupes de tissus du cancer, bien que nous ne pouvions pas nier la possibilité de méthylation partielle comme MKN45 et MKN7 et de l'hétérogénéité de la tumeur.

TWIST1 expression de la protéine a été détectée dans 7 sur 18 (38,9%) par rapport à GCS correspondant muqueuse gastrique non-cancéreuse par immunohistochimie. images représentatives sont représentées sur la figure 3B. Nous avons analysé davantage la relation entre expression et de méthylation niveaux
Twist1 dans ces cas. Parmi les 18 GC primaire examiné, neuf cas ont montré une corrélation entre les la méthylation et l'expression de TWIST1 (figure 3C). Trois des quatre cas avec TWIST1 faible expression présentait sa méthylation, peut-être que la faible expression de TWIST1 peut être causée par sa méthylation. Cependant, cinq autres cas ne présentaient pas de méthylation et d'expression (tableau 1).

Histone méthylation est liée à la régulation de la TWIST1 de l'expression

Nous avons ensuite cherché à savoir si oui ou non le lysine niveau de l'histone H3 de méthylation contribue à l'expression
TWIST1. immunoprécipitation (ChIP) essais chromatine ont été effectuées sur le rivage prédit CpG (CP1.3k), promoteur (CP1), et exons 1 2 (CE2) régions (figure 2A) (CE1-1 et CE1-2) et. Aux régions CP1 et CE1-2, marque histone actif H3K4me3 a été enrichie en cellules d'expression positive Twist1 (MDGC-7 et MDGC-9), mais inactive marque histone H3K9me3 a été enrichie en cellules d'expression négative Twist1 (MDGC-1 et MDGC -3) (figure 4A et 4B). essais ChIP ont présenté à la fois des signaux H3K9me3 H3K4me3 et MDGC-1 et-3 MDGC cellules avec 5-aza-dC traitement, ce qui indique le niveau H3K4me3 élevées dans ces cellules (figure 4C). Au contraire, les niveaux H3K27me3 et H3K36me2 ne sont pas corrélés avec l'expression TWIST1 dans toutes les cellules MDGC examinés dans cette étude. Comme pour les lignées cellulaires de GC humaines, une région similaire située à partir du promoteur à l'exon 1 a montré l'enrichissement H3K4me3 dans Twist1 de MKN45 cellules d'expression positive et H3K9me3 dans expression négative KATO-III
TWIST1 cellules (figures 2C et 4D).

SUV39H1
et Suv39h2
, une méthyltransférase histone, réglemente H3K9me3

Il y a beaucoup d'histone méthyltransférase associée avec H3K4, H3K9 et H3K27 [28]. Par conséquent, pour déterminer quels histone modification enzymes sont responsables de l'enrichissement H3K4me3 ou H3K9me3 au TWIST1
exon 1 région dans les cellules du GC, nous avons examiné dix H3K4me3 ( Mll1
, MLL2
, Mll3
, MLL4
, Setd1a
, Setd1b
, ASH1
, Ash1l
, SMYD3
et Meisetz
), sept H3K9me3 ( SUV39H1
, Suv39h2
, G9a
, SETDB1
, Clld8
, Glp
et Riz1
) et un H3K27me3 ( Ezh2
) gènes liés. Des données représentatives sont représentées sur la figure 5A. Parmi eux, les niveaux d'expression SUV39H1
et Suv39h2
ont été inversement corrélée avec l'expression
TWIST1. Cependant, les niveaux de 16 autres gènes d'histone methylatasferase examinés d'expression ne sont pas associés à TWIST1
expression dans les cellules MDGC. Nous avons effectué knockdown à base de siRNA-de SUV39H1
ou Suv39h2
dans les MDGC-1 et MDGC-3 cellules d'expression positive respectives par électroporation (figure 5B). Knockdown de SUV39H1
ou Suv39h2
dans ces lignées de cellules conduit à une augmentation de TWIST1 de l'expression observable sur RT-PCR (figure 5B) et qRT-PCR (MDGC- 1, Fig 5C)

