PLoS ONE: метилирование ДНК в экзон 1 области и комплексное регулирование Twist1 экспрессии в рак желудка Cells

Абстрактный
<р> Twist1 избыточная экспрессия часто наблюдается в различных видов рака, включая рак желудка (GC). Хотя метилирование ДНК в Twist1
гена сообщалось в раковых клетках, механизмы, лежащие в основе активации транскрипции остаются неопределенными. В этом исследовании мы впервые исследовали эпигенетические изменения элемента Twist1
используя Twist1
транскрипционные-положительные и -отрицательное клеточные линии, которые вытекают из нашего установлены диффузного типа модели GC мыши. Лечение с помощью ДНК-деметилирования агент 5-аза-ПСТ реактивировать экспрессию Twist1 в Twist1 экспрессии-отрицательных GC клеток. Согласно метилирования специфической ПЦР и бисульфита анализа секвенирования, метилирование в CpG-богатой области в Twist1
кодирующего экзона 1, а не его промоторной области, был тесно связан с транскрипционной глушителей из Twist1 <бр> экспрессия в клетках мыши GC. Хроматиновые иммунопреципитации показали, что активная метка гистонов H3K4me3 был обогащен Twist1 экспрессии-позитивных клеток, и неактивным гистонов знак H3K9me3 был обогащен Twist1 экспрессии-негативных клетках. Уровни экспрессии Suv39h1
и Suv39h2
, гистонов метилтрансферазами для H3K9me3, были обратно коррелируют с Twist1
выражение, и нокдаун Suv39h1
или Suv39h2
индуцированное Twist1
выражение. Кроме того, Sp1 транскрипционный фактор, связанный с экзона 1 CpG богатых области в Twist1 экспрессии-положительных клеточных линий, и Twist1
выражение уменьшилось на митрамицин, который, что препятствует Sp1 связывание с CpG-богатых регуляторных последовательностей. Наши исследования свидетельствуют о том, что Twist1
транскрипции в клетках GC может регулироваться за счет потенциального сотрудничества метилирования ДНК, модификации гистонов в комплексе с Sp1 связывания с CpG-богатых регионов в пределах экзона 1 региона.
<Р> Образец цитирования: Сакамото A, Акияма Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) метилирование ДНК в экзон 1 области и комплексное регулирование Twist1 экспрессии в клетках рака желудка. PLoS ONE 10 (12): e0145630. DOI: 10.1371 /journal.pone.0145630
<р> Редактор: Tae-Young Рох, Пхохан университета науки и технологии (POSTECH), Республика Корея
<р> Поступило: 21 сентября 2015 года; Принято: 6 декабря 2015 года; Опубликовано: 22 декабря 2015
<р> Copyright: © 2015 Сакамото и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами-в-помощь по научным исследованиям (с) (24590444) и (а) (25253081) и Программа A3 Foresight (AA005) из Японского общества содействия развитию науки (JSPS), и практические исследования инновационного борьбы против рака (15Ack0106017h0002) из ​​Японского агентства по медицинским исследованиям и развитию, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.
<р> Конфликт интересов: авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Сокращения:. BS, бисульфит секвенирования; CGI, CpG острова; ЧИП, иммунопреципитация хроматина; DCKO дважды условно Нокаут мышь; DGC, диффузного типа рака желудка; GAPDH, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы; GC, рак желудка; H3K4me3, гистона H3 лизина 4 три-метилирование; H3K9me3, гистона H3 лизина 9 три-метилирование; H3K27me3, гистона H3 лизин 27 три-метилирование; MSP, метилирование специфических полимеразной цепной реакции; ОТ-ПЦР, с обратной транскрипцией и полимеразной цепной реакции; QRT-ПЦР, количественный ОТ-ПЦР; TSGs, гены-супрессоры опухолей; TSS, транскрипт начало сайта; 5-аза-О.К., 5-аза-2'-deoxycitidine

