PLoS ONE: DNR Metilinimas į Exon 1 regiono ir sudėtingas reglamento Twist1 raiškos Skrandžio vėžio ląsteles

Abstract

Twist1 raiška dažnai stebimas įvairių vėžio, įskaitant skrandžio vėžiu (GC). Nors DNR metilinimo Twist1
geno buvo pranešta vėžinių ląstelių, mechanizmai pagrindinės transkripcijos aktyvavimo lieka neaiški. Šiame tyrime mes pirmą kartą išnagrinėjo epigenetinius pakitimai Twist1
naudojant Twist1
transkripcijos-teigiamas ir neigiamojo ląstelių linijas, kurios yra gautos iš mūsų įsteigta difuzinis tipo GC pelės modelį. Gydymas DNR demetilinimu agentas 5-aza-DC reaktywację Twist1 raiškos Twist1 raiškos neigiamas GC ląsteles. Pasak metilinimo specifinio PGR ir sekos bisulfito analizė, metilinimo prie CpG-turtingas regione per Twist1
kodavimo Exon 1, o ne jo promotoriaus regione, buvo glaudžiai susijęs su transkripcijos nuslopinami ir Twist1
raiška pelės GC ląsteles. Chromatino Imunoprecipitacijos tyrimai parodė, kad aktyvūs iuose ženklas H3K4me3 buvo prisodrintas Twist1 raiškos teigiamas ląsteles, ir neaktyvus iuose ženklas H3K9me3 buvo prisodrintas Twist1 raiškos neigiamas ląsteles. Sąvoka lygiai Suv39h1 parsisiųsti ir Suv39h2
, histonų metiltransferazių už H3K9me3 buvo atvirkščiai koreliuoja su Twist1
išraiška, ir nokdaunas iš Suv39h1
arba Suv39h2
sukeltas Twist1
išraiška. Be to, SP1 transkripcijos faktorius jungiasi prie egzono 1 CpG turtingas regionas Twist1 raiškos teigiamų ląstelių linijas, ir Twist1
išraiška sumažėjo mitramicino, kuris, kad trukdo SP1 privalomas CpG-turtingas reguliavimo sekas. Mūsų tyrimai parodė, kad Twist1
rašybą GC ląstelių gali būti reguliuojamas galimo bendradarbiavimo DNR metilinimo, Histonas pakeitimo kompleksas su SP1 privalomas CpG-turtinguose regionuose per Exon 1 regione.

citavimo: Sakamoto A Akiyama Y Shimada S Zhu DG, Yuasa Y Tanaka S "(2015) DNR Metilinimas į Exon 1 regiono ir sudėtingas reguliavimas Twist1 išraiška Skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 10 (12): e0145630. Doi: 10,1371 /journal.pone.0145630

redaktorius: Tae-Young Roh, Pohang universiteto mokslo ir technologijos (POSTECH), Korėjos Respublika

Įstojo rugsėjo 21, 2015 m Priėmė: Gruodžio 6, 2015 m Paskelbta: Lapkritis 22, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Sakamoto et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas dotacijos-in-pagalbos moksliniams tyrimams (C) (24590444) ir (a) (25253081) ir A3 prognozavimo programą (AA005) iš Japonijos draugijos mokslo skatinimo (JSP) ir praktinių tyrimų inovatyvios vėžio kontrolės (15Ack0106017h0002) iš Japonijos agentūra medicinos mokslinių tyrimų ir plėtros, Amed; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

konkuruojančių interesų: autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Santrumpos:. BS, bisulfite eiliškumą; CGI CpG sala; Mikroschema, chromatino imunoprecipitacijos; DCKO dukart sąlyga nokautas pelė; DGC, difuzinis tipo skrandžio vėžys; GAPDH, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės; GC, skrandžio vėžio; H3K4me3, Histonas H3 lizino 4 TRI-metilinimas; H3K9me3, Histonas H3 lizino 9 TRI-metilinimas; H3K27me3, Histonas H3 lizino 27 tri-metilinimas; JEP, metilinimas konkrečių polimerazės grandininė reakcija; AT-PGR, atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininę reakciją; KRL-PGR, kiekybinė PGR; GTG, navikas slopintuvas genų; PSD, stenograma pradžia svetainė; 5-aza-DC, 5-aza-2'-deoxycitidine

Įvadas

Twist1, veikiantis kaip pagrindinio Helix-kilpa-spiralės transkripcijos faktorius, tiesiogiai jungiasi į E-box elementų (NCANNTGN ) dėl konkrečių tikslinių genų [1]. Twist1 yra plačiai žinoma, kad svarbu Mezoderma formavimo metu ankstyvas embriono vystymasis Drosophila ir pelės [2, 3]. Žmogaus vėžio, negimdinis Twist1 išraiška Pranešama, kad susijęs su piktybinio progresavimo, invazijos, epitelio-to-mechencymal perėjimo, metastazių ir stemness, nurodant galimas onkogeninių funkcijas Twist1 [4-6]. Taigi, labai svarbu išsiaiškinti transkripcijos reguliavimo mechanizmus Twist1 į vėžines ląsteles.