Association des Sp1 avec la régulation transcriptionnelle de TWIST1

le consensus 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /a) (C /T) -3 'séquence est connue sous le motif de liaison du facteur de transcription Sp1 et une relation entre la méthylation et Sp1 CGI de liaison au niveau du promoteur a été rapporté [29, 30]. Plusieurs sites de liaison Sp1 ont été prévus dans la région riche en CpG dans les TWIST1
exon 1 avec TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) et JASPAR (http://jaspar.binf.ku.dk) . Le rôle de Sp1 dans la transcription de TWIST1
a ensuite été examiné en référence à la modification épigénétique du gène. Nous avons détecté l'expression de Sp1 ARNm et la protéine dans toutes les cellules murines et GC humaine examinés, même dans les cellules d'expression négative MDGC-1, MDGC-3, KATOIII et GCIY Twist1 (figure 6A).

Pour déterminer si Sp1 lie pas aux régions du promoteur
TWIST1 et l'exon 1 dans des cellules GC, nous avons réalisé le dosage de ChIP Sp1 MDGC en utilisant des cellules (figure 2A). Sp1 lié aux régions du TWIST1
promoteur (CP1) et l'exon 1 (CE1-2) dans des lignées cellulaires Twist1 expression positive (MDGC-7 et MDGC-9) (figure 6B). En revanche, les lignées cellulaires Twist1 expression négative (MDGC-1 et MDGC-3) ont montré des niveaux indétectables de Sp1 signaux de liaison au niveau des régions CP1 et CE1-2. Sp1 ne se lie pas à toutes les régions de la rive prédit CpG (CP1.3k) et l'exon 2 régions (CE2) dans ces cellules expression-positives et séronégatifs Twist1 MDGC. Déméthylation avec 5-aza-dC a augmenté de liaison Sp1 au promoteur et exon 1 régions
Twist1 dans les MDGC-1 et MDGC-3 cellules d'expression négative Twist1 (figure 6B). Mithramycine A est connu pour interférer avec la liaison Sp1 à des séquences régulatrices riches en CpG [31, 32]. Il a été noté que TWIST1 de l'expression a été régulée à la baisse après le traitement avec la mithramycine A dans ses cellules GC expression positive (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 et MKN45 cellules) (Fig 6C et S6 Fig). Mithramycine A n'a montré aucun effet sur l'expression Sp1 dans ces cellules (données non montrées). Up-régulation de TWIST1
par 5-aza-dC a diminué de mithramycine Un traitement dans MDGC-3 cellules (P = 0,04, figure 6D).

Discussion

Les mécanismes sous-jacents de la régulation épigénétique de l'oncogène sont mal comprises. La relation entre l'état de méthylation dans les régions promotrices
Twist1 et l'expression de TWIST1
est controversée, et il y a presque aucun des rapports sur la modification des histones modifiées dans l'expression
TWIST1. Ainsi, il reste incertain si oui ou non les changements épigénétiques sont liés à TWIST1
activation dans les cellules cancéreuses. Alors que de nouvelles conclusions de cette étude, nous avons élucidé le TWIST1
mécanisme de régulation qui sous-tend la machinerie épigénétique fondamentale qui méthylation de l'ADN, la modification des histones et agir Sp1 de concert avec l'expression TWIST1 dans les cellules du GC.