Введение
<р> Twist1, выступая в качестве основной спираль-петля-спираль фактора транскрипции, непосредственно связывается с E-коробчатых элементов (NCANNTGN ) на конкретных генов-мишеней [1]. Twist1 широко известно, что необходимо для формирования мезодермы во время раннего эмбрионального развития дрозофилы и мыши [2, 3]. В злокачественных опухолях человека, эктопическая экспрессия Twist1, как сообщается, связан со злокачественной прогрессии, инвазии, эпителиально-к-mechencymal перехода, метастаз и стволовости, что указывает на потенциальные онкогенные функции Twist1 [4-6]. Таким образом, очень важно выяснить, транскрипционные регуляторные механизмы Twist1 в раковых клетках.
<Р> эпигенетические изменения, такие как метилирование ДНК и модификации гистонов, которые тесно связаны с молчанием генов [7-9]. Хотя эпигенетические изменения на CGI (CpG острова) промоторной области генов-супрессоров опухолей (TSGs) хорошо известно, связаны с их инактивации генов [10], механизмы эпигенетической регуляции онкогенов мало изучены. Несколько групп показали, что Twist1
была вновь активирована обработкой де-метилирования препарат, 5-аза-2'-deoxycitidine (5-аза-ПСТ), в раковых клетках [11, 12]. Ненормальная метилирование ДНК на промотор CGI в человеческом Twist1
был часто обнаружен в первичных раковых заболеваний, включая рак желудка (GC) [11-14]. Тем не менее, есть много выводов, что метилирование ДНК в Twist1
область промотора не коррелирует с экспрессией гена в различных раковых заболеваний [12, 14]. В то время как Twist1
метилирования может быть полезным биомаркером для прогнозирования клинических исходов, чтобы рецидива и выживаемость у пациентов с раком [12, 13, 15], остается спорным или нет Twist1
метилирование в области промотора приводит к молчанию гена.
<р> регуляции транскрипции генов коррелирует с лизином (к) метилирования в гистона хвоста, которые состоят из трех различных состояний лизина метилирования (моно-, ди- и три-). Tri-метилирование H3K4 (H3K4me3) связан с активацией генов, и что из H3K9me3 и H3K27me3 к репрессии генов [7-9]. Хотя эти три модели гистонов H3-methyaltion связаны с CGI метилирования, а также, транскрипционные регуляторные механизмы Twist1
лежащие в основе модификации гистонов плохо изучены в раковых клетках.
<Р> GC является вторым наиболее частым причиной смерти от рака в мире [16]. GC классифицируется на два основных гистологических типов; диффузного и кишечного тракта, которые являются двумя различными канцерогенными пути [17]. Диффузный тип рака желудка (ДГК), как известно, показывают частые инвазию и метастазирование опухолей, что приводит к плохим прогнозом [18]. Потеря E-кадгерина и р53 было сообщено в диффузного типа рака желудка [19-21]. Несколько сообщений продемонстрировали частые избыточную экспрессию Twist1 в человека [22 РСК, 23].
<Р> Ранее мы проектировали двойной условного нокаута (DCKO) мыши линии, чтобы Е-кадгерина и р53, которые специфически инактивирует в желудке [ ,,,0],19]. Все мыши DCKO разработали фатальные РСК в течение года, фенотипы является высокая травматичность и частые метастазы в лимфатические узлы. Следует отметить, что экспрессия гена закономерности в РСК мышей DCKO обнаруженных на микрочипов анализа были очень похожи на те, отличных от кишечных тех первичных человеческих РСК. Таким образом, наша модель мыши DCKO является мощным инструментом для исследования роли функции генов в DGC канцерогенеза и для разработки терапевтической стратегии. В данном исследовании мы установили Twist1 выражение-положительные и -отрицательные линии DGC клеток, которые являются производными от мышей DCKO. В результате анализа эпигенетических изменений, общий механизм регулирования Twist1
была выяснена, и оценивали в обоих мышиных и человеческих РСК в данном исследовании.

Материалы и методы

Заявление по этике
<р> Все в естественных условиях
процедуры были одобрены Animal Care комитета Токийского медицинского и стоматологического университета (разрешение No. 0160073A) путем. Что же касается обычных желудочных слизистыми оболочками образцов человека, письменное информированное согласие было получено от всех субъектов, и исследование было одобрено Комитетом по этике Токио медико-стоматологического университета (No.1115) с помощью.

