PLoS ONE: antitumorsko djelovanje jednog Sirtuin inhibitora, Tenovin-6, protiv želučane stanica raka putem receptora smrti, 5 up-uredbe

Sažetak pregled

Do regulirano sirtuin 1 (SIRT1), An NAD ^{+ ovisna klasa III HDAC, Deacetilati p53 i inhibira njegovu transkripcijske aktivnosti, što dovodi do stanične opstanak. SIRT1 prekomjerna ekspresija je izvijestila da predviđaju lošije preživljenje u nekim malignih bolesti, uključujući rak želuca. Ipak, antitumorski učinak SIRT1 inhibicije dalje izmiče u raka želuca. Ovdje smo istražili antitumorskih mehanizme inhibitora sirtuin, tenovin-6, u sedam ljudskih staničnih linija raka želuca (četiri stanične linije s divljim tipom TP53 pregled, dva s mutiranim tipa TP53
i onaj s null TP53 Netlogu). Zanimljivo, tenovin-6 inducirana apoptoza u svim staničnim linijama, a ne samo one s divljim tipom TP53, pregled, ali i mutant tipa i null verzije, u pratnji regulaciji smrti receptora 5 (DR5). U KatoIII staničnoj liniji ( TP53 pregled -null), DR5 silencing značajno prigušuje tenovin-6-induciranu apoptozu, što sugerira da je središnji mehanizam koji svojim protutumorske učinke s obzirom na aktivaciju signala puta smrt receptora. Iako endoplazmatska mrežica stres uzrokovan sirtuin inhibitora je uočeno da inducira DR5 up-regulacije u drugim staničnim linijama karcinoma, nismo uspjeli pronaći označena aktivaciju svojih srodnih molekula, kao što su ATF6, motka, i usitniti, u želučanih stanica raka liječenih tenovin- 6. Tenovin-6 u kombinaciji s docetakselom ili SN-38 djeluje blagi do umjereni sinergistički citotoksičnost protiv želučanih stanica raka. U zaključku, tenovin-6 ima jaku antitumorsku aktivnost protiv ljudskih stanica raka želuca preko DR5 doreguliranje. Naši rezultati bi trebali biti korisni za daljnji klinički razvoj sirtuin inhibitora pregled}

Izvor. Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) antitumorsko djelovanje jednog Sirtuin inhibitora, Tenovin-6, protiv želučane stanica raka putem receptora smrti 5 naviše. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10,1371 /journal.pone.0102831 pregled

Urednik: Andrei L. Gartel Sveučilišta Illinois u Chicagu, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 28. listopada 2013. godine; Prihvaćeno: 23. lipnja 2014; Objavljeno: 17. srpnja 2014 pregled

Copyright: © 2014 Hirai et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od Grants-u-Aid iz Ministarstva obrazovanja, kulture, športa, znanosti i tehnologije Japana (s IH). Nema dodatnih vanjsko financiranje primljena je u ovom istraživanju. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca jedan je od glavnih uzroka smrti od karcinoma u svijetu [1], [2]. Iako su razvijeni razni kemoterapije za uznapredovali rak želuca, prognoza je još uvijek potrebna siromašni i novi antitumorski lijekovi za rak želuca. Rak želuca je biološki i genetski heterogena rak koji uključuje brojne genetske mutacije i epigenetičko alternacije [3]. Među njima, abnormalnosti u TP53 pregled supresorski gen tumor igraju važnu ulogu u nastanku tumora [4], [5]. Približno 30% bolesnika s karcinomom želuca imaju TP53 pregled mutacija [6]. Čak iu stanicama raka sa divljeg tipa (wt) TP53 pregled, to je izvijestio da je funkcija TP53 pregled suzbija negativne regulacije uključujući ubikvitiranja, metilacije, te deacetilacije [7], [8]. U tom kontekstu, to će biti obećavajuća strategija za pretpostaviti je da inhibicija tih negativnih regulatora rezultate u poboljšanju antitumorskih efekata kroz aktivaciju p53 u wt TP53 pregled karcinoma. Murine double minute 2 (MDM2) je glavni fiziološki antagonist p53 [7]. Mi smo ranije izvijestili da je inhibitor MDM2, nutlin-3, pokazali su snažan antitumorski učinak protiv želučanih stanica raka kroz aktivaciju p53 puta [9] pregled