Epigenetiniai pokyčiai, pavyzdžiui, DNR metilinimo ir Histonas modifikacijos, yra glaudžiai susiję genai yra nuslopinami [7-9]. Nors Epigenetiniai pakitimai ne CGI (IPG Island) promotoriaus regione navikas slopintuvas genų (GTG) yra gerai žinoma, kad būti susijęs su jų genų aktyvumo mažinimo [10], iš epigenetinio reguliavimo onkogenų mechanizmai sunkiai suprantamas. Kelios grupės parodė, kad Twist1
buvo reaktywację veikiant su de-metilinimo narkotikų, 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-DC), į vėžinių ląstelių [11, 12]. Netipinė DNR metilinimas ne CGI promotoriaus žmogaus Twist1
buvo dažnai aptinkamas pradinėse vėžio, įskaitant skrandžio vėžiu (GC) [11-14]. Nepaisant to, yra daug faktų daug, kad DNR metilinimas tuo Twist1
rengėjas regionas nėra susijęs su saviraiškos geno įvairių vėžio [12, 14]. Nors Twist1
metilinimas gali būti naudinga biologinis prognozuoti klinikinius rezultatus, kad pasikartos ir išlikimas pacientams, sergantiems vėžiu [12, 13, 15], jis lieka prieštaringas, ar ne Twist1
metilinimas tuo promotoriaus regione veda prie nuslopinami geno.

Transkripcinis reguliavimas genų koreliuoja su lizino (K) metilinimo raštų histono uodegos, kurie sudaryti iš trijų skirtingų lizino metilinimo narių (mono-, di- ir tri-). Tri-metilinimo H3K4 (H3K4me3) yra susijusi su genų aktyvacijos, ir kad iš H3K9me3 ir H3K27me3 sugene represijos [7-9]. Nors šie trys histonų H3-methyaltion modeliai yra susiję su CGI metilinimo taip pat, transkripcijos reguliavimo mechanizmai, Twist1
pagrindinės iuose modifikacija yra menkai suprantamas vėžinių ląstelių.

GC yra antras dažniausias mirties priežastis nuo vėžio pasaulyje [16]. GC suskirstyti į dvi pagrindines histologinių tipų; paplitusia ir žarnyno, kurie yra du skirtingi kancerogeninės keliai [17]. Difuzinis tipo skrandžio vėžys (DGC) yra žinoma, kad rodo, dažnai invazija ir metastazių, todėl blogos prognozės [18]. Praradimas E-cad ir p53 buvo pranešta difuzinis tipo skrandžio kancerogenezėje [19-21]. Keli ataskaitos parodė dažną Padidėjusi Twist1 žmogiškųjų DGCs [22, 23].

anksčiau inžinerijos dvigubą sąlyginį nokautas (DCKO) pelės linijos, kad E-cad ir p53, kuris yra specialiai inaktyvuotų skrandyje [ ,,,0],19]. Visi DCKO pelės sukūrė mirtinų DGCs per metus, fenotipų yra didelė invazyvumas ir dažnai metastazės į limfmazgius. Pažymėtina, kad genų ekspresijos modeliai DGCs į aptiktų mikrogardeliq analizė DCKO pelių buvo labai panašūs į tuos, išskyrus žarnyno tie žmogaus pirminių DGCs. Taigi, mūsų DCKO pelės modelis yra galingas įrankis tiriant genų funkcijos DGC kancerogenezėje vaidmenį ir plėtoti gydymo strategiją. Šiame tyrime mes sukūrėme Twist1 išraiška-teigiamų ir neigiamojo DGC ląstelių linijas, kurios yra gaunamos iš DCKO pelių. Kaip analize epigenetinių pokyčių pasekmė, bendra reguliavimo mechanizmas Twist1
buvo išaiškintas, ir įvertinti tiek pelių ir žmogaus DGCs šiame tyrime.

Medžiagos ir metodai

etika pareiškimas

Visi vivo
procedūras patvirtino gyvūnų priežiūros komiteto Tokijo medicinos ir odontologijos universitete (leidimas Nr 0160073A). Kaip normaliam žmogaus skrandžio gleivinės mėginiai, parašyta informuotas sutikimas buvo gautas iš visų dalykų, o tyrimas buvo patvirtintas etikos komiteto Tokijo medicinos ir odontologijos universitete (No.1115).