клеточных культурах и образцы тканей

ранее мы установили E-кадгерина /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; CDH1
LoxP /LoxP
; Trp53
LoxP /LoxP
) модель мыши [19]. Из своих раковых тканей, мы установили пять линий мышей DGC клеток и назвал их MDGCs (SHIMADA S, неопубликованные наблюдения). MDGC-1 и клеток MDGC-3 культивировали в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и MDGC-7, MDGC-8 и MDGC-9 культивировали в F12 Хама с добавлением 5% лошадиной сыворотки. ДНК-анализ был проведен с целью обнаружения усеченный CDH1
и Trp53
аллели (S1) Рис. Восемь GC линии клеток человека (КАТО-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 и HSC60) также были использованы в данном исследовании. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY и КАТО-III были приобретены у банка клеток RIKEN (Цукуба, Япония). NUGC4 и AGS клетки были получены из научно-исследовательского ресурсов банка человека (Осака, Япония) и АТСС (American Type Cell Collection). Клетки HSC60 были получены от доктора Кадзуёси Янагихара (Национальный научно-исследовательский центр рака, Токио, Япония) [24]. КАТО-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS и HSC60 клетки культивировали в среде RPMI 1640, и GCIY культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, оба из которых были с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для исследований Деметилирование, мышиных и клеток человека GC ежедневно обрабатывали при 500 нм 5-аза-дезоксицитидин (5-аза-ПСТ, Sigma; # A3656) в течение 72 часов. Мы лечили эти GC клетки с 100 нМ трихостатин A (TSA, Вако;È-11993) в течение 24 часов или 100 нМ митрамицин A (WAKO;„-17101) в течение 24 часов}

Восемнадцать первичные ткани GC и соответствующий. незлокачественные желудка слизистая были получены из 15 мышей DCKO. Что касается тканей желудка человека, мы использовали три незлокачественный желудка слизистые оболочки от пациентов GC. Мы также получили пять нормальных желудка слизистые оболочки от Atp4b-Cre
^{-
; CDH1
LoxP /LoxP
; Trp53
LoxP /LoxP
мышей, которые были использованы в качестве отрицательного контроля в нашем предыдущем исследовании [19]. В данном исследовании мы назвали "нормальным желудка слизистая", если образцы были получены из контрольных мышей, и "незлокачественный желудка слизистая", если образцы были получены от мышей DCKO и пациентов GC человека в данном исследовании.}

обратной транскрипции (RT) -PCR и количественный оТ-ПЦР (QRT-PCR),
<р> Общую РНК выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen;˥34) и кДНК получали из РНК с использованием набора SuperScript III (Invitrogen;´80044) в соответствии с протоколами производителя. Конечная точка RT-PCR проводили с несколькими номерами цикла, 28-35 циклов. В качестве внутреннего контроля, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы ( GAPDH
) амплифицировали с помощью 21 циклов, чтобы гарантировать качество кДНК и количество для каждого RT-PCR. Усиленные продукты были загружены на 2% агарозном геле, или количественно с помощью количественного ОТ-ПЦР с использованием ДНК LightCycler Master SYBR Green I (Roche Diagnostics,/07516001). Программы амплификации для ПЦР повторяли 40 циклов для GAPDH и 45cycles для других генов GAPDH кроме. Продукты ПЦР клонировали в pMD20 T-вектор с использованием Могущественным TA-Cloning Kit (Takara Bio Inc;ɚ8), а затем секвенировали. Последовательности праймеров и размеров ПЦР-продукта приведены в таблице S1.

метилирования Анализ
<р> Отбирали геномную ДНК из мышиных и линий ГХ клеток человека методом фенол-хлороформ, а затем проводят бисульфит модификация и процедура MSP. Бисульфит обработка ДНК осуществляли с помощью EZ метилирование ДНК-Gold (Zymo исследования; # D5006), а затем проводили метилирование-специфической ПЦР (MSP). Вкратце, реакцию ПЦР проводили в течение 35 циклов в 25 мкл смеси, содержащие бисульфит-модифицированной ДНК, 2.5μl 10Х ПЦР буфера, 1,25 мкл 25 мМ дНТФ, 25 пмоль /л каждого праймера и 1 ед JumpStart RedTaq полимеразы (Sigma; # D0563). Условия для ПЦР были следующими: 95 ° С в течение 5 минут; 35 циклов 95 ° С в течение 1minutes, 53 ° C для 2minutes и 72 ° C для 1.5minutes; и конечным удлинением при 72 ° С в течение 5 минут. Что касается мыши тканей GC, ДНК экстрагировали из фиксированных формалином парафиновых срезах (FFPE) тканей. Бисульфит ДНК амплифицировали с помощью фланкирующих праймеров для ПЦР и затем вложена MSP проводилось [25, 26]. Последовательности праймеров и размеров продуктов ПЦР показаны в таблице S2

иммунопреципитации хроматина (ЧИП) анализ
<р> Анализ ЧИП проводили с использованием набора ЧИП-IT Express (Активный Motif;Ȓ08). в соответствии с протоколом производителя. Иммуноосажденного обогащение ДНК нормализованы к входу. Антитела, используемые в данном исследовании, были анти-гистонов H3K4me3 (Active Motif;Ə15), анти-H3K9me3 (Active Motif;ƍ65), анти-H3K27me3 (Active Motif;Ƈ55), анти-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , анти-Sp1 (Abcam; # ab13370), и анти-гистона H3 (Active Motif;Ƈ63) антитела. Нормальный кролика IgG (Cell Signaling Technology;Đ9s), использовали в качестве отрицательного контроля для микросхеме. Последовательности праймеров и размеров продуктов ПЦР показаны в таблице S2.

нокдаун анализ с использованием малых интерферирующих РНК
<р> миРНК на основе нокдаун Suv39h1
и Suv39h2
осуществляли с помощью электропорации (система трансфекции неон, Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Клетки MDGC трансфицировали 50nm миРНК из Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226) или отрицательный контроль миРНК (миРНК Миссия Универсальной отрицательный контроль, Sigma). После 48 часов культивирования клетки собирали для ОТ-ПЦР, Вестерн-блот-анализ, миграцию, инвазию и анализ пролиферации.

Вестерн-блот анализ
<р> GC клетки лизируют буфером Pierce RIPA (Thermo Научные;΃00). Белки разделяли на SDS-полиакриламидном геле, а затем переносили на поливинилиденфторид (PVDF) мембранах с последующей инкубацией с антителами, растворенные в Трис-буферном солевом растворе (TBS), содержащем 2% обезжиренного молока и 10% Tween 20. В качестве первичных антител, используемых в этом исследование были мышиные моноклональные анти-Twist1 (1: 100, Санта Круз Био-технологии; # SC-81417), кроличьи поликлональные анти-Sp1 (1: 200, Активный Мотива;Ɔ58), и мышиные моноклональные анти-α-тубулина ( 1: 200, Santa Cruz, # SC-8035) антител. Вторичные антитела были щелочной фосфатазы-конъюгированные анти-IgG кролика (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6518) и анти-мышиного IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6520). Пятна были разработаны с ImmunoStar AP субстратом (Bio-Rad Laboratories,ª5018)

Иммуногистохимия
<р> FFPE секции (4 мкМ) депарафинировали в ксилоле, регидратации в градуированных растворов этанола, а затем поиск антигену. проводили в 10 мМ буфера лимонной кислоты в микроволновую печь. Иммуногистохимическое проводили с использованием анти-Twist1 антител (Santa Cruz, 1:20), как описано ранее [19]. Выражение Twist1 было определено как положительное ядерное окрашивание в более чем 10% клеток, а интенсивность был забит AS- (отрицательный), + (слабый) и ++ (от умеренной до сильной) тремя исследователями независимо друг от друга.