Sirtuin 1 (SIRT1), prema NAD ^{+ -. Ovisni histon deacetilaze (HDAC), ima različite funkcije uključeni kromatina utišavanja, dugovječnost i genomske stabilnosti. Nalazi se u jezgri i djeluje kao senzor metaboličkog statusa stanica u opstanak i starenje pod genotoksični i oksidativnog stresa [10], [11]. Osim histona deacetilacije, ove funkcije dijelom ovisi o deacetilacije raznih ne-histona proteina koji uključuju transkripcije faktora: p53, forkhead kutija (FOXO) obiteljske bjelančevine, nuklearni faktor kB, c-myc, N-myc, E2F1 i hipoksije-induktivni transkripcijski faktori (HIF) 1α /2α; kromatina povezanih enzima: histon acetiltransferaze, P300, DNA-ovisne kinaze podjedinica Ku80 i TIP60; popravak DNA elemenata: Ku70, RAD51 i NBS1; i stanično signaliziranje faktori: STAT3, β-katenina i Smad7 [11] - [13]. SIRT1 fiziološki međudjeluje s p53 i umanjuje njegove funkcije putem deacetilacije na C-terminalnom Lys382 ostatak [12]. Pojačanom ekspresijom SIRT1 se naći u mnogim oblicima raka, kao što su želudac i crijeva [10], [14] i izvijestili da djeluje kao promotor tumora. SIRT2 jedna citoplazmatske NAD + - zavisne histon deacetilaza i Deacetilati histona H3 lizin 56 (H3K56) i a-tubulin. Ona također dijeli non-histon supstrata FOXO1, FOXO3 i p53 s SIRT1 [11]. Međutim, točan uloga SIRT2 ostaje nedostižan u biologiji tumora. Pregled}

U tom kontekstu, istraživali smo da li tenovin-6, mala molekula spoj koji inhibira SIRT1 i SIRT2 funkcije [15], [16], izvršio antitumorski učinci kroz aktivaciju p53 puta u stanicama raka želuca. Nedavno je objavljeno da Sirta inhibitori regulira prema gore smrtnu receptor 5 (DR5), član faktor nekroze tumora obitelji, u nekih vrsta raka [17], [18]. Dodatno smo proučavali uključivanje tog receptora na antitumorskom djelovanju tenovin-6 raka želuca. Nadalje, ispitali smo sinergizam tenovin-6 s konvencionalnim citotoksičnih lijekova za budući klinički razvoj u raka želuca. Pregled

Materijali i metode

Stanične linije

Sedam želuca stanica raka Korištene su linije: četiri stanične linije s wt TP53 pregled (MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), dvije stanične linije s mutiranim tipa (mt) TP53
(NUGC-3, STKM-1), a jedna stanična linija s null TP53 pregled (KatoIII) [19] - [21]. Stanične linije s wt TP53 pregled (MCF-7 raka dojke, HEK293 stanice bubrega humanog embrija) i MRC-5 normalni humani fibroblasti uključene su kao kontrola u toj studiji. MKN-45, NUGC-4 KatoIII i MRC-5 stanične linije dobivene su od Riken BRC Celi Bank (Tsukuba, Japan). SNU-1 i MCF-7 stanične linije su kupljeni od American Type Culture Collection (Rockville, MD). NUGC-3 i HEK293 stanične linije dobivene su iz Health Science Research potencijala banke (Osaka, Japan). STKM-1 i STKM-2 stanične linije su ljubazno daje dr Shunsuke Yanoma (Sveučilište grad Yokohama, Medicinski fakultet, Japan). Pregled