Mobilusis kultūros ir audinių mėginių

Mes anksčiau nustatyto E-cad /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{, +
Cdh1
loxP /loxP
Trp53
loxP /loxP
) pelės modelis [19]. Nuo jos vėžinių audinių, mes sukūrėme penkis pelės DGC ląstelių linijas ir pavadino juos MDGCs (Shimada S neskelbtos stebėjimas). MDGC-1 ir MDGC-3 ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuota Eagle terpėje (DMEM), kuriame yra didelis gliukozės papildyti su 10% vaisiaus galvijų serumo ir MDGC-7, MDGC-8 ir MDGC-9 buvo kultivuojamos Ham F12 papildyta 5% arklys serume. DNR analizė buvo atlikta siekiant nustatyti nupjauto Cdh1 parsisiųsti ir Trp53
aleliai (S1 pav). Aštuoni žmogaus GC ląstelių linijas (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 ir HSC60) taip pat buvo naudojami šiame tyrime. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY ir KATO III buvo perkami iš RIKEN ląstelių banko (Tsukuba, Japonija). NUGC4 ir AGS ląstelės buvo gautos iš žmogaus Mokslo tyrimų išteklius banko (Osaka, Japonija) ir ATCC (American Tipas Mobilusis Collection). HSC60 ląstelės buvo gauti iš dr Kazuyoshi Yanagihara (Nacionalinio vėžio tyrimų centro, Tokijas, Japonija) [24]. Kato-III MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS ir HSC60 ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 ir GCIY buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuota Eagle terpėje, kurie abu buvo papildytas 10% vaisiaus galvijų kraujo serume. De-metilinimas studijas, pelių ir žmogaus GC ląstelių buvo gydomi kasdien 500nM 5-aza-deoksicitidino (5-aza-DC, Sigma; # A3656) 72 val. Mes elgiamasi šiuos GC ląsteles su 100 jūrmylių trichostatin A (TSA, WAKO;È-11993) 24 valandų arba 100 jūrmylių mitramicino A (WAKO;„-17101) 24 val}

Aštuoniolika pirminės GC audiniai ir atitinkantis. ne vėžiniai skrandžio gleivinės buvo gauti iš 15 DCKO pelių. Kaip žmogaus skrandžio audinių, mes panaudojome tris nevėžinės skrandžio gleivinės nuo GC pacientams. Mes taip pat gavo penkis normalų skrandžio gleivinės iš Atp4b-Cre
^{- CR.LT; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
pelių, kurios buvo naudojamos kaip neigiamos kontrolės mūsų ankstesniame tyrime [19]. Šiame tyrime mes vadinami "normalus skrandžio gleivinės", jei egzemplioriai buvo gauti iš kontrolinės pelių ir "ne vėžiniai skrandžio gleivinės", jei egzemplioriai buvo gauti iš DCKO pelių ir žmogaus GC pacientų šiame tyrime.}

atvirkštinės transkripcijos (RT), -PCR ir kiekybinė PGR (KRL-PGR)

viso RNR buvo išskirta su RNeasy Mini kit (Qiagen;J.134) ir kDNR buvo ruošiamas iš RNR naudojant viršuje III komplektą (INVITROGEN;´80044) pagal gamintojo protokolai. Galutinio taško AT-PGR atliekama su keliais ciklo numerius, 28-35 ciklų. Kaip vidaus kontrolės, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės ( GAPDH
) buvo papildyta su 21 ciklų užtikrinti kDNR kokybę ir kiekį kiekvienam RT-PGR. Amlifikuoti produktai buvo pakrautas iki 2% agarozės gelyje arba kiekybiškai kiekybinio RT-PGR naudojant LIGHTCYCLER DNR Master SYBR Green I (Roche Diagnostics;/07516001). Amplifikacijos PGR programos buvo kartojamas 40 ciklų GAPDH ir 45cycles kitų genų, išskyrus GAPDH. PGR produktai buvo klonuotas į pMD20 T-vektorius, naudojant galingą TA-klonavimo rinkinį (TAKARA BIO INC;ɚ8), o tada sekos tiesiogiai. Grunto sekas ir PGR produktas dydžiai rodomi S1 lentelėje.

Metilinimas analizė

išgauti genomo DNR nuo pelių ir žmogaus GC ląstelių linijų iš fenolio-chloroformo metodą, o tada atliekamas bisulfite modifikavimas ir JEP procedūra. Bisulfite gydymas DNR buvo atliktas su EZ DNR metilinimas-GOLD (ZYMO tyrimai; # D5006), ir buvo atliktas tada metilinimas konkrečių PGR (JEP). Trumpai tariant, PGR reakcija buvo atliekama 35 ciklų per 25 iL mišinį, apimantį bisulfite modifikuotų DNR, 2.5μl 10x PGR buferis, 1,25 įxL 25mm dNTP, 25 pmol /l kiekvieno pradmens ir 1 U Greito starto RedTaq polimerazės ( "Sigma; # D0563). Už PGR sąlygos buvo taip: 95 ° C 5 minutes; 35 ciklai 95 ° C temperatūroje 1minutes, 53 ° C temperatūroje 2minutės, ir 72 ° C temperatūroje 1.5minutes; ir galutinis išplėtimas 72 ° C temperatūroje 5 minutes. Kaip pelė GC audinių DNR buvo išskirta iš formalinu fiksuotos parafino įterptųjų (FFPE) audiniuose. Bisulfito DNR buvo papildyta su gretutines PGR pradmenis ir tada įdėtos MSP buvo atliktas [25, 26]. Grunto sekas ir PGR produktas dydžiai rodomi S2 lentelėje

Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) Analizės

lusto testą buvo atliekama naudojant lusto IT Express komplektas (Aktyvus motyvas;5.008). pagal gamintojo protokolą. Immunoprecipitated DNR sodrinimo normalizavosi kaip į įėjimą. Naudojami šiame tyrime antikūnai buvo anti-iuose H3K4me3 (Aktyvus motyvas;'.915), anti-H3K9me3 (Aktyvus motyvas;'.765), anti-H3K27me3 (Aktyvus motyvas;Ƈ55), anti-H3K36me2 (abcam; # ab9049) anti-SP1 (abcam; # ab13370), ir anti-Histono H3 (Aktyvus motyvas;'.163) antikūnai. Normalus triušio IgG (Mobilusis Signalizacijos technologijos;Đ9s) buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė lustą. Grunto sekas ir PGR produktas dydžiai rodomi S2 lentelėje.

triuškinantis analizę, naudojant mažų trukdančių RNR

siRNR pagrindu nokdaunas iš Suv39h1 parsisiųsti ir Suv39h2
buvo atliekama naudojant elektroporacijos (neonas transfekcijq sistemą, Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. MDGC ląstelės buvo pernešta su 50nm siRNA iš Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), arba neigiamus kontrolinius siRNR (misija siRNR Universal neigiama kontrolė, Sigma). Po 48 valandų auginimo, ląstelės buvo paruošta RT-PCR, Vakarų dėmė analizuoja, migracija, invazija ir platinimo tyrimą.

Vakarų dėmė analizė

GC ląstelės buvo lizuoti su Pierce Ripa buferis (Termo Mokslo;΃00). Baltymai buvo atskirtos SDS-poliakrilamido gelyje ir tada perkelti į polivinilideno fluorido (PVDF) membranų, o po to inkubacijos su antikūnų ištirpintas tri-buferio druskų tirpalu (TBS), kuriame yra 2% lieso pieno ir 10% Tween 20. pirminiai antikūnai, naudojami šiame tyrimas buvo pelės monokloninis anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz "Bio-technologijos; # SC-81.417), triušių polikloninis kovos su SP1 (1: 200, Aktyvus motyvas;'.058), ir pelės monokloninis anti-α-tubulino ( 1: 200, Santa Cruz; # SC-8035) antikūnai. Antriniai antikūnai buvo šarminės fosfatazės-konjuguoto anti-triušio IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories ";
.706.518) ir anti-pelės IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories";
.706.520). Dėmės buvo sukurta su ImmunoStar AP Substratas (Bio-Rad Laboratories;ª5018)

imunohistocheminis

FFPE skyriai (4 mkm) buvo deparaffinized į ksileno, rehidratuoti rūšiuojami etanolio tirpalo ir tada antigeno paieška. buvo atliktas 10 mM citrinų rūgšties buferio superaukštu. Imunohistocheminis buvo atliekama naudojant anti-Twist1 antikūnus (Santa Cruz, 1:20), kaip aprašyta pirmiau [19]. Išraiška Twist1 buvo apibrėžtas kaip teigiama branduolinės dažymo daugiau nei 10% ląstelių, o intensyvumas pelnytas pa- (neigiamas), + (silpnai) ir ++ (vidutinio iki stipraus) trimis tyrėjų savarankiškai.

Rezultatai

Twist1 išraiška pelių ir žmogaus GC ląstelių linijų

nuo DGC audinių DCKO pelių Twist1
transkripcijos-teigiamų ląstelių linijos (MDGC-7, MDGC- 8 ir MDGC-9) ir neturinčių ląstelių linijos (MDGC-1 ir MDGC-3) buvo nustatyta (pav 1A ir S2A pav), ir Twist1 baltymo ekspresija buvo patvirtinta kiekvienos ląstelių linijos (pav 1B). Twist1 išraiška buvo stiprinami mRNR ir baltymų kiekiai Twist1 raiškos neigiamas MDGC ląstelių po gydymo DNR demetilinimu agentas 5-aza-DC (pav 1C ir 1D), o jo išraiška nepasikeitė po gydymo histono deacetilazės inhibitorių TSA (S2B pav). Per aštuonerius žmogaus GC ląstelių linijos išnagrinėjo Twist1
išraiška buvo downregulated keturių ląstelių linijas (pav 1E, kairėje), trys (KATO-III, GCIY ir AGS), iš kurių įrodė naujo aktyvinti Twist1
išraiška po gydymo 5-aza-dC RT-PCR (pavyzdžiui, pav 1E, dešinėje). Kaip Twist1
išraiška teigiamas GC ląstelių linijas, po 5-aza-DC gydymą, 2.1- ir 3,2 karto UP-reglamentavimą Twist1
buvo aptiktas MKN45 ir MKN7, atitinkamai, atliekant KRL-PGR, o Twist1 išraiška nepasikeitė MDGC-9 ląstelių (pav 1F).

CGI metilinimo ir išraiška Twist1
GC ląstelių linijos

Twist1
yra tankus CGI regioną nuo promotoriaus į visą egzono 1, šis regionas yra labai konservatyvi stuburinių, įskaitant pele ir žmogaus (S3 pav). Paaiškinti pelių ir žmonių Twist1
CGI, mes atliekame skaičiavimo analizę naudojant UCSC genomo Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) ir MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), kuris yra plačiai naudojamas kaip identifikuoti CGI ir JEP gruntai [27]. Tyrėme maždaug 1,4 kb regioną įskaitant rengėjo ir visą Exon 1. UCSC genomo naršykle pele ir žmonių analize eksponuojami vieną CGI regione išnagrinėjo (duomenys neparodyti). Tačiau spėjamas du CGI svetainių buvo aptikta regione tiek pele ir žmogaus kai mes naudojamas CGI kriterijus GC kiekis 50%, o pastebėta /tikimasi CPG santykis 0,8 pagal MethPrimer (pav 2A ir 2C). Šie du spėjamas CGI regionai buvo įsikūręs promotoriaus ir egzono 1. Nuo ties promotoriaus regione metilinimo buvo pranešta įvairiose žmogaus vėžio [12, 14], mes iš pradžių išnagrinėjo metilinimo statusą regione pelių ir žmogaus GC ląstelių linijų iki JEP. Tačiau metilinimas statusas tuo promotoriaus regione Twist1
neatitiko jos išraiškai bet GC ląstelių linijų išnagrinėjo (regionas P1, pav 2a). Norėdami nustatyti kritiškai denatūruoti regionus, susijusius su Twist1 raiškos MDGC ląstelių, mes dar atliekami JEP ne CGI regione egzono 1 (E1-1, E1-2 ir E1-3), o prognozuojama CpG kranto svetainė yra maždaug 1,6 kb nuo PSD (stenograma pradžia svetainė, S1) (pav 2A). Kaip rezultatas, CGI metilinimas tame pačiame regione (E1-1 ir E1-2) aplink TŠS Twist1
galinio egzono 1 buvo nustatyta, kad atitinka raiškai į MDGC ląstelių geno, nors nebuvo koreliacija tarp jie būtų prognozuojama kranto regione (S1) ir egzono 1 regione (E1-3) (pav 2B, kairėje) į MDGC ląstelių pabaigoje. Nėra metilinimas buvo aptikta jokių CpG regionai suskirstyti į tris normalus skrandžio gleivinės be Twist1 išraiška iš Atp4b-Cre
^{- CR.LT; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
pelėms (pav 2B). Žmogaus skrandžio gleivinės, ne Twist1
metilinimas taip pat buvo rasta trijų nevėžinės skrandžio gleivinės nuo GC pacientų (pav 2D), iš kurių vienas parodė labai silpna, nerodomas Twist1
išraiška (duomenys ). Mes taip pat išnagrinėjo papildomas keturių nevėžinės skrandžio gleivinės nuo GC pacientams, o ne metilinimas buvo aptikta E1-2 regiono visus atvejus (duomenys neparodyti). Bisulfite sekos (BS) parodė, kad CGI regionas egzono 1 parodė, tankus metilinimas yra Twist1 raiškos neigiamas MDGC-3 ląstelių, bet ne Twist1 teigiamas MDGC-9 ląstelės (BS-C pav 2A ir 2B, dešinėje), nors nebuvo metilinimo modelių tarp jų skirtumas tuo CpG kranto ir propaguotojas regionuose (BS-a ir BS-b, S4A pav). Tarp žmogaus GC ląstelių linijų, KATO-III ir GCIY be Twist1
išraiška parodė, tankus CGI metilinimas ne iš egzono 1 (E1-2) regione, kuris yra suderinamas su tuos pele Twist1
(pav 2c ir 2d, kairėje). Tiek metilinimas ir unmethylation į E1-2 regione buvo aptikta MKN7 ir MKN45 ląstelėse JEP ir bisulfito sekos (pav 2D), kurie basally išreikštų Twist1 tačiau jų išraiška koncentracija padidėjo po 5-aza-DC gydymą (pav 1F). Taigi, mūsų duomenys rodo, kad metilinimas į Exon 1 regione, Twist1
aptikta Šis tyrimas yra susijęs su jo išraiškos.}

Twist1
metilinimas ir išraiška DCKO pelės GC audinio mėginiai

išnagrinėjo metilinimo statusą, Twist1
naudojant 18 pirminius GC audinius iš 15 DCKO pelių. Kadangi GC regionai buvo labai mažas ir jų DNR nuo FFPE mėginių parodė per mažai, mes atliekame įdėtos JEP [25, 26]. Twist1
buvo žymiai denatūruotas (9/18, 50%), turintis pirminių GCS, palyginus su ne vėžiniai audiniai (1/10, 10%), yra statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05, 1 lentelę). Tipinių duomenų tvarkymo ir perdavimo MSP yra parodyta Fig 3A. Tarp jų, 4 iš 10 (40%) atvejų buvo intramucosal ir 5 iš 8 (62,5%) buvo invazinė GCS (1 lentelė). Šiame tyrime Twist1
metilinimo teigiamas atvejai parodė, nedenatūruotą MSP juostas, taip pat, kuris dėl normalaus stromos /fibroblastų ir uždegiminių ląstelių vėžio audinių skyriuose akivaizdoje, nors mes negalėjo paneigti dalinio metilinimo galimybę kaip MKN45 ir MKN7 ir naviko heterogeniškumo.

Twist1 baltymo ekspresija buvo aptikta 7 iš 18 (38,9%) gCS, palyginus su ne vėžiniai skrandžio gleivinės imunohistocheminiu. Reprezentacinės nuotraukos parodytos pav 3B. Mes taip pat analizavo tarp Twist1
išraiška ir metilinimo lygio santykius šiais atvejais. Tarp 18 pirminės GC išnagrinėjo devyni atvejai parodė koreliaciją tarp Twist1
metilinimas ir išraiška (pav 3C). Trys iš keturių atvejų su Twist1 silpna išraiška eksponuojami jos metilinimas, galbūt, kad mažas išraiška Twist1 gali sukelti jo metilinimo. Tačiau likusios penkios bylos eksponuojami ne metilinimas ir raišką (1 lentelė).

Histono metilinimas yra susijęs su reglamento Twist1
išraiška

Kitas ištirti, ar lizino metilinimas lygis Histonas H3 prisideda prie Twist1
išraiška. Chromatino Imunoprecipitacijos (Chip) tyrimai buvo atliekami prognozuojamos CpG kranto (CP1.3k), rengėjas (CP1) ir egzonų 1 (CE1-1 ir CE1-2) ir 2 (CE2) regionams (pav 2a). Tuo cp1 ir CE1-2 regionuose, aktyvus iuose ženklas H3K4me3 buvo prisodrintas Twist1 raiškos teigiamas ląsteles (MDGC-7 ir MDGC-9), tačiau neaktyvus iuose ženklas H3K9me3 buvo prisodrintas Twist1 raiškos neigiamas ląstelių (MDGC-1 ir MDGC -3) (pav 4A ir 4B). Chip tyrimai eksponuojami tiek H3K4me3 ir H3K9me3 signalus MDGC-1 ir MDGC-3 ląstelių 5-aza-DC gydymą, nurodant padidėjusi H3K4me3 kiekį šių ląstelių (pav 4c). Priešingai, tai H3K27me3 ir H3K36me2 lygiai nebuvo susijęs su Twist1 išraiškai bet MDGC ląstelių tirtų šiame tyrime. Kaip žmogaus GC ląstelių linijų, panašus regionas yra nuo promotoriaus į Exon 1 parodė H3K4me3 sodrinimą Twist1
išraiška teigiamas MKN45 ląstelių ir H3K9me3 į Twist1
išraiška neigiamas KATO-III ląstelės (Figos 2C ir 4d).