Результаты

выражение Twist1 в мышиных и человеческих линий клеток GC
<р> Из DGC тканей мышей DCKO, Twist1
транскрипционные-положительные клеточные линии (MDGC-7, MDGC- 8 и были установлены MDGC-9), так и отрицательные клеточные линии (MDGC-1 и MDGC-3) (рис 1А и S2A рис), и экспрессия белка Twist1 была подтверждена в каждой клеточной линии (фиг.1В). Twist1 экспрессия усиливается на уровне мРНК и белка в выражении-негативных клетках Twist1 MDGC после обработки ДНК деметилирования агентом 5-аза-ПСТ (рис 1C и 1D), в то время как его экспрессия не была изменена после обработки ингибитором гистондезацетилазы TSA (S2B Инжир). В исследовали восемь линий ГХ клеток человека, Twist1
выражение подавляются в четырех клеточных линиях (рис 1E, слева), три (КАТО-III, GCIY и AGS), из которых продемонстрировали повторная активация Twist1
выражение после обработки 5-аза-ПСТ с помощью RT-PCR (например, рис 1E, справа). Что касается Twist1
выражение-положительные линии клеток GC, после того, как 5-аза-ПСТ лечения, 2.1- и 3.2 раза повышающую регуляцию Twist1
был обнаружен в MKN45 и MKN7, соответственно, по QRT-PCR, тогда как экспрессия Twist1 не было изменено в MDGC-9 клеток (рис. 1F)

CGI метилирования и выражение Twist1
в GC клеточные линии

Twist1
имеет плотную CGI область от промотора ко всему экзона 1, эта область будучи высоко консервативны среди позвоночных, включая мыши и человека (S3) рис. Для уточнения CGI в мыши и человека Twist1
, мы провели вычислительный анализ с помощью УСК Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) и MethPrimer (HTTP: //www.urogene. орг /methprimer /), который широко используется в качестве идентификации CGI и MSP праймеров [27]. Мы проанализировали примерно 1,4 кб области, включающей промотор и весь экзон 1. УСК Genome Browser на мышь и человеческого анализа выставлены один CGI в регионе изучены (данные не показаны). Тем не менее, предполагаемые два CGI-сайты были обнаружены в регионе как мыши и человека, когда мы использовали критерии CGI с содержанием GC 50% и наблюдается /ожидаемый коэффициент CpG 0,8 по MethPrimer (рис 2A и 2C). Эти две предположительные регионы CGI были расположены на промоторе и экзоне 1. Так как метилирование промоторной области было сообщено в различных злокачественных опухолях человека [12, 14], мы сначала исследовали статус метилирования в регионе в мышиных и человеческих линий клеток GC ССП. Тем не менее, статус метилирования в промоторной области Twist1
не соответствует его экспрессии в любых линиях GC клеток исследовали область (P1, рис 2A). Для определения критически метилированные регионы, связанные с выражением Twist1 в клетках MDGC, далее мы проводили ПМП в области CGI в экзоне 1 (E1-1, E1-2 и E1-3), и предсказанное берег сайт CpG, расположенный примерно в 1,6 кб из TSS (начало сайта транскрипт, S1) (рис 2А). В результате, CGI-метилирование в регионе (E1-1 и E1-2) вокруг УТП в Twist1
экзон 1 было установлено, что соответствует экспрессии гена в клетках MDGC, хотя не было никакой корреляции между их в предсказанное берегового области (S1) и в конце экзона 1 области (E1-3) (рис 2B, слева) в клетках MDGC. Ни один метилирование не был обнаружен в любых районах CpG в трех нормальных желудка слизистыми оболочками без всякого выражения Twist1 от Atp4b-Cre
^{-
; CDH1
LoxP /LoxP
; Trp53
LoxP /LoxP
мышей (рис 2B). В слизистой оболочке желудка человека, нет Twist1
метилирование был также найден в трех нераковая желудочной слизистой оболочки от GC пациентов (рис 2D), один из которых показал очень слабый Twist1
выражение (данные не показаны ). Мы также исследовали четыре дополнительных незлокачественный желудка слизистые оболочки от пациентов GC, в то время как не метилирование не был обнаружен в E1-2 области в любых случаях (данные не показаны). Бисульфит секвенирование (BS) показал, что область CGI в экзоне 1 показали плотную метилирование в клетках Twist1 экспрессии-отрицательных MDGC-3, но не в Twist1-положительных MDGC-9 клеток (BS-с, рис 2А и 2В, справа), в то время не было никакой разницы в характере метилирования между ними на берегу CpG и промоторных областей (BS-а и BS-B, S4A рис). Среди линий человеческих клеток GC, Kato-III и GCIY без Twist1
выражение показал густую CGI метилирование области экзона 1 (E1-2), которая согласуется с одними из мыши Twist1
(фиг.2С и 2D, слева). Оба метилирование и unmethylation в E1-2 области были обнаружены в MKN7 и MKN45 клеток ССП и бисульфита секвенирования (рис 2D), которые базально выраженными Twist1 но их уровни экспрессии были увеличены после обработки 5-аза-ПСТ (рис 1F). Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что метилирование в экзон 1 области Twist1
обнаружен в данном исследовании коррелирует с его экспрессии.}

Twist1
метилирования и экспрессии в DCKO мыши GC образцы ткани
<р> Мы исследовали статус метилирования Twist1
с помощью 18 первичных тканей GC из 15 мышей DCKO. Поскольку GC регионы были очень малы, и их ДНК из образцов FFPE показали низкие концентрации, мы выполнили вложенную ПМП [25, 26]. Twist1
значительно метилируется (9/18, 50%) в первичных ШС по сравнению с соответствующими нераковых тканей (1/10, 10%), статистически значимое различие (P &лт; 0,05, таблица 1). Типичные данные по МПВ показаны на рис 3А. Среди них, 4 из 10 (40%) случаев были intramucosal и 5 из 8 (62,5%) были инвазивной ГКС (таблица 1). В этом исследовании, Twist1
метилирования-положительных случаев продемонстрировал неметилированные полосы MSP, а также, что из-за наличия нормальных стромальных /фибробластами и воспалительных клеток в срезах ткани рака, хотя мы не могли отрицать возможность частичного метилирования как MKN45 и MKN7 и опухолевой гетерогенности.
экспрессии белка <р> Twist1 был обнаружен у 7 из 18 (38,9%) ГКС по сравнению с соответствующими незлокачественный слизистые оболочки желудка с помощью иммуногистохимии. Типичные фотографии показаны на рис 3B. Кроме того, мы проанализировали связь между Twist1
уровней экспрессии и метилирования в этих случаях. Среди исследовали 18 первичного GC, девять случаев показали корреляцию между Twist1
метилирование и выражение (рис 3C). Три из четырех случаев со слабым выражением Twist1 выставлены его метилирование, возможно, что низкая экспрессия Twist1 может быть вызвано его метилирования. Тем не менее, оставшиеся пять случаев не обнаруживали метилирование и экспрессию (таблица 1).

метилирования гистонов связано с регулированием Twist1
выражение
<р> Затем мы исследовали, может ли или нет лизина уровень метилирования гистона H3 способствует Twist1
выражения. Иммунопреципитации хроматина (CHIP) анализы проводили на предсказанной CpG берегу (CP1.3k), промотор (СР1), и экзоны 1 (CE1-1 и CE1-2) и 2 (CE2) области (рис 2А). В регионах CP1 и CE1-2, активный знак гистонов H3K4me3 был обогащен Twist1 экспрессии-позитивных клеток (MDGC-7 и MDGC-9), но неактивен гистонов знак H3K9me3 был обогащен Twist1 экспрессии-негативных клеток (MDGC-1 и MDGC -3) (рис 4А и 4Б). ChIP анализы выставлены как H3K4me3 и сигналы H3K9me3 в MDGC-1 и клеток MDGC-3 с 5-аза-ПСТ лечения, что указывает на повышенные уровни H3K4me3 в этих клетках (рис 4в). Напротив, уровни H3K27me3 и H3K36me2 не коррелировали с выражением Twist1 в любых клетках MDGC, рассмотренных в данном исследовании. Что касается линий GC клеток человека, подобный регион, расположенный от промотора экзона 1 показал H3K4me3 обогащение в Twist1
выражение-положительных MKN45 клеток и H3K9me3 в Twist1
выражения-отрицательных КАТО-III клетки (рис 2C и 4D).

Suv39h1
и Suv39h2
, гистонов метилтрансфераза, регламентирует H3K9me3
<р> Там много гистонов метилтрансферазам ассоциированных с H3K4, H3K9 и H3K27 [28]. Поэтому, чтобы определить, какие модификации гистонов ферменты ответственны за обогащение H3K4me3 или H3K9me3 в положении Twist1
экзон 1 область в GC клетки, мы исследовали десять H3K4me3 ( Mll1
, Mll2
, Mll3
, Mll4
, Setd1a
, Setd1b
, ASH1
, Ash1l
, Smyd3
и Meisetz
), семь H3K9me3 ( Suv39h1
, Suv39h2
, G9a
, Setdb1
, Clld8
, Glp
и RIZ1
), и один H3K27me3 ( Ezh2
) родственные гены. Типичные данные представлены на рис 5А. Среди них, уровни экспрессии Suv39h1
и Suv39h2
были обратно коррелируют с Twist1
выражения. Тем не менее, уровни экспрессии оставшихся 16 генов гистонов methylatasferase рассмотрены не были связаны с Twist1
экспрессии в клетках MDGC. Мы выполнили миРНК на основе нокдаун Suv39h1
или Suv39h2
в соответствующих экспрессионных-положительных MDGC-1 и MDGC-3 клетки посредством электропорации (рис 5б). Нокдаун Suv39h1
или Suv39h2
в этих клеточных линий привело к увеличению Twist1
выражение наблюдаемой на RT-PCR (рис 5б) и QRT-PCR (MDGC- 1, рис 5C)

Ассоциация Sp1 с транскрипционной регуляции Twist1

<р> консенсус 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( последовательность G /A) (C /T) -3 'известен как мотив связывания транскрипционного фактора Sp1, и связь между CGI-метилирование и Sp1 связывания в промоторе сообщалось [29, 30]. Несколько сайтов связывания Sp1 были предсказаны в CpG-богатой области в Twist1
экзон 1 с TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) и Джаспер (http://jaspar.binf.ku.dk) , Роль Sp1 в транскрипции Twist1
Затем исследовали со ссылкой на эпигенетические модификации гена. Мы обнаружили экспрессию мРНК Sp1 и белка во всех мышиных и человеческих клеток GC обследованных, даже в выражении-отрицательных MDGC-1, MDGC-3, KATOIII и GCIY клеток Twist1 (рис 6А).
<Р> Для того, чтобы определить, действительно ли не Sp1 связывается с регионами Twist1
промотора и экзона 1 в клетках GC, мы провели количественный анализ ChIP Sp1 с использованием клеток MDGC (рис 2А). Sp1 связаны с регионами Twist1
промотор (CP1) и экзона 1 (CE1-2) в Twist1 экспрессии-позитивных клеточных линиях (MDGC-7 и MDGC-9) (рис 6б). В противоположность этому, Twist1 выражение-отрицательные клеточные линии (MDGC-1 и MDGC-3) показали неопределяемый уровень Sp1 связывания сигналов на участках CP1 и CE1-2. Sp1 не связывался ни в регионах прогнозируемого CpG берега (CP1.3k) и экзона 2 (CE2) областях в этих Twist1 выражение-положительных и -отрицательные клеток MDGC. Деметилированием с 5-аза-ПСТ увеличил Sp1 связывания на Twist1
промотора и экзона 1 регионов в MDGC-1 и MDGC-3 клеток экспрессии отрицательным Twist1 (рис 6б). Митрамицин А, как известно, мешает Sp1 связывание с CpG-богатых регуляторных последовательностей [31, 32]. Было отмечено, что Twist1
выражение вниз регулируется после обработки митрамицин А в своем выражении-позитивных клеток GC (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 и MKN45 клетки) (рис 6C и S6) Рис. Митрамицин А не показывают никакого влияния на Sp1 экспрессии в этих клетках (данные не показаны). Up-регулирования Twist1 Ру по 5-аза-ПСТ уменьшилась на митрамицин лечение в клетках MDGC-3 (P = 0,04, рис 6D).

Обсуждение
<р> механизмы, лежащие в основе эпигенетической регуляции онкоген плохо изучены. Взаимосвязь между статусом метилирования на Twist1
промоторных областей и выражение Twist1
является спорным, и нет почти ни один из отчетов об измененном модификации гистонов в Twist1
выражения. Таким образом, остается неясным, является ли эпигенетические изменения связаны с Twist1
активации в раковых клетках. По мере появления новых находок в данном исследовании мы осветил Twist1
регулирующий механизм, лежащий в основе фундаментальной эпигенетическую техники, что метилирование ДНК, модификации гистонов и Sp1 действовать в согласии с выражением Twist1 в GC клетки.

Он широко известно, что метилирование ДНК в области CGI-промотором является критическим для молчанием генов и аберрантных результатов CGI-метилирование потере экспрессии различных TSGs [10]. Twist1 была вновь активирована в обоих мышиных и человеческих GC клеток с 5-аза-ПСТ лечения в этом исследовании, что указывает на транскрипционной активации Twist1 также модулируется с помощью метилирования ДНК. CGI метилирования Twist1
промоторной области был найден в различных видов рака, таких как желудка, молочной железы, колоректального и легких из них [11, 12, 14], большинство из которых не показали никакой корреляции между Twist1 <бр> метилирования и экспрессии. Мы наблюдали, что CGI-метилирование в Twist1
экзон 1, кроме как в области промотора соответствует его экспрессии генов в клетках мыши GC. Что касается линий ГХ клеток человека, <ЕМ> Twist1
выражение-отрицательные клеточные линии были полностью метилированный, но его экспрессия положительных линий клеток демонстрировали как метилирование и unmethylation из Twist1
, все из которых повышающей регуляции Twist1
выражение после обработки 5-аза-ПСТ (рис 1F). Эти данные указывают на то, что MKN45 и MKN7 клетки частично показали метилирование Twist1
, и половина уровней Twist1
выражение были базально обнаружены в этих клетках, которые были высказаны от неметилированной аллеля ДНК. Последние отчеты показали, что CpG метилирование берег относится к экспрессии генов [7, 33]. Тем не менее, статус метилирования в предсказанное CpG области берега сайта не коррелировала с Twist1
выражения. Наши данные указывают на то, что Twist1
эпигенетически подавляются метилирования ДНК в мышиных и клеточных линий GC человек.
<Р> Согласно вычислительного анализа мыши и человека CGIs от промотора на всей кодирующей области в Twist1
гена, два предполагаемых областей CGI были расположены в промоторе и экзоне 1 путем анализа MethPrimer. Здесь мы наблюдали, что CGI-метилирование в экзоне 1, а не его промоторной области, коррелировала с Twist1
экспрессии в клетках GC. Такие различные паттерны метилирования, связанные с молчанием генов было зарегистрировано в нескольких генов [26, 34, 35]. Например, SOX2
и AP2α
выставляются две предположительные CGIs на промоторе и экзоне 1, и метилирования в экзон 1 региона показал значительно коррелирует с его экспрессии генов в ШС и груди раковые заболевания [34, 35]. Было сообщено, что CGI-метилирование вокруг трансляционной стартового сайта в бета-рецептора ретиноевой кислоты (RAR-бета) гена резко соответствовал его экспрессии в мышиных рака легких по сравнению с метилирования в области промотора, расположенного в той же CGI [26]. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что CGI-метилирование в экзоне 1 в области Twist1
важно для его молчанием генов в клетках GC. Тем не менее, неизвестно, механизм этой противоречивой метилирования между промотором и экзона 1 областей. Несколько сайтов связывания транскрипционных факторов, таких как элементы sp1 и модификации гистонов были зарегистрированы, чтобы защитить CGI метилирования [36, 37]. Важно изучить эти элементы и эпигенетические механизмы в CGI регионах Twist1
дальше.

При первичном ШС от мышей DCKO, 50% ШС выставлены Twist1
метилирования вложенным MSP. Наши мышей DCKO показывают париетальных клеток, связанных с атипичной фокусы в желудке, и intramucosal РСК состоит из слабо дифференцированных клеток и перстнем клетки часто обнаруживаются в течение 6 месяцев. Таким образом, мы уже предложили, чтобы наши у мышей РСК DCKO разработали через теменную клеточной линии [19]. Twist1
метилировали в 40% intramucosal рака, в то время как частота метилирования в нераковая желудочной слизистой оболочки, включая атипичных очагов редко (10%), что свидетельствует о том, что Twist1
метилирование является ранней событие в DGC канцерогенеза в нашей модели мыши. Среди 18 первичных ШС исследованных пять случаев были оба Twist1
methylation- и выражение-отрицательные.

• PLoS ONE: Статины Attenuate хеликобактер пилори CagA Транслокация и снизить заболеваемость рака желудка: In Vitro и населен…
• PLoS ONE: эндоскопическая резекция По сравнению с гастрэктомия, чтобы лечить ранним раком желудка: систематическ…