Kemikalije

Tenovin-6 je kupljen od Cayman Chemical Društvo (Ann Arbor, MI). Docetaksel, SN-38, cisplatin, 5-fluorouracil (5-FU), doksorubicin i thapsigargin dobiveni su od Wako (Osaka, Japan). Se otopi u dimetil sulfoksidu (DMSO) u koncentraciji od 20 mM, a alikvoti su pohranjeni na -20 ° C. Osnovne otopine se razrijede na željenu krajnju koncentraciju u mediju za rast, prije uporabe. Pregled

antitijela i Western blot analiza pregled

SDS-polyaclylamidegel elektroforeza i Western blotting su provedena kao što je prethodno opisano [22]. Primarni i sekundarni protutijela su kako slijedi. Zečjeg poliklonalnog antitijela protiv SIRT1 (D739), acetilirani (Ac) -p53 (Lys382), fosforiliran (Fosfo) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubulina (Lys40) smrt receptora 5 (DR5), Fas -associated smrt domena (FADD), otcijepi poli (ADP) -ribose polimeraze (PARP) (Asp214), i miš monoklonska antitijela protiv p21 ^{Waf /CIP1 pregled (DCS60), histona H3 (96C10) , p-aktin (8H10D10), α tubulina (DM1A) i C /EBP homologa proteina (isjeckati) (L63F7) i zeca monoklonska protutijela protiv TRAIL (C92B9), kaspaze-3 (8G10), inozitol-potrebna enzima (IRE ) 1α (14C10) i fosfo-RNA-ovisna protein kinaza, kao što su endoplazmatski retikulum kinaza (motka) (16F8) dobiveni su od tvrtke Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Mišje monoklonsko protutijelo na p53 (BP53-12) nabavljen je od Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monoklonalno antitijelo je od Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO), i anti-aktivirajući transkripcijski faktor 6 (ATF6) monoklonskih protutijela (70B1413.1) bio je od Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Zečje poliklonalno protutijelo Ac-histon H3 (Lys18) bio je od tvrtke Merck Millipore (Billerica, MA). I peroksidazom iz hrena (HRP), koje je konjugirano anti-mišji IgG ovce i anti-zečji IgG tovar serumi su iz GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Vezanje antitijela je otkriven pomoću premijer zapadni sustav ECL blot-otkrivanje (GE Healthcare), u skladu s uputama proizvođača. Intenzitet signala je kvantificirati pomoću eZ-capture II hemiluminiscenciju imaging sustav (ato, Tokyo, Japan). Pregled}

U stvarnom vremenu kvantitativni PCR za analizu SIRT1
i SIRT2 Netlogu Gene Expression pregled

uzorci RNA su iz stanični lizat pomoću High Pure RNA kompleta (Roche Diagnostics, Mannheim, Njemačka), u skladu s uputama proizvođača. Nakon genomska DNA uklonjena DNase, cDNA je pripremljena pomoću visokog kapaciteta RNA-za-cDNA kita (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). U stvarnom vremenu kvantitativni PCR je izvedena pomoću Biosystcms 7500 Brzo Real-Time PCR System (tnom City, CA). Primeri i TaqMan sonda za SIRT1 pregled i SIRT2 pregled dobiveni su od Applied Biosystems (Test ID: Hs01009005 i Hs00247263, odnosno), a one za 18S ribosomalni RNA (18S rRNA)
dizajniran i sintetizirani Sigma-Aldrich je kako slijedi: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (prednji primer), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (reverse primer) 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (sonde). Reakcije su provedene u tri primjerka, pod standardnim uvjetima termocikliranja koriste 30 ng cDNA, 900 nm primera, 250 nm probe, i Taqman Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), u skladu s uputama proizvođača. Pregled

RNA ekstrahiran od stanica su analizirani na relativne količine ciljnog gena ( SIRT1, SIRT2 pregled) i referentnog gena ( 18S rRNA pregled) kvantitativnom realnom vremenu PCR. pregled

WST-8 preživljavanje stanica testovi pregled

WST-8 kolorimetrijska ispitivanja su provedena pomoću brojanja Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japan), u skladu s uputama proizvođača. Stanice su nasađene u ploče s 96 jažica u gustoći od 5 × 10 ^{3 stanica po jažici u 100 ul medija za kulturu za 24 h, tretira s tenovin-6 72 sati, inkubirane u prisustvu WST-8 i zatim se analizira sa iMark čitačem mikroploča (Bio-Rad, Hercules, CA). pregled}