Il est largement connu que méthylation de l'ADN dans la région du promoteur CGI est critique pour le silençage des gènes, et les résultats de la méthylation aberrante CGI dans la perte de l'expression de divers STG [10]. TWIST1 a été réactivé dans les cellules murines et humaines GC avec 5-aza-dC traitement dans cette étude, ce qui indique que l'activation de la transcription de TWIST1 est également modulée par la méthylation de l'ADN. CGI méthylation du la région du promoteur de TWIST1 a été trouvé dans divers cancers tels que gastriques, du sein, colorectal et du poumon ceux [11, 12, 14], dont la plupart ont montré aucune corrélation entre TWIST1
méthylation et d'expression. Nous avons observé que CGI méthylation TWIST1
exon 1 autre que dans la région du promoteur correspondu à son expression génique dans des cellules GC de la souris. Comme pour les lignées cellulaires de GC humaines, Twist1 les lignées cellulaires expression négative étaient entièrement méthylé, mais ses lignées cellulaires expression positive exposées à la fois la méthylation et méthylation de TWIST1
, qui régulés à la hausse TWIST1 de l'expression après le traitement 5-aza-dC (Fig 1F). Ces données indiquent que les cellules MKN45 et MKN7 ont montré partiellement méthylation de TWIST1
et demi-niveaux de TWIST1 de l'expression ont été basally détectés dans ces cellules, qui ont été exprimées à partir non méthylé allèle d'ADN. Des rapports récents indiquent que CpG shore méthylation est liée à l'expression du gène [7, 33]. Cependant, l'état de méthylation dans la région prédite du site de rivage CpG n'a pas été corrélée avec l'expression
TWIST1. Nos données indiquent que TWIST1
est épigénétique réduit au silence par méthylation de l'ADN dans murines et cellules GC humain lignes.

Selon l'analyse computationnelle de la souris et CGIs humain à partir du promoteur à l'ensemble de la région codante dans la gène TWIST1 de deux régions de CGI putatifs ont été localisés au niveau du promoteur et l'exon 1 par analyse MethPrimer. Ici, nous avons observé que CGI méthylation à l'exon 1, plutôt que de sa région de promoteur, a été corrélée avec TWIST1
expression dans les cellules du GC. De tels schémas distincts de méthylation associés au silençage génique ont été rapportés dans plusieurs gènes [26, 34, 35]. Par exemple, SOX2
et AP2α
exposées putatifs deux CGIs au promoteur et l'exon 1, et la méthylation dans la région exon 1 a montré une corrélation significative à son expression génique dans GCS et du sein cancers [34, 35]. Il a été rapporté que CGI méthylation autour du site d'initiation de la traduction dans la chaîne bêta de récepteur de l'acide rétinoïque (RAR-ß), le gène considérablement correspond à son expression dans les cancers du poumon de souris par rapport à la méthylation à la région promotrice située dans la même CGI [26]. Ainsi, nos données suggèrent que CGI méthylation dans la région exon 1 dans TWIST1
est important à son silençage génique dans les cellules du GC. Cependant, on ne sait pas le mécanisme de cette méthylation discordants entre le promoteur et les régions d'exon 1. Plusieurs sites de liaison de facteur de transcription, tels que des éléments Sp1 et la modification des histones ont été rapportés pour protéger CGI méthylation [36, 37]. Il est important d'examiner ces éléments et de la machinerie épigénétique dans les régions de CGI de TWIST1
plus.

Dans primaire GCS de souris DCKO, 50% des glucocorticoïdes présentait la méthylation
TWIST1 par MSP imbriqué. Nos souris DCKO montrent pariétale foyers atypiques liés à des cellules dans l'estomac, et DGCS intramuqueux composées de cellules différenciées et des cellules mal anneau sigillaire souvent détectés à 6 mois. Par conséquent, nous avons déjà proposé que les DGCS chez les souris DCKO développées par la lignée des cellules pariétales [19]. TWIST1
a été méthylé dans 40% des cancers intramuqueux, tandis que la fréquence de la méthylation dans les muqueuses gastriques non cancéreuses, y compris les foyers atypique était rare (10%), ce qui indique que TWIST1 de la méthylation est un début événement dans DGC cancérogenèse dans notre modèle de souris. Parmi les 18 glucocorticoïdes primaires examinés, cinq cas étaient tous deux TWIST1
methylation- et d'expression négative.

• PLOS ONE: Statins Attenuate Helicobacter pylori CagA translocation et de réduire l'incidence du cancer gastrique: In Vitro et de la population-Based Case-Control Studies
• PLOS ONE: Résection Endoscopic En comparaison avec gastrectomie pour traiter précoce du cancer gastrique: Une revue systématique et méta-analyse