Plos ONE: DNA metilacije v Exon 1 regije in Complex Uredba Twist1 izražanja želodčnega raka Cells

Povzetek

Twist1 prekomerno pogosto opazili pri različnimi vrstami raka, vključno z rakom želodca (GC). Čeprav je bila DNA metilacija s Twist1
gena poročali v rakavih celicah, mehanizme, povezane transkripcijski aktivacijo negotov. V tej raziskavi smo najprej preučiti epigenetski spremembe za Twist1
uporabo Twist1
prepisu pozitivnih in -negativno celične linije, ki so izpeljani iz naše sedež difuzna tipa modela GC miške. Zdravljenje z DNA demetilacija sredstva 5-aza-DC-ponovno aktivira Twist1 izražanja v Twist1 GC celicah izražanja negativnih. Po metilacije specifične PCR in bisulfita analizi zaporedja, metilacije na CpG-bogate regije v Twist1
kodiranje eksonu 1, namesto njenega promotorja regiji, je bila tesno povezana z transkripcijske utišanje Twist1
izraz v miš GC celicah. Kromatin imuno testi so pokazali, da je bila aktivna histonov znamka H3K4me3 obogaten Twist1 izražanja pozitivnih celic, in neaktivni histonov znamka H3K9me3 je obogaten z Twist1 izražanja negativnih celic. Ravni izraz za Suv39h1
in Suv39h2
, histonske metiltransferaz za H3K9me3 bilo obratno povezana z Twist1
izraz, in rasklapanje za Suv39h1
ali Suv39h2 PODJETJA
povzroča Twist1
izraz. Poleg tega Sp1 transkripcijski faktor vezan na ekson 1 CpG bogate regije v Twist1 izražanja pozitivnih celičnih linijah, in Twist1
izraz zmanjšalo za mitramicina, ki da moti Sp1 vezavo na CpG bogati regulatornih zaporedij. Naše študije kažejo, da je Twist1
prepis v GC celicah lahko urejeno z morebitno sodelovanje metilacije DNA, histon spremembe v kompleksu z Sp1 veže na CpG-bogatih regij v regiji eksonu 1.

citat: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada s, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka s (2015) DNA metilacije v Exon 1 regije in Complex uredba Twist1 izražanja v želodcu rakavih celic. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630

Urednik: Tae-Young Roh, Pohang univerza za znanost in tehnologijo (POSTECH), Republika Koreja

Prejeto: 21. september, 2015; Sprejeto: 6. december 2015; Objavljeno: 22. december 2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. To delo je bilo podprto z nepovratnimi sredstvi v obliki pomoči za znanstvene raziskave (C), (24590444) in (A), (25253081), ter predvidevanja programa A3 (AA005) z Japonsko društvo za promocijo znanosti (JSP) in praktičnega raziskave za inovativna obvladovanje raka (15Ack0106017h0002) iz Japonske agencije za medicinske raziskave in razvoj, Amed; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

konkurenčnih interesov: avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Kratice:. BS, bisulfita zaporedja; CGI, CpG otok; Čip, kromatin imunoprecipitacije; DCKO dvakrat pogojno knockout miši; DGC, difuzna tipa rak želodca; GAPDH, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze; GC, želodčni rak; H3K4me3, histon H3 lizin 4 tri-metilacija; H3K9me3, histon H3 lizin 9 tri-metilacija; H3K27me3, histon H3 lizin 27 tri-metilacija; MSP, metilacija specifične verižne reakcije s polimerazo; RT-PCR, reverzno transkripcijo-polimerazo verižno reakcijo; QRT-PCR, kvantitativno RT-PCR; ZTP, zaviralnih genov; TSS, prepis start mestu; 5-aza-DC, 5-aza-2'-deoksicitidin

Uvod

Twist1, ki deluje kot osnovno helix-loop-helix transkripcijski faktor, neposredno veže na E-box elementov (NCANNTGN ) o posebnih ciljnih genov [1]. Twist1 je splošno znano, da je ključnega pomena za oblikovanje mezoderma času zgodnjega razvoja zarodka Drosophile in miško [2, 3]. V človeških raka, se zunajmaternične Twist1 izraz poročali, da je povezana z malignim napredovanja, invazije, epitelijskih-do-mechencymal tranzicije, metastaz in stemness, kar kaže na potencialne onkogeni funkcije Twist1 [4-6]. Zato je zelo pomembno, da se pojasni transkripcijske regulatorne mehanizme za Twist1 v rakavih celicah.

epigenetske spremembe, kot metilacije DNA in histon spremembe, ki so tesno povezana z genskim utišanje [7-9]. Čeprav so epigenetske spremembe na CGI (CpG otok) promotorja regiji zaviralnih genov (ZTP) dobro znano, da so povezani z njihovim genskim inaktivacijo [10], so mehanizmi epigenetske regulacije onkogeni slabo razumljen. Več skupin so pokazale, da je Twist1
je ponovno aktivira z obdelavo z de-metilacijskega drog, 5-aza-2'-deoksicitidin (5-aza-DC), pri rakavih celic [11, 12]. Aberrant metilacija DNK na promotor CGI v človeški Twist1
je pogosto odkrijejo primarnega raka, vključno z rakom želodca (GC) [11-14]. Kljub temu pa obstaja veliko ugotovitev, da je DNA metilacija na Twist1
promotor regija ni povezana z izražanjem gena v različnih raka [12, 14]. Medtem ko je Twist1
metilacija lahko koristna biomarker napovedati klinične rezultate glede ponovitve in preživetje pri bolnikih z raka [12, 13, 15], je še vedno sporno, ali je Twist1
metilacijo v promotorski regiji povzroči utišanje gena.

ureditev Transkripcijska genov je v korelaciji z lizin (k) metilacijo vzorcev v histon repa, ki so sestavljeni iz treh različnih lizin metilacijo stanj (mono-, di- in tri-). Tri-metiliranjem H3K4 (H3K4me3) povezan z aktiviranjem genov, in da iz H3K9me3 in H3K27me3 genu zatiranje [7-9]. Čeprav so te tri histonske vzorce H3-methyaltion povezana s CGI metilacije, kot tudi, da transkripcijske regulatorne mehanizme za Twist1
temelji histonov sprememba se slabo razume v rakavih celicah.

GC je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu [16]. GC je razvrščena v dve glavni histoloških tipov; razširjen in črevesne, ki sta dve različni rakotvorne poti [17]. rak želodca difuzna-type (DGC) je znano, da pokažejo pogosto invazijo in metastaze, kar ima za posledico slabo prognozo [18]. Izguba E-kadherina in p53 so poročali pri difuzni tipa želodca rakotvornost [19-21]. Več poročil pokazala, pogosto čezmerno Twist1 človeških DGCs [22, 23].

smo že izdelan dvojni pogojno Knockout (DCKO) miška linije kot na E-kadherina in p53, ki so posebej inaktivirani v želodcu [ ,,,0],19]. Vse DCKO miši razvilo usodne DGCs v enem letu, se fenotipov pri čemer visoka invazivnost in pogosto metastaze na bezgavke. Omeniti je treba, da so genski izraz vzorci DGCs v miših DCKO odkritih analize mikromrež zelo podobne tistim iz človeških razen črevesnih tistih primarnih DGCs. Tako je naš DCKO modela miši je močno orodje za preiskovanje vloge funkcijo genov v DGC rakotvornosti in za razvoj terapevtske strategije. V tej študiji smo ugotovili, Twist1 izraz pozitivne in -negativno DGC celične linije, ki so pridobljene iz miši DCKO. Kot posledica analize epigenetskih sprememb, je bil pojasnjen skupni regulativni mehanizem Twist1
in ovrednotena v obeh mišjih in človeških DGCs v tej študiji.

Materiali in metode

Etika Izjava

Vse in vivo
postopke je odobril odbor za živali Care Tokyo zdravstvenih in zobozdravstvenih univerze (gradivo št 0160073A). Kot je za normalne človeške želodčne sluznice vzorcev, je bilo napisano privolitev pridobljena iz vseh predmetov, in študija je odobril Odbor za etiko Tokyo zdravstvenih in zobozdravstvenih University (No.1115).

celičnih kultur in vzorce tkiva

smo že vzpostavili E-kadherina /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) mouse model [19]. Od svojih rakavih tkiv, smo ugotovili, pet miš DGC celičnih linij in jih poimenovali MDGCs (Shimada S, neobjavljenih opazovanje). MDGC-1 in celice MDGC-3 gojimo v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle stranke (DMEM), ki vsebuje visoke koncentracije glukoze, dopolnjenega z 10% fetalnega govejega seruma in MDGC-7, MDGC-8 in MDGC-9 smo kultivirali v F12 Ham je dopolnjen s 5% konjskega seruma. Analiza DNK je bila izvedena z namenom, da se ugotovi skrajšani Cdh1
in Trp53
alelov (S1 Slika). Osem človekovih GC celične linije (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 in HSC60), so bili uporabljeni tudi v tej študiji. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY in KATO-III so bile kupljene od RIKEN celične banke (Tsukuba, Japonska). NUGC4 in AGS celice smo pridobili iz Human Science Research vire banke (Osaka, Japonska) in ATCC (ameriški tip Collection Cell). HSC60 celice smo pridobili iz dr Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokio, Japonska) [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS in HSC60 celice smo gojili v RPMI 1640, in GCIY je kultivirani v spremenjeni mediju Dulbeccovem Eagle je, ki sta bila dopolnjena z 10% fetalnega govejega seruma. Za študij de-metilacijo, glodalskega in GC celicami smo obdelali dnevno 500nm 5-aza-deoksicitidin (5-aza-DC Sigma; # A3656) za 72 ur. obravnavajo smo te GC celic s 100 nM trichostatin A (TSA, WAKO;È-11993) 24 ur ali 100 nM mitramicina A (WAKO;„-17101) 24 ur}

Osemnajst primarni GC tkiva in ustreza. ne-rakave želodčne sluznice so bili pridobljeni iz 15 DCKO miši. Kot je za človeške želodčne tkiv, smo uporabili tri ne-rakavo želodčne sluznice pri pacientih GC. Dobili smo tudi pet normalno želodčne sluznice s Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
miši, ki so bile uporabljene kot negativne kontrole v prejšnji raziskavi [19]. V tej študiji smo imenovano "normalno sluznice želodca«, če so osebki pridobljeni iz kontrolne miši in "ne-rakave želodčni sluznice", če so osebki pridobljeni iz DCKO miši in bolniki človeških GC v tej študiji.}

reverzno transkripcijo (RT) -PCR in kvantitativno RT-PCR (QRT-PCR)

Celotno RNA smo izolirali s RNeasy Mini kit (Qiagen;J.134) in cDNK smo pripravili iz RNA z uporabo kompleta nadpisano III (Invitrogen;´80044) v skladu s protokolom proizvajalca. Končna točka RT-PCR opravi z več številkami cikla 28-35 ciklov. Kot notranje kontrole, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze ( GAPDH
) smo pomnožili z 21 ciklov, da se zagotovi kakovost cDNA in količino za vsako RT-PCR. Pomnoženih izdelki so bili naloženi na 2% agaroznem gelu ali količinsko s kvantitativno RT-PCR z uporabo LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics;/07516001). Programi ojačanja za PCR smo ponovili 40 ciklih za GAPDH in 45cycles za druge gene, razen za GAPDH. PCR produkti so klonirali v pMD20 T-vektorja z uporabo Mighty TA-kloniranje Kit (Takara BIO INC;ɚ8), nato pa zaporedje neposredno. Temeljni premaz sekvence in velikosti izdelkov PCR so prikazani v tabeli S1.

Metiliranje Analiza

ekstrahirali genomske DNK iz mišje in GC humanih celičnih linijah z metodo fenol-kloroform, nato pa izvedemo bisulfit modifikacija in postopek PPN. Bisulfit zdravljenje DNA smo izvedli z EZ DNA metilacije-Gold (ZYMO raziskav; # D5006), in je bila izvedena nato metilacije specifične PCR (MSP). Na kratko, smo reakcijo PCR izvedemo pri 35 ciklih v zmesi 25 ul obsega-bisulfita modificiran DNA, 2.5μl z 10x PCR pufra, 1.25 xl 25 mM dNTP, 25 pmol /l vsake grundiranje in 1 U z Jumpstartu RedTaq polimeraze (Sigma; # D0563). Pogoji za PCR so bili naslednji: 95 ° C 5 minut; 35 ciklov 95 ° C za 1minutes, 53 ° C za 2minutes in 72 ° C za 1.5minutes; in končno podaljšanje pri 72 ° C 5 minut. Kot je za miške GC tkiva, je bila DNK, pridobljen iz-formalin fiksni parafinskih vgrajeni (FFPE) tkiva. Bisulfit DNA smo pomnožili s spremljajočimi PCR, in nato ugnezdeni MSP je bila izvedena [25, 26]. V začetnih oligonukleotidov zaporedja in velikosti izdelkov PCR so prikazani v S2 tabeli

kromatina imunoprecipitacije (chip) test

čip Test je bil izveden s pomočjo kompleta čip-IT Express (Active motiv;Ȓ08). po protokolu proizvajalca. Imunoprecipitirali obogatitev DNA smo normalizirali glede na vložek. Protitelesa, ki se uporabljajo v tej študiji so bili anti-histon H3K4me3 (Active motiv;Ə15), anti-H3K9me3 (Active motiv;ƍ65), anti-H3K27me3 (Active motiv;Ƈ55), anti-H3K36me2 (abcam; # ab9049) , anti-Sp1 (abcam; # ab13370) in anti-histon H3 (Active motiv;Ƈ63) protitelesa. Normalno zajec IgG (Cell Signaling Technology;Đ9s) je bila uporabljena kot negativna kontrola za čip. V začetnih oligonukleotidov zaporedja in velikosti izdelkov PCR so prikazani v S2 tabeli.

rasklapanje analizo z majhnimi moteče RNA

, ki temelji na siRNA rasklapanje za Suv39h1
in Suv39h2
je bila izvedena z uporabo elektroporacije (transfekcijske sistema Neon, Invitrogen), v skladu z navodili proizvajalca. MDGC celice smo transfektirali z 50nm siRNA v Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), ali negativni kontrolni siRNA (Mission siRNA Universal negativna kontrola, Sigma). Po 48 urah kultiviranja celice požanjemo za RT-PCR, analiz Western blot, migracijo, invazijo in proliferacije.

Western Blot Analiza

GC celice lizirali z Pierce RIPA pufrom (Thermo znanstveno;΃00). Proteine ​​smo ločili na SDS-poliakrilamidnem gelu in nato prenesli v poliviniliden fluorid (PVDF) membrane, čemur sledi inkubacija s protitelesi raztopimo v tris-pufrom (TBS), ki vsebuje 2% posnetega mleka in 10% Tween 20. Primarna protitelesa, ki se uporablja v tem študija je bila miš monoklonsko anti-Twist1 (1: 100, santa Cruz Bio-tehnologija # sc-81.417), zajec poliklonski anti-Sp1 (1: 200, aktivna motiv;'.058), in miško monoklonsko anti-α-tubulin ( 1: 200, santa Cruz, # sc-8035), protitelesa. Sekundarna protitelesa so alkalne fosfataze konjugiranih anti-rabbit IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6518) in anti-mouse IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,ª6520). Blots so bili razviti z ImmunoStar AP Substrat (Bio-Rad Laboratories,ª5018)

Imunohistokemija

FFPE odseki (4 m) so deparaffinized v ksilen, rehidrirane v razvrščenih etanola rešitev in nato Antigen iskanje. je bila izvedena v 10 mM pufru citronske kisline z mikrovalovi. Imunohistokemija je bila izvedena s pomočjo anti-Twist1 protitelesa (Santa Cruz, 1:20), kot smo že prej opisali [19]. Izražanje Twist1 je bila opredeljena kot pozitivna jedrske barvanjem v več kot 10% celic, in intenzivnost je dosegel as- (negativno), + (šibko) in ++ (zmerna do močna) trije preiskovalci samostojno.

Rezultati

Twist1 izraz v mišje in humanih celičnih linijah GC

iz DGC tkiv DCKO miši, Twist1
prepisu pozitivnih celičnih linij (MDGC-7, MDGC- 8 in MDGC-9) in negativni celične linije (MDGC-1 in MDGC-3) so bile določene (slika 1A in S2A sliki), in izražanje Twist1 proteina je bil potrjen v vsaki celični liniji (slika 1B). Twist1 izraz je bil izboljšan na ravni mRNA in proteinov, v Twist1 izražanja negativnih MDGC celic po zdravljenju z DNA demetilacijo sredstvom 5-aza-DC (slika 1C in 1D), medtem ko je njegov izraz ni bila spremenjena po zdravljenju z zaviralcem histon-TSA (S2 fig). V osem človeških GC celične linije preučiti, Twist1
izraz je navzdol reguliranih v štirih celičnih linij (slika 1E, levo), tri (KATO-III, GCIY in AGS), od katerih je pokazala ponovno aktivacijo Twist1
izraz po zdravljenju s 5-aza-DC RT-PCR (na primer, slika 1E, desno). Kot je za Twist1
izražanje pozitivnih GC celične linije, po 5-aza-dC zdravljenja, 2.1- in 3.2-krat regulacijo navzgor Twist1
je bila odkrita v MKN45 in MKN7, oziroma, s QRT-PCR, medtem Twist1 izraz ni bil spremenjen v MDGC-9 celic (slika 1F).

CGI metilacije in izražanja Twist1
in GC celične linije

Twist1
ima gosto CGI regijo s promotorjem za celotno eksona 1, pri čemer je ta regija visoko ohranjen med vretenčarji, vključno miših in človeške (S3 Fig). Za razjasnitev CGI v miško in prehrano Twist1
, smo izvedli računsko analizo uporabo UCSC genoma brskalnik (http://genome.ucsc.edu/index.html) in MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), ki se pogosto uporablja kot identifikacijo CGI in PPN primerji [27]. Analizirali smo približno 1,4 kb regijo, vključno s promotorjem in celotno ekson 1. UCSC genoma brskalnika na miših in prehrano analizo razstavljena eno CGI v območju preučila (podatki niso prikazani). Vendar pa so domnevni dva CGI mesta tako miši in človeka odkriti v regiji ko smo uporabili kriterije CGI z vsebnostjo GC 50% in opazili /pričakovano CpG razmerje 0,8 s MethPrimer (slika 2A in 2C). Ti dve domnevni CGI regije so bile nahaja na promotor in ekson 1. Ker je metilacije na promotorja regiji, so poročali v različnih oblikah raka [12, 14], smo najprej preučil metilacijski status v regiji, v mišje in humanih celičnih linijah GC s PPN. Vendar pa je stanje metilacija na promotorja regiji Twist1
ne ustreza izrazu v vseh celičnih linijah GC preučiti (regija P1, slika 2A). Za določitev kritično metiliranih regije, povezane z Twist1 izražanja v MDGC celicah, smo dodatno izvedli PPN na CGI regiji eksonu 1 (E1-1, E1-2 in E1-3), in napovedal CpG shore mestu se nahaja približno 1,6 kb od TSS (prepis začetek na mestu, S1) (slika 2A). Kot rezultat, CGI metilacija v območju (E1-1 in E1-2) okoli TSS v Twist1
ekson 1 je bilo ugotovljeno, da ustreza ekspresije gena v MDGC celicah, čeprav ni bilo nobene povezave med jim na napovedane obale regiji (S1) in koncem ekson 1 regijo (E1-3) (slika 2B levo) v MDGC celicah. Ne metilacija je bila odkrita na vseh CpG regijah, v treh normalno želodčne sluznice brez Twist1 izražanja iz Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
miši (slika 2B). V človeški želodčne sluznice, ne Twist1
metilacija je bilo ugotovljeno tudi v treh ne-rakasto želodčne sluznice pri bolnikih GC (slika 2D), od katerih je pokazala zelo šibka Twist1
izraz (podatki niso prikazani ). Smo pregledali tudi dodatne štiri ne-rakavo želodčne sluznice pri pacientih GC, medtem ko ni bilo metilacija odkrita E1-2 regiji v vseh primerih (podatki niso prikazani). Bisulfit sekvenciranje (BS) je pokazala, da CGI regija v eksonu 1 pokazala gost metilacije v celicah Twist1 izražanja negativnih MDGC-3, vendar ne v Twist1 pozitivni MDGC-9 celice (BS-c, slika 2A in 2B, desno), medtem ko bilo nobene razlike v vzorcih metilacijskih med njimi na obali CPG promoter regije (BS-a in BS-b, S4A slika). Med človeškimi celičnimi linijami GC, KATO-III in GCIY brez Twist1
izraz pokazala gosto CGI metilacije v regiji eksona 1 (E1-2), ki je v skladu s tistimi, miši Twist1
(slika 2C in 2D, levo). Oba metilacija in unmethylation v regiji E1-2 bili odkriti v MKN7 in MKN45 celic z PPN in bisulfita sekvenciranja (slika 2D), ki so basally izražene Twist1 vendar ta izraz so po zdravljenju 5-aza-DC (slika 1F) povečala. Tako so naši podatki kažejo, da metilacija v eksonu 1 regije Twist1 PODJETJA
odkrite v tej študiji je povezana z njegovo izražanje.}

Twist1
metilacija in izražanje v DCKO miške GC vzorce tkiva

preučila smo metilacijskega statusa Twist1
uporabo 18 primarnih GC tkiva iz 15 DCKO miši. Ker so GC regije zelo majhno in je njihova DNA iz FFPE vzorcev so pokazale nizke koncentracije, smo izvedli ugnezdeno PPN [25, 26]. Twist1
je bistveno metiliramo (9/18, 50%), v primarnih GK v primerjavi z ustreznimi ne-rakave tkiva (1/10, 10%), pri čemer so statistično pomembne razlike (P < 0,05, tabela 1). Reprezentativne podatki po PPN so prikazani na sliki 3A. Med njimi so bile 4 od 10 (40%) primerih intramucosal in 5 8 (62,5%) so invazivne GCS (tabela 1). V tej študiji, Twist1
metilacije pozitivni primeri dokazali nemetilirane MSP pasovih, kot tudi, ki je zaradi prisotnosti normalnega stromalni /fibroblastov in vnetnih celic v oddelkih rak tkiva, čeprav ne moremo zanikati možnost delnega metilacije kot MKN45 in MKN7 in tumorja raznovrstnosti.

Twist1 protein izraz je bila odkrita pri 7 od 18 (38,9%) GK v primerjavi z ustreznimi ne-rakavo želodčne sluznice, ki ga imunohistokemijo. Reprezentativne slike so prikazane na sliki 3B. Nadaljevali smo analizirali odnos med Twist1
izražanja in metilacije ravni v teh primerih. Med 18 primarni GC preučiti, devet primerov je pokazala korelacijo med Twist1
metilacija in izražanje (slika 3C). Tri od štirih primerov z Twist1 šibko izražanje razstavili svoje metilacije, morda, da se nizko izražanje Twist1 lahko po svoji metilacije povzroča. Vendar pa preostalih pet primerov razstavljena ne metilacije in izražanja (tabela 1).

histon metilacija je povezano z ureditvijo Twist1
izraz

Naslednja preiskava, ali je lizin raven metilacija histon H3 prispeva k Twist1
izražanja. Kromatin imuno (čip) teste smo izvedli na napovedano CpG obali (CP1.3k), promotor (CP1) in eksonov 1 (CE1-1 in CE1-2) in 2 (CE2) regije (slika 2A). Na CP1 in CE1-2 regij, je bila dejavna histonov znamka H3K4me3 obogaten Twist1 izražanja pozitivnih celic (MDGC-7 in MDGC-9), vendar neaktivna histonov znamka H3K9me3 je obogaten z Twist1 izražanja negativnih celic (MDGC-1 in MDGC -3) (slika 4A in 4B). Chip testi razstavljena tako H3K4me3 in H3K9me3 signalov MDGC-1 in MDGC-3 celic s 5-aza-dC zdravljenje, navedbo povišanega H3K4me3 v teh celic (slika 4c). Ravno nasprotno, ravni H3K27me3 in H3K36me2 ni bilo povezano z Twist1 izražanja v vseh MDGC celic, obravnavanih v tej študiji. Kot je za GC humanih celičnih linijah, podobno območje, ki leži od promotorja za eksonu 1 pokazala H3K4me3 obogatijo z Twist1
MKN45 celice izražanje pozitivnih in H3K9me3 v Twist1
izražanja negativnih KATO-III celice (sliki 2C in 4D).

Suv39h1
in Suv39h2
, histona metiltransferaza, ureja H3K9me3

Obstaja veliko histonskih metiltransferaz povezana z H3K4, H3K9 in H3K27 [28]. Zato, da se ugotovi kateri histonov sprememba encimi so odgovorni za obogatitev H3K4me3 ali H3K9me3 na Twist1
eksonu 1 regija GC celicah, smo pregledali deset H3K4me3 ( Mll1
, Mll2
, Mll3
, Mll4
, Setd1a
, Setd1b
, Ash1
, Ash1l
Smyd3
in Meisetz
), sedem H3K9me3 ( Suv39h1
, Suv39h2
, G9a
, Setdb1
, Clld8
, GLP
in Riz1
), in eno H3K27me3 ( Ezh2
) povezani geni. Reprezentativne podatki so prikazani na sliki 5A. Med njimi stopnje izraženosti v Suv39h1
in Suv39h2
bilo obratno povezana z Twist1
izražanja. Vendar pa stopnje izraženosti v preostalih 16 pregledanih histonov methylatasferase gene, niso bile povezane s Twist1
izražanja v MDGC celicah. Izvedli smo temeljijo na siRNA rasklapanje za Suv39h1
ali Suv39h2
v posameznih celicah izražanja pozitivnih MDGC-1 in MDGC-3 z elektroporacijo (slika 5b). Rasklapanje za Suv39h1
ali Suv39h2
v teh celičnih linijah privedlo do povečanja Twist1
izraz razvidne na RT-PCR (slika 5b) in QRT-PCR (MDGC- 1, slika 5C)

zveza SP1 s transkripcijske ureditvi Twist1

konsenza 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /A) (C /T) -3 'sekvenca je znan kot vezivnega motiv Sp1 transkripcijskega faktorja, ter razmerje med CGI metilacije in Sp1 vezavo na promotor poročali [29, 30]. Več servisnim paketom SP1 vezavnih mest je bilo napovedano v CpG-bogate regije v Twist1
eksonu 1 z TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) in JASPAR (http://jaspar.binf.ku.dk) . Vloga SP1 v transkripcijo Twist1
je potem preverilo, s sklicevanjem na epigenetske spremembe gena. Zaznali smo, izražanje s servisnim paketom SP1 mRNA in beljakovin v vseh glodalcev in človeško GC celic pregledanih tudi v Twist1 izražanja negativnih MDGC-1, MDGC-3, KATOIII in GCIY celic (slika 6a).

Da bi ugotovili, ali ne Sp1 veže regijah Twist1
promotorja in eksonu 1 v GC celic smo izvedli ChIP vsebnosti servisni paket SP1 za uporabo MDGC celice (slika 2a). Sp1 vezan na regije Twist1
promotorja (CP1) in ekson 1 (CE1-2) v Twist1 izražanja pozitivnih celičnih linijah (MDGC-7 in MDGC-9) (slika 6B). V nasprotju s tem, Twist1 izraz negativni celične linije (MDGC-1 in MDGC-3) je pokazala, nezaznavno koncentracijo servisnim paketom SP1 zavezujoče signale na CP1 in CE1-2 regijah. Sp1 ne vežejo na vseh območjih predvidene CpG obale (CP1.3k) in ekson 2 (CE2) regije v teh Twist1 izražanje pozitivnih in HBeAg negativnih MDGC celic. Demetilacija s 5-aza-DC povečala Sp1 vezavo na Twist1
promotor in EXON regijah 1 v celicah Twist1 izražanja negativnih MDGC-1 in MDGC-3 (slika 6b). Mitramicina A je znano, da moti Sp1 vezave na CpG-bogatih regulatornih sekvenc [31, 32]. Ugotovljeno je bilo, da je Twist1
izraz je navzdol urejeno po zdravljenju s mitramicina A je v svojem izrazu pozitivnih GC celic (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 in MKN45 celice) (slika 6C in S6 Slika). Mitramicina, A ni pokazal nobenega učinka na Sp1 izražanja v teh celicah (podatki niso prikazani). Up-regulacijo Twist1
, ki je 5-aza-DC zmanjšala za mitramicina obravnavo v MDGC-3 celic (P = 0,04, slika 6D).

Pogovor

mehanizmi so podlaga epigenetsko regulacijo onkogena slabo razumemo. Razmerje med metilacijskega statusa na Twist1
promotor regijah in izraz Twist1
je sporna, in je skoraj nič poročil o spremenjenem histon spremembi Twist1
izražanja. Tako ostaja nejasno, ali so epigenetske spremembe, povezane s Twist1
aktivacije v rakavih celicah. Kot novih ugotovitev v tej študiji smo pojasnjen Twist1
regulativni mehanizem temelji temeljno epigenetsko stroje, ki DNA metilacija, histona spremembe in Sp1 delujejo usklajeno z Twist1 izražanja v GC celicah.

To je zelo znano, da je DNA metilacija na CGI promotorski regiji kritična za gensko utišanje in odklonska rezultatov CGI metilacijo v izgubo izražanja različnih ZTP [10]. Twist1 je bila ponovno aktivirana v obeh mišjih in človeških GC celic s 5-aza-dC zdravljenja v tej študiji, ki kaže, da je transkripcijska aktivacija Twist1 modulirane tudi metilacije DNA. CGI metilacija od Twist1
promotor regija je na voljo v različnih vrst raka, kot želodca, dojke, debelega črevesa in pljuč tiste [11, 12, 14], od katerih je najbolj razvidno, da ni korelacije med Twist1
metilacija in izražanje. Ugotovili smo, da je CGI metilacije v Twist1
eksonu 1, razen v promotorski regiji sovpadala s svojo genske ekspresije v miši GC celicah. Kot je za GC humanih celičnih linijah, Twist1
izražanje negativnih celične linije so bile v celoti metilalkohol, vendar pa njegove izražanje pozitivnih celične linije razstavljal tako metilacije in unmethylation za Twist1
, vse urejeno up- Twist1
izraz po zdravljenju 5-aza-DC (slika 1F). Ti podatki kažejo, da MKN45 in MKN7 celice delno pokazala metiliranje Twist1
, in ravni pol Twist1
izraz so basally odkriti v teh celicah, ki so bile izražene iz nemetiliran alel DNK. Nedavna poročila so pokazali, da se CpG kopno metilacija povezana z genske ekspresije [7, 33]. Vendar pa je stanje metilacija na napovedano CpG obale mesta regiji ni bila povezana s Twist1
izražanja. Naši podatki kažejo, da je Twist1
je epigenetically zatrejo metilacije DNA glodalcev in GC celic človeških linij.

V skladu z računsko analizo miško in človeškega CGI od promotorja v celotni kodirni regiji v Twist1
gen, dve domnevni CGI regije so bile nahaja na promotor in ekson 1 z analizo MethPrimer. Tu smo opazili, da je CGI metilacije na exon 1, namesto njenega promotorja regiji, je bila povezana z Twist1
izražanja v GC celicah. Taki različni vzorci metilacije povezani z genskim utišanjem Poročali so o več genov [26, 34, 35]. Na primer, SOX2
in AP2α
razstavljeni domnevnih dve CGI programi na promotor in ekson 1 in metilacije v regiji eksonu 1 je dokazano, da je bistveno povezana z njegovo izražanje genov v GK in prsi raka [34, 35]. poročali, da je bil ta CGI metilacije okoli translacijskega začetnega mestu v receptorja kislina beta retinojske (RAR-p) gen dramatično sovpadala z njegovo ekspresijo v mišjih pljučnega raka v primerjavi metilacije v promotorski regiji, ki se nahaja v isti CGI [26]. Tako so naši podatki kažejo, da CGI metilacije v regiji eksonu 1 v Twist1
je pomembno, da svoje genskega utišanja v GC celicah. Vendar pa ni znano mehanizem tega neskladnih metilacije med promotorjem in ekson 1 regijah. Več transkripcijski faktor veznih mest, kot so servisni paket SP1 elementov, in histon spremembe so poročali o zaščiti CGI metilacije [36, 37]. Pomembno je, da preveri te elemente in epigenetsko strojev v CGI regijah Twist1
nadaljnjega.

V osnovni GK iz DCKO miši, 50% GK razstavljenih Twist1
metilacije s ugnezdeni PPN. Naši DCKO miši kažejo parietalnih povezanih celic netipično žarišča v želodcu, in intramucosal DGCs sestavljene iz slabo diferenciranih celic in pečatni prstan celic pogosto odkrite po 6 mesecih. Zato smo že predlagala, da naši DGCs v DCKO miših razvili skozi parietalnih celic rodu v [19]. Twist1
metiliramo v 40% intramucosal raka, medtem ko je bila pogostnost metilacije v ne-rakasto želodčne sluznice, vključno z atipičnimi žarišč redko (10%), kar kaže, da je Twist1
metilacija je zgodnje dogodek v DGC rakotvornost v našem modelu miši. Med 18 osnovnih GK pregledanih je bilo pet primerov tako Twist1
methylation- in izražanje negativnih.

• Plos ONE: Statini zmanjšujejo Helicobacter pylori CagA Translocation in zmanjšati Pojavnost želodca raku: In vitro in prebivalstva, na podlagi Case-Control študije
• Plos ONE: Endoskopska Resekcija primerjavi z želodca za zdravljenje zgodnjih Rak želodca: sistematični pregled in metaanaliza