Analiza apoptoze protočnom citometrijom

Stanice su zasijane u uzgojne posude od 60 mm pri gustoći od 5 × 10 ^{5 po jelo. Nakon inkubacije s tenovin-6 (10 uM) ili ekvivalentnom količinom DMSO tijekom 72 sata, stanice su nježno podiže s Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA) pri sobnoj temperaturi 10 min. Stanice su zatim jednom isprane sa puferom fosfatne soli. Apoptotičke stanice otkrivene su dvostrukim bojanjem sa propidij jodid (PI) i fluorescein izotiocijanat (FITC) -obiljezenog aneksin V pomoću azcpin V-FITC Detection Kit apoptoze (Beckman Coulter, Brea, CA), u skladu s uputama proizvođača. tekuće citometrije je zatim izvedena sa FACS Calibur protočnom citometru (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i CellQuest softver (BD Biosciences). pregled}

ciljanja siRNA DR5

siRNA DR5 ciljanje je dizajniran korištenjem siDirect softvera (http://sidirect2.rnai.jp/), kao što je ranije [22] prijavljen. siRNA Transfekcija je provedena pomoću Lipofektamin RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), u skladu s uputama proizvođača. Kontrola siRNA je umjetna sekvenca dizajnirani da imaju najmanje homologije s ljudskim i mišem genima. Smisao i antisense pramenovi siRNA koji se koriste u ovom istraživanju bili su kako slijedi: DR5 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(smislu), 5'-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3' (suprotnog smjera); Kontrola siRNA, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(smislena), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (antisense). pregled

Za analizu učinaka siRNA na stanični rast i vijabilnost, stanice su stavljene na niski gustoća (1 × 10 ^{3 stanica po jažici) u pločice s 96 jamica koje sadrže 100 ul RPMI1640 mediju s 10% fetalnog goveđeg seruma (Sigma-Aldrich). Održivost transficiranih stanica ispitana 72 i 120 sati nakon transfekcije pomoću WST-8-testu. Pregled}

indeks kombinacije pregled

Da bi se odredilo da li tenovin-6 može poboljšati antitumorske učinke konvencionalnih hemoterapeutskih sredstava, mi koristi se indeks kombinacije (CI) i neki isobologram izračunatu CalcuSyn softver (Cambridge, UK), u skladu s medijan učinak principu Chou i Talalay [23]. U ovoj analizi, Cl > 1.3 pokazuje antagonizam; CI = 1,1-1,3 umjerena antagonizam; CI = 0,9-1,1 zbrojni učinak; CI = 0,8 - 0,9 blagi sinergizam; CI = 0,6-0,8 umjerena sinergizam; CI = 0,4 - 0,6 sinergizam; i CI = 0,2-0,4 jak sinergizam. pregled

Statistička analiza pregled

Svi pokusi su izvedeni trostruko i ponovljena su najmanje tri puta. Sve podatke izrazi se kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Značajnost razlika utvrđena je Studentovim t-testom i Dunnettovim testom. p pregled -values ​​< 0,05 smatrana značajnom pregled

Rezultati

Izražavanje SIRT1, SIRT2, i acetilirani (Ac) -p53 u želučanim staničnim linijama karcinoma
.

Prvo, ispitane su razine ekspresije SIRT1, SIRT2 i Ac-p53 u sedam staničnih linija raka želuca. Koristili smo HEK293 stanice za pozitivnu kontrolu SIRT1 /2 i MCF-7 stanice koje su tretirane s doksorubicinom za pozitivnu kontrolu Ac-p53 [24]. Svi želučani stanične linije raka osim NUGC-4 i STKM-1 stanica izražava visoke razine SIRT1 proteina i razine ekspresije SIRT2 bile visoke u svim stanicama, osim MKN-45 stanica (Slika 1A). Ac-p53 razine ekspresije bile su vrlo niske u svim želučanih staničnim linijama karcinoma s wt TP53 pregled. Pregled

