PLoS ONE: DNA-Methylierung in der Exon-1-Gebiet und komplexe Regulation der TWIST1 Expression in Magenkarzinomzellen

Abstrakt

TWIST1 Überexpression in verschiedenen Krebsarten wie Magenkrebs (GC) häufig beobachtet. Obwohl die DNA-Methylierung des TWIST1
Gen in Krebszellen berichtet wurde, bleiben die Mechanismen Transkriptionsaktivierung zugrunde liegenden unsicher. In dieser Studie haben wir epigenetische Veränderungen der TWIST1
mit TWIST1
Transkriptions-positiven und -negativen Zelllinien, die von unseren etablierten diffusen Typ GC-Maus-Modell zunächst geprüft abgeleitet werden. Behandlung mit einem DNA-Demethylierung Mittel 5-Aza-dC reaktivierten TWIST1 Expression in TWIST1 Expression negativen GC-Zellen. Gemäß methylierungsspezifische PCR und Bisulfit-Sequenzanalyse, die Methylierung an der CpG-reiche Region innerhalb TWIST1
codierende Exon 1, statt dessen Promotorregion, fest an transkriptionalen Silencing des verlinkt TWIST1
Expression in Maus GC-Zellen. Chromatinimmunpräzipitation Tests zeigten, dass aktive Histon-Marke H3K4me3 in TWIST1 Expression-positiven Zellen angereichert wurde, und inaktive Histon-Marke H3K9me3 wurde in TWIST1 Expression-negativen Zellen angereichert. Die Expressionsniveaus von Suv39h1-
und Suv39h2
, Histon-Methyltransferasen für H3K9me3 wurden invers korreliert mit TWIST1
Ausdruck und Zuschlags von Suv39h1- in oder Suv39h2
induzierte TWIST1
Ausdruck. Darüber hinaus Faktor Sp1 Transkription zu dem Exon 1-Expression CpG-reiche Region in TWIST1 Ausdruck-positive Zelllinien und TWIST1
gebunden wurde von MTM vermindert, was die mit Sp1 Bindung an CpG-reichen regulatorischen Sequenzen stört. Unsere Studien legten nahe, dass die TWIST1
Transkription in GC-Zellen durch eine mögliche Zusammenarbeit der DNA-Methylierung reguliert werden könnte, Histon-Modifikation im Komplex mit Sp1 Bindung an CpG-reichen Regionen innerhalb des Exon-1-Region.

Zitat: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA-Methylierung in der Exon-1-Gebiet und komplexe Regulation der TWIST1 Expression in Magenkrebszellen. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10.1371 /journal.pone.0145630

Editor: Tae-Young Rohs, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), der Republik Korea

Empfangen: 21. September 2015; Akzeptiert: 6. Dezember 2015; Veröffentlicht: 22. Dezember 2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. von Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (24.590.444) und (A) (25253081) und der A3 Foresight-Programm Diese Arbeit wurde (AA005) von der japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) und die praktische Forschung für innovative Cancer Control (15Ack0106017h0002) aus Japan Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

Interessenkonflikt: Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Abkürzungen:. BS, Bisulfit-Sequenzierung; CGI, CpG-Insel; CHIP, Chromatinimmunpräzipitation; DCKO, Doppel-bedingte Maus Knockout; DGC, diffus-Typ Magenkrebs; GAPDH, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; GC, Magenkrebs; H3K4me3, Histon H3 Lysin 4 tri-Methylierung; H3K9me3, Histon H3 Lysin 9 tri-Methylierung; H3K27me3, Histon H3 Lysin 27 tri-Methylierung; MSP, Methylierungs-spezifischen Polymerase-Kettenreaktion; RT-PCR, reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion; qRT-PCR, quantitative RT-PCR; TSGs, Tumorsuppressorgene; TSS, transcript Startstelle; 5-Aza-dC, 5-Aza-2'-Desoxycytidin

Introduction

TWIST1 als Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren Transkriptionsfaktor wirkt, direkt bindet an E-Box-Elemente (NCANNTGN ) auf spezifische Zielgene [1]. TWIST1 ist allgemein während der frühen embryonalen Entwicklung von Drosophila und Maus [2, 3] als wesentlich für Mesodermbildung bekannt. In menschlichen Krebsarten wird ektopische Expression TWIST1 berichtet mit malignen Progression, invasion, epithelial-to-mechencymal Übergang, Metastasierung und stemness, die auf potenzielle onkogenen Funktionen TWIST1 [4-6] zugeordnet werden. Somit ist es sehr wichtig, die Transkriptionsregulationsmechanismen für TWIST1 in Krebszellen zu klären.

Epigenetic Veränderungen, wie DNA-Methylierung und Histon-Modifikation sind fest an gene silencing verknüpft [7-9]. Obwohl epigenetischen Veränderungen an der CGI (CpG island) Promotorregion von Tumorsuppressorgenen (TSGs) gut bekannt sind, mit deren Gen-Inaktivierung assoziiert werden [10] werden die Mechanismen der epigenetischen Regulation von Onkogenen schlecht verstanden. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass TWIST1
wieder aktiviert mit einem de-Methylierungs Medikament durch Behandlung wurde, 5-Aza-2'-Desoxycytidin (5-Aza-dC), in Krebszellen [11, 12]. Aberrant DNA-Methylierung an der CGI-Promotor in der menschlichen TWIST1
primäre Tumoren häufig erkannt wurde von Magenkrebs (GC) mit [11-14]. Dennoch gibt es viele Erkenntnisse, dass die DNA-Methylierung in der TWIST1
Promotorregion ist nicht mit der Expression des Gens in verschiedenen Krebsarten korreliert [12, 14]. Während TWIST1
Methylierung ein nützlicher Biomarker sein, die klinischen Ergebnisse als um eine Wiederholung und das Überleben bei Patienten mit Krebserkrankungen [12, 13, 15], bleibt es umstritten, ob die TWIST1
vorherzusagen Methylierung an der Promotorregion führt zu einer Inaktivierung des Gens.

transkriptionelle Regulation von Genen mit Lysin (K) Methylierungsmuster in der Histon-tail korreliert, die von drei verschiedenen Lysin Methylierungszuständen bestehen (mono-, di- und Tri-). Tri-Methylierung von H3K4 (H3K4me3) mit Genaktivierung bezogen, und das von H3K9me3 und H3K27me3 zu Gen Repression [7-9]. Obwohl diese drei Histon H3-methyaltion Muster als auch CGI-Methylierung verbunden, die Transkriptionsregulationsmechanismen für TWIST1
zugrunde liegenden Änderung Histon schlecht in Krebszellen verstanden werden.

GC ist die zweite am häufigsten Todesursache von Krebs in der Welt [16]. GC ist in zwei Haupt histologischen Typen klassifiziert; diffuse und Darm, die zwei verschiedene krebserregende Wege sind [17]. Diffuse-Typ Magenkrebs (DGC) ist bekannt, häufige Invasion und Metastasierung zu zeigen, in einer schlechten Prognose resultierenden [18]. Verlust der E-Cadherin und p53 wurde in diffuse-type Magen Karzinogenese [19-21] berichtet. Mehrere Berichte zeigten häufige Überexpression von TWIST1 in menschlichen DGCS [22, 23].

Wir entwickelt zuvor eine doppelte Knockout (DCKO) Mauslinie zu E-Cadherin und p53, die im Magen gezielt inaktiviert werden [ ,,,0],19]. Alle DCKO Mäuse entwickelten fatal DGCS innerhalb eines Jahres, die Phänotypen hohe Invasivität und häufige Metastasen in Lymphknoten zu sein. Es ist bemerkenswert, dass die Genexpressionsmuster von DGCS in den DCKO Mäuse auf Microarray-Analyse nachgewiesen, ähnlich den primären DGCS andere als Darm diejenigen des menschlichen waren. Somit ist unser DCKO Mausmodell ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle der Genfunktion in DGC Karzinogenese für die Untersuchung und für eine therapeutische Strategie zu entwickeln. In dieser Studie haben wir TWIST1 expression-positive und -negative DGC Zelllinien, die von den DCKO Mäusen abgeleitet sind. Als Folge der Analyse der epigenetischen Veränderungen wurde die gemeinsame Regulationsmechanismus von TWIST1
aufgeklärt, und in beiden murinen und humanen DGCS in dieser Studie ausgewertet.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Alle in vivo
Verfahren, die von der Animal Care Committee of Tokyo Medical and Dental University (Permission Nr 0160073A) genehmigt wurden. Wie bei normalen menschlichen Magenschleimhäuten Proben wurde eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Probanden erhalten, und die Studie von der Ethikkommission der Tokyo Medical and Dental University (No.1115) genehmigt wurde.

Die Zellkulturen und Gewebeproben

Wir haben festgestellt zuvor eine E-Cadherin /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) Mausmodell [19]. Von seiner den Krebsgewebe, haben wir fünf Zelllinien der Maus DGC und nannte sie MDGCs (Shimada S, nicht veröffentlichte Beobachtung). MDGC-1 und MDGC-3-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und MDGC-7, MDGC-8 und MDGC-9 wurden in F12 Hams ergänzt mit 5% Pferdeserum. DNA-Analyse wurde durchgeführt, um die abgeschnitten Cdh1
und Trp53
Allele (S1) Bild zu erfassen. Acht menschliche GC-Zelllinien (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 und HSC60) wurden ebenfalls in dieser Studie verwendet. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY und KATO-III wurden von RIKEN Zellbank (Tsukuba, Japan) erworben. NUGC4 und AGS-Zellen wurden aus der Humanwissenschaften Research Resources Bank (Osaka, Japan) und ATCC (American Type Handy Collection) erhalten. HSC60 Zellen wurden von Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japan) erhalten [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS und HSC60-Zellen wurden in RPMI 1640, und GCIY wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, die beide mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt wurden. (; # A3656 5-Aza-dC, Sigma) 72 Stunden lang für de-Methylierungsstudien, murinen und humanen GC-Zellen wurden täglich mit 500 nM 5-Aza-Desoxycytidin behandelt. Wir behandelten diese GC-Zellen mit 100 nM Trichostatin A (TSA, Wako;È-11993) für 24 Stunden oder 100 nM MTM-A (Wako;„-17101) für 24 Stunden}

Achtzehn primären GC Gewebe und entspricht. nicht-Krebs Magenschleimhäuten wurden aus 15 DCKO Mäusen erhalten. Wie für den menschlichen Magen Gewebe, haben wir Magenschleimhäuten von GC Patienten drei Nicht-Krebs. Wir erhielten auch fünf normalen Magenschleimhäuten von Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
Mäuse, die als negative Kontrollen in unserer früheren Studie verwendet wurden [19]. In dieser Studie nannten wir "normalen Magenschleimhäuten", wenn Proben von Kontroll-Mäusen erhalten wurden, und "Nicht-Krebs Magenschleimhäuten", wenn Proben aus DCKO Mäusen und menschlichen GC Patienten in dieser Studie erhalten wurden.}

Reverse Transkription (RT) -PCR und quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

Die Gesamt-RNA mit einem RNeasy Mini Kit isoliert (Qiagen;˥34) und cDNA wurde aus RNA hergestellt, ein hochgestelltes III (Invitrogen verwendet wird;´80044) nach den Protokollen des Herstellers. End-Punkt-RT-PCR durchgeführt mit mehreren Zyklenzahlen, 28-35 Zyklen. Als interne Kontrolle, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase ( GAPDH
) wurde mit 21 Zyklen amplifiziert cDNA Qualität und Quantität für jede RT-PCR sicherzustellen. Die amplifizierten Produkte wurden auf 2% Agarose-Gelen geladen oder durch quantitative RT-PCR quantifiziert LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics;/07516001). Die Verstärkung Programme für die PCR wurden für 40 Zyklen für GAPDH wiederholt und 45cycles für andere Gene mit Ausnahme von GAPDH. PCR Produkte wurden in den pMD20 T-Vektor kloniert, indem ein Mighty TA-Klonieren Kit (Takara Bio Inc.,ɚ8), und dann direkt sequenziert. Die Primersequenzen und PCR-Produktgrößen werden in S1 Tabelle gezeigt.

Methylierungsanalyse

Wir genomische DNA von murinen und humanen Zellinien GC durch die Phenol-Chloroform-Methode extrahiert und dann Bisulfit durchgeführt Modifikation und das Verfahren MSP. Die Bisulfit-Behandlung von DNA wurde mit EZ DNA-Methylierungs-Gold (ZYMO RESEARCH; # D5006) durchgeführt, und dann methylierungsspezifische PCR (MSP) durchgeführt wurde. Kurz gesagt wurde die PCR-Reaktion über 35 Zyklen in einem 25 ul Mischung, umfassend Bisulfit-modifizierte DNA, 2,5 ul von 10x PCR-Puffer, 1,25 &mgr; l 25 mM dNTPs, durchgeführt 25 pmol /l von jedem Primer und 1 U Jumpstart RedTaq Polymerase (Sigma; # D0563). Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: 95 ° C für 5 Minuten; 35 Zyklen von 95 ° C für 1 Minute, 53 ° C für 2 Minuten und 72 ° C für 1,5 Minuten; und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 5 Minuten. Wie für Maus GC Gewebe wurde DNA aus Formalin fixierten Paraffin eingebettetem (FFPE) Geweben extrahiert. Bisulfit-DNA wurde mit flankierenden PCR-Primern amplifiziert und dann verschachtelt MSP durchgeführt wurde [25, 26]. Die Primersequenzen und PCR-Produktgrößen sind in S2 Tabelle

Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) -Test

Der Chip-Test wurde eine ChIP-IT-Express-Kit unter Verwendung von (Active Motif;Ȓ08). nach dem Protokoll des Herstellers. Immunpräzipitierten DNA-Anreicherung wurde als mit dem Eingang normalisiert. Die Antikörper, die in dieser Studie verwendet wurden, waren anti-Histon H3K4me3 (Active Motif;Ə15), anti-H3K9me3 (Active Motif;ƍ65), anti-H3K27me3 (Active Motif;Ƈ55), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) Anti-Sp1 (Abcam; # ab13370) und anti-Histon H3 (Active Motif;Ƈ63) Antikörpern. Normales Kaninchen-IgG (Cell Signaling Technology;Đ9s) wurde als negative Kontrolle für ChIP verwendet. Die Primersequenzen und PCR-Produktgrößen sind in S2 Tabelle gezeigt.

Knockdown-Analyse unter Verwendung small interfering RNAs

siRNA-basierte Knockdown von Suv39h1-
und Suv39h2
wurde unter Verwendung einer Elektroporation (Neon Transfektionssystem, Invitrogen) durchgeführt. MDGC Zellen wurden mit 50 nM siRNA von Suv39h1- (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226) transfiziert oder negative Kontrolle siRNA (Mission siRNA Universal-Negativkontrolle, Sigma). Nach 48 Stunden Kultivierung wurden die Zellen für die RT-PCR gewonnen, Western-Blot-Analysen, Migration, Invasion und Proliferationsassay.

Western Blot Analyse

GC Zellen mit Pierce RIPA-Puffer lysiert (Thermo Scientific;΃00). Proteine ​​wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt und dann auf Polyvinylidenfluorid übertragen (PVDF) Membranen, gefolgt von einer Inkubation mit gelöstem Antikörper in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), enthaltend 2% Magermilch und 10% Tween 20. Die primären Antikörper in diesem verwendet Studie wurden monoklonale Maus-anti-TWIST1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, # sc-81417), polyklonalem Kaninchen-Anti-Sp1 (1: 200, Aktiv Motif;Ɔ58) und monoklonalen Maus-anti-α-Tubulin ( 1: 200, Santa Cruz; # sc-8035) Antikörper. Die sekundären Antikörper wurden mit alkalischer Phosphatase konjugiertem anti-Kaninchen-IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;
.706.518) und Anti-Maus-IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;
.706.520). Die Blots wurden mit ImmunoStar AP-Substrat entwickelt (Bio-Rad Laboratories,ª5018)

Immunhistochemie

FFPE Abschnitte (4 &mgr; M) wurden in Xylol entparaffiniert, in abgestuften Ethanollösungen rehydriert und dann Antigen Retrieval. wurde durch Erhitzen in der Mikrowelle in 10 mM Zitronensäurepuffer durchgeführt. Die Immunhistochemie wurde anti-TWIST1 Antikörpern durchgeführt unter Verwendung von (Santa Cruz, 1:20), wie zuvor beschrieben [19]. Die Expression von TWIST1 wurde als positive Kernfärbung in mehr als 10% der Zellen definiert, und die Intensität wurde erzielt Vermögenswerte (negativ), + (schwach) und ++ (moderat bis stark) von drei Forschern unabhängig.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Statine Attenuate Helicobacter pylori CagA-Translokation und reduzieren Inzidenz von Magenkrebs: In-vitro-und bevölkerungsbezogene Fall-Control Studies
• PLoS ONE: Die endoskopische Resektion mit Gastrectomy Im Vergleich zur Behandlung von Magenfrühkarzinomen: eine systematische Überprüfung und Meta-Analysis