Suv39h1 parsisiųsti ir Suv39h2
, histono metiltransferazė, reguliuoja H3K9me3

yra Histonas metiltransferazių daug susijęs su H3K4, H3K9 ir H3K27 [28]. Todėl, siekiant nustatyti, kuri iuose modifikacija fermentai yra atsakingas už H3K4me3 arba H3K9me3 sodrinti Twist1
Exon 1 regionas GC ląstelių, mes išnagrinėjo dešimt H3K4me3 ( Mll1
Mll2
Mll3
Mll4
Setd1a
Setd1b
Ash1
Ash1l
Smyd3 parsisiųsti ir Meisetz
), septyni H3K9me3 ( Suv39h1
Suv39h2
G9a
Setdb1
Clld8
GLP parsisiųsti ir Riz1
), ir vienas H3K27me3 ( Ezh2
) susiję genai. Tipinių duomenys yra parodyta Fig 5A. Tarp jų, ekspresijos lygis Suv39h1 parsisiųsti ir Suv39h2
buvo atvirkščiai koreliuoja su Twist1
išraiška. Tačiau pasakymas lygiai likusius 16 histono methylatasferase genus išnagrinėti nebuvo susijęs su Twist1
raiškos MDGC ląsteles. Mes atlikome siRNA pagrindu triuškinantis iš Suv39h1
arba Suv39h2
atitinkamuose raiškos teigiamas MDGC-1 ir MDGC-3 ląstelių elektroporacijos (pav 5B). Nokdaunas iš Suv39h1
arba Suv39h2
šių ląstelių linijas lėmė padidėjimo, Twist1
išraiška pastebima ant RT-PCR (pav 5B) ir KRL-PCR (MDGC- 1 pav 5C)

asociacija SP1 su transkripcijos reguliavimo Twist1 pervežimas pervežimas

sutarimo 5 '-. (g /t) GGGCGG (g /a) ( G /A), (C /T), -3 "seka yra žinomas kaip privalomą motyvas SP1 transkripcijos veiksnio ir santykiai tarp CGI metilinimo ir SP1 privalomas promotoriaus buvo pranešta [29, 30]. Keli SP1 jungimosi vietų buvo prognozuojama CpG-turtingas regione per Twist1
Exon 1 su TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) ir JASPAR (http://jaspar.binf.ku.dk) , SP1 vaidmuo Twist1
transkripcijos tada buvo tiriama su nuoroda į epigenetinio pakeitimo geno. Mes nustatėme, išraiška SP1 mRNR ir baltymų visose pelių ir žmonių ląstelių GC ištirtų net Twist1 raiškos neigiamas MDGC-1, MDGC-3, KATOIII ir GCIY ląstelių (pav 6a).

Jei nustatyti, ar ne SP1 jungiasi prie Twist1
promotoriaus ir egzono 1 GC ląstelių regionuose, mes atliekame Chip tyrimą SP1 naudojant MDGC ląstelių (pav 2a). SP1 jungiasi prie Twist1
promotoriaus (cp1) ir egzono 1 (CE1-2) į Twist1 raiškos teigiamų ląstelių linijų (MDGC-7 ir MDGC-9) (pav 6b) regionuose. Priešingai, Twist1 išraiška neigiamas ląstelių linijas (MDGC-1 ir MDGC-3) parodė, neišmatuojamo lygio SP1 privalomus signalus tuo cp1 ir CE1-2 regionuose. SP1 nebuvo įpareigoti jokioms prognozuojamos CpG kranto (CP1.3k) ir egzono 2 (CE2) Regionai šių Twist1 išraiška-teigiamų ir neigiamojo MDGC ląstelių regionuose. Demetilinimu su 5-aza-DC padidėjo SP1 privalomas ne Twist1
promotoriaus ir Exon 1 regionų Twist1 raiškos neigiamas MDGC-1 ir MDGC-3 ląstelių (pav 6b). Mitramicino A žinomas kištis su SP1 privalomas CpG-turtingas reguliavimo sekas [31, 32]. Buvo pažymėta, kad Twist1
išraiška buvo žemyn reguliuojama po gydymo mitramicino A savo išraiška teigiamas GC ląstelių (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 ir MKN45 ląstelės) (pav 6C ir S6 pav). Mitramicino neparodė jokio poveikio Sp1 išraiškos šių ląstelių (duomenys neparodyti). Iki-reguliavimo, Twist1
pagal 5-aza-DC sumažėjo mitramicino A gydymo MDGC-3 ląstelių (p = 0,04, pav 6D).

Diskusijos

mechanizmai pagrindinės epigenetinius reguliavimą onkogeno yra sunkiai suprantamas. Ryšys tarp metilinimo statusą ne Twist1
promotoriaus regionuose ir išraiška Twist1
yra prieštaringas, ir yra beveik nė vienas iš ataskaitų pakitusiu Histonas nemodifikuojant Twist1
išraiška. Taigi, lieka neaišku, ar Epigenetiniai pokyčiai susiję su Twist1
aktyvacijos vėžinių ląstelių. Kaip naujus šios tyrime mes nušvietė į Twist1
reguliavimo mechanizmo, lemiančio esminį epigenetinius technika, kad DNR metilinimas, iuose modifikavimas ir SP1 aktas koncertą su Twist1 raiškos GC ląsteles.

Jis yra plačiai žinoma, kad DNR metilinimas ne CGI promotoriaus regione yra labai svarbus genai yra nuslopinami ir neįprastos CGI metilinimas nukenčia išraiškos įvairių GTG [10]. Twist1 vėl buvo įjungta į abi pelių ir žmogaus GC ląstelių 5-aza-DC Šiame tyrime gydymas, nurodant, kad transkripcijos aktyvavimo Twist1 taip pat koreguojamos pagal DNR metilinimo. CGI metilinimo Twist1
rengėjas regionas buvo rasta įvairių vėžio, pavyzdžiui, skrandžio, krūties, storosios žarnos ir plaučių tie [11, 12, 14], kurių dauguma neparodė koreliaciją tarp Twist1
metilinimas ir raiška. Mes pastebėjo, kad CGI metilinimas į Twist1
Exon 1 išskyrus promotoriaus regione atitiko jo genų raiškos pelė GC ląsteles. Kaip žmogaus GC ląstelių linijas Twist1
išraiška neigiamas ląstelių linijos buvo visiškai metilo, bet savo išraiška teigiamas ląstelių linijos eksponuojami tiek metilinimas ir unmethylation iš Twist1
, kurie visi iki reguliuojama Twist1
išraiška po 5-aza-DC gydymą (pav 1F). Šie duomenys rodo, kad MKN45 ir MKN7 ląstelės iš dalies parodė, metilinimas yra Twist1
ir puse lygiai Twist1
išraiška buvo basally aptikta šių ląstelių, kurios buvo išreikštos iš nedenatūruotu DNR alelio. Neseniai ataskaitos parodė, kad CpG kranto metilinimas yra susijęs su genų ekspresijos [7, 33]. Tačiau metilinimas statusas tuo prognozuojama CpG kranto svetainę regione nebuvo susijęs su Twist1
išraiška. Mūsų duomenys rodo, kad Twist1
yra epigenetically nutildė DNR metilinimo pelių ir žmogaus GC ląstelių linijų.

Pasak skaičiavimo analize pele ir žmogaus CGIS nuo promotoriaus visam kodavimo regionas Twist1
genas, du spėjamas CGI regionai buvo įsikūręs promotoriaus ir egzono 1 d MethPrimer analizė. Čia mes nustatėme, kad CGI metilinimas tuo egzono 1, o ne jo promotoriaus regione, buvo susijęs su Twist1
raiškos GC ląsteles. Tokie skirtingi metilinimo modeliai, susiję su genai yra nuslopinami buvo pranešta apie keletą genų [26, 34, 35]. Pavyzdžiui, SOX2 parsisiųsti ir AP2α
eksponuojami spėjamas du CGI tuo promotoriaus ir egzono 1, bei metilinimo prie Exon 1 regione parodė, kad būti patikimai koreliavo su savo genų ekspresijos GCS ir krūties vėžio [34, 35]. Buvo pranešta, kad CGI metilinimas aplink transliacijos pradžios svetainę retino rūgštis receptorių beta (rar-ss) genas dramatiškai atitiko savo išraiška pelių plaučių vėžio palyginti su metilinimo prie promotoriaus regione, esančiame tame pačiame CGI [26]. Taigi, mūsų duomenys rodo, kad CGI metilinimas tuo Exon 1 regiono į Twist1
svarbu jo genai yra nuslopinami GC ląsteles. Tačiau, ji yra nežinomas šio prieštaringą metilinimo tarp promotoriaus ir egzono 1 regionus mechanizmas. Keli transkripcijos faktorius jungimosi vietų, tokių kaip SP1 elementų, ir Histonas modifikacijos buvo pranešta apsaugoti CGI metilinimas [36, 37]. Svarbu ištirti šiuos elementus ir epigenetinius mašinų CGI regionuose Twist1 pervežimas toliau.

pirminės GCS nuo DCKO pelėmis, 50% GCS eksponavo Twist1
metilinimo iki lizdinė JEP. Mūsų DCKO pelės parodyti parietalinėje ląstelių susijusių netipišką židiniai skrandyje ir intramucosal DGCs sudarytas prastai diferencijuotų ląstelių ir antspaudo žiedas ląstelių dažnai aptiktų po 6 mėnesių. Taigi, mes jau anksčiau pasiūlė, kad mūsų DGCs į DCKO pelių sukūrė per Išorinis ląstelių linijos [19]. Twist1
buvo denatūruotas pagal 40% intramucosal vėžio, o metilinimo dažnis ne vėžiniai skrandžio gleivinės įskaitant netipišką židinių buvo reti (10%), rodo, kad Twist1
metilinimas yra anksti renginys DGC Kancerogeninis mūsų pelės modelį. Tarp 18 pirminių GCS ištirtų penki atvejai buvo tiek Twist1
methylation- ir išraiška neigiamas.

• PLoS ONE: Statinai sušvelninti Helicobacter pylori CagA Translocation ir sumažinti Sergamumas skrandžio vėžys: in vitro ir gyventojų grindžiamas atvejo-kontrolės Studies
• PLoS ONE: Endoskopinė rezekcija Palyginti su pašalintas skrandis gydyti anksti skrandžio vėžys: sisteminė apžvalga ir metaanalizė