Analizirali smo ekspresiju gena SIRT1 Netlogu i SIRT2
realnom vremenu kvantitativnim PCR. MKN-45 stanice pokazivale SIRT1 pregled ekspresije gena koja je oko 2,5 puta veća od one u fibroblastima, ali i druge stanične linije raka želučanih se nije (Slika 1B). U NUGC-4 stanica, razina ekspresije gena SIRT1 pregled bila je niska, kao što je bio SIRT1 proteina. MKN-45 stanice pokazuju malo visoka SIRT2 pregled, ekspresija gena, dok su druge stanične linije pokazao prilično niske razine ekspresije. Pregled

Tenovin-6 sputan rast želučane stanice raka

Kako bi za potvrdu tenovin-6 aktivnost, proučavali smo da li tenovin-6 utjecao acetilacije histona H3 i a-tubulina. Tenovin-6 povećala acetilacije histona u tri (MKN-45, NUGC-4 i KatoIII) od četiri želučanih tumorskih staničnih linija ispitanih, što ukazuje na inhibiciju aktivnosti deacetiliranja SIRT1 (Slika 2A). Ac-α-tubulina povećana samo u jednoj staničnoj liniji (MKN-45) tretirane s tenovin-6, stoga inhibicija SIRT2 deacetiliranja aktivnosti ne može definitivno je prikazano na želučanih stanica raka. Pregled

Zatim, procijenili smo potencijal antitumorski učinak tenovin-6 protiv želučanih stanica raka. Svaki rak želuca Stanična linija je kultivirana u prisutnosti tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20, i 50 uM) tijekom tri dana. Inhibicija rasta ovisna o dozi opažena je u svim staničnim linijama, a ne samo one s wt TP53 pregled, ali i mt i null verzije (slika 2b). Njihovi IC _{50 vrijednosti u rasponu od 2,34 do 4,28 uM. Osim toga, WST-8 Test je izveden u ljudskoj staničnoj liniji fibroblasta MRC-5 (IC 50: 6.09 uM) za usporedbu toksičnost tenovin-6 želučanoj staničnim linijama raka. Održivost NUGC-4 stanica tretiranih s tenovin-6 bila je značajno niža od one koju MRC-5 stanice, kao što je prikazano na Slici 2C, pregled}

Tenovin-6 apoptoze staničnu smrt kod stanice raka želuca pregled

Kao što je prikazano na slici 3A i S1, tenovin-6 tretmana povećao ekspresiju p53 i p21 u wt TP53 pregled stanice (MKN45 i NUGC-4). Doreguliranje Ac-p53 je bio prikazan u MKN-45 stanicama, a ne u NUGC-4 stanice. Povećana ekspresija p21 također je zabilježena u mt TP53 pregled stanice (NUGC-3). S druge strane, bcl-2 izraz nije se promijenio u gotovo sve četiri želučanog raka stanične linije. Povećanja DR5 i cijepanog PARP izrazu zabilježen je u svim ispitanih staničnih linija. Razine ekspresije TRAIL, koji djeluju kao ligand u spojka smrti signalizacije, malo je povećana u svim staničnim linijama, iako je izraz FADD, važan adapter, nije bio pod utjecajem tenovin-6. Pregled

ispituje da li tenovin-6 smanjen vijabilnost stanica želuca raka indukcijom apoptotičke smrti stanica. Stanice raka su izložene u koncentraciji od 10 uM ili ekvivalentne količine kontrolnog nosača (DMSO) kroz 72 sata, a zatim su obojene s FITC-aneksin V i PI. Oni su analizirani protočnom citometrijom: stanice su negativne za obje aneksin V i PI se smatralo da nisu apoptoze, stanice pozitivne za aneksin V su smatrani samo da se rano apoptoze, a stanice pozitivne na oba aneksin V i PI smatrale su se kasno apoptoze ili nekrotično. Izloženost MKN-45 stanica tenovin-6 povećana frakcija iz rane i kasne faze apoptoze od 2,8% do 52,1% i od 1,8% do 18,5%, respektivno (slika 3B). Slična povišenja populacija u ranoj i kasnoj fazi apoptoze su kod druge stanične linije (NUGC-4, NUGC-3 i KatoIII). Tenovin-6 inducirana apoptoza u svim ispitanim staničnim linijama, bez obzira na TP53 pregled stanja. Pregled

Učinak DR5 pregled obaranje na tenovin-6-inducirane apoptoze

Dalje, kako bi provjerili je li DR5 pregled utišavanje pogođeni tenovin-6-inducirana apoptoza, preživljavanje stanica i apoptotski stope su analizirane WST-8 testu i protočna citometrija, odnosno, u TP53 pregled -null KatoIII stanice. Inhibicija DR5 ekspresiju specifičnog siRNA (Slika 4A), značajno smanjuje tenovin-6-induciranu smrt stanice i apoptozu u stanicama (KatoIII Slici 4B i 4C). Koristili smo tri različita siRNA u preliminarnom pokusu, a mi smo dobili slične rezultate s bilo iRNK. pregled

Istražili smo aktivaciju endoplazmatska mrežica (ER) stres puta, koji je povezan s DR5 up-regulacije, kao što je prethodno opisano [17]. CHOP je jedan od najmoćnijih induktora DR5 i uzvodno od apoptoze, a često se oslobađa tijekom ER stresa. Kao što je prikazano na slici 5A i 5B, ali CHOP je neznatno doregulirana pomoću tenovin-6 tretmana sva četiri želučanim staničnim linijama raka, povećane razine su bile značajno niže od onih kod kontrolnih stanica tretiranih thapsigargin, što je selektivni inhibitor sarkoplazmatskog /endoplazmatska mrežica Ca ^{2 + - ATPases i naširoko koristi kao što je mobilni ER stresor [25], [26]. S druge ruke, IRE1, koji je ER senzor stres i nalazi se na uzvodno od CHOP, bila je malo up-regulirana tenovin-6 tretmana u svim staničnim linijama, ali ne fosforilirani razmetati i ATF6. [27], [28]. Činilo se nevjerojatno da tenovin-6 prouzročio ER stres dovodi do DR5 indukcije u našim želučanih stanica raka. Pregled}

antitumorsko djelovanje tenovin-6 u kombinaciji s kemoterapijskih agenasa

Na kraju, ispitali smo je li tenovin- 6 poboljšana antitumorskih efekata kemoterapijskih agenasa uključujući i docetaxel, SN-38, cisplatin, i 5-FU, u staničnim linijama raka želuca. Četiri stanične linije s wt TP53 pregled (MKN-45, NUGC-4), mt TP53 pregled (NUGC-3), a nula TP53 pregled (KatoIII) su tretirani samih ili u kombinaciji s dvije doze (2 i 5 uM) za tenovin-6 tih sredstava. Koncentracija je 0.25 nM docetaksel, 1 nM SN-38, 0.5 ili 1 uM cisplatin, i 0,25 uM 5-FU. Kao što je prikazano u Tablici 1 (i Slika S2), docetaksel i SN-38 pokazalo je blagi do umjereni sinergistički učinak na tenovin-6 tretmana u tri stanične linije i cisplatin s tenovin-6 umjeren sinergistički učinak u dvije stanične linije, a 5-FU u kombinaciji s tenovin-6 je pokazao nižu učinak od drugih sredstava. Ispitali smo izraze DR5 nakon primjene tenovin-6 sa kemoterapijskih agenasa. DR5 up-propisom tenovin-6 je pojačan s kombinacijom docetaksela u MKN-45 stanice (Slika S3). Pregled

Rasprava pregled

Pokazali smo da tenovin-6 pokazali su jaku antitumorsko djelovanje u pratnji apoptoze stanična smrt u ljudskim stanicama raka želuca s wt TP53 pregled, kao i one s mt TP53
. Nekoliko specifičnih inhibitora, kao što su sirtuins sirtinol, suramin, salermide i thiobarbiturates, su da inhibiraju rast stanica u različitim vrstama raka [29]. Većina istraživača opisano antitumorskih efekata sirtuin inhibitora u staničnim linijama kod wt TP53
[15], [29] - [31] i dodjeljuju ove na aktiviranje apoptoze putem acetilacije p53. U međuvremenu, nekoliko izvješća objavljena su u posljednjih nekoliko godina koje su pokazale antitumorskih aktivnosti sirtuin inhibitora u staničnim linijama sa mt TP53
kroz p53 neovisno o putovima [17], [18]. Pokazali smo da DR5 obaranje oslabljena antitumorskih učinaka tenovin-6 u TP53
-null želučanih stanica raka. Aktivacija signalnog puta smrt receptora putem up-regulaciji DR5 igra ključnu ulogu u tenovin-6-inducirane stanične smrti, kao što je spomenuto u drugim izvješćima o sirtuin inhibitora. Pregled

On je izvijestio da je salermide pojačan DR5 izraz i inducira apoptozu u ljudskim stanicama ne-malih stanica raka pluća nosi mt TP53 pregled [17]. U tom izvješću, simultano utišavanje u SIRT1 Netlogu i SIRT2 pregled, kao i salermide regulira prema gore DR5, u pratnji regulaciji ER povezanih sa stresom proteina, kao što ATF4 i usitniti. Ovi rezultati sugeriraju da je ER stres je bio uključen u ovaj DR5 indukcije. Nagađa smo da tenovin-6 je također dovelo do povećanja DR5 izražavanja putem aktivacije ER stresa posredovan motka, IRE1, ATF6, i usitniti. Međutim, suprotno očekivanjima, signal put od ER stresom aktivirana tenovin-6 nije očito otkrivena. Ipak, bilo je jasan dokaz da DR5 je izazvana tenovin-6. Postoje i drugi putovi CHOP-posredovane DR5 up-regulaciji: reactive oxygen species (ROS), C-lipanj NH _{2-terminalna kinaza (JNK) put, p38 mitogenom aktivirane protein kinaze, i tako dalje [ ,,,0],32] - [38]. Međutim, nismo ispitati te puteve ovdje, jer nismo mogli identificirati aktivaciju CHOP u našem istraživanju. Naši rezultati pokazuju da drugi p53- i CHOP-neovisni putevi sudjeluju u tenovin-6 inducirane DR5 ekspresije u želučanim stanicama karcinoma. Pregled}

Pokazali smo da tenovin-6 apoptoze smrt stanice aktivacije DR5 puta. Međutim, p53 i usitniti putevi činilo vjerojatno da će biti uključeni u ovaj DR5 indukcije, a mehanizam DR5 up-regulaciji ostaje nejasno. Mi smo, nedavno, istraživali antitumorskih učinaka tenovin-6 u nekoliko staničnih linija raka debelog crijeva, a našla je svoje snažno antitumorsko djelovanje protiv većine njih s regulaciji DR5, kao i [39]. Međutim, u CaCo2 stanica raka debelog crijeva (mt TP53
), apoptoze staničnu smrt tenovin-6 bio je manje izražen i DR5 izraz nije bio jako regulira prema gore. CaCo2 stanice su izvijestili da izražavaju visoku razinu šoka proteina topline poznat kao supresor DR5 [40] - [43]. Taj odnos treba dalje proučavati u budućnosti. SIRT1 može deacetylate histona H4 lizin 16 (H4K16), kao i H3K9, H3K14 i H1K26, koje su usko vezane za utišavanja gena [11]. Osim toga, ima mnogo odgovarajuće ne-histon supstrata: transkripcije faktore, strojevi elemente popravka DNK, nuklearne receptore, histona-modificiranje enzima i molekule stanične signalizacije, kao što je opisano na drugom mjestu [11] - [13]. Ti brojni i komplicirani udruge SIRT1 aktivnosti su uključeni u različite biološke funkcije, kao što regulaciji ekspresije gena i DNA oštećenja popravak. Stanice raka imaju tendenciju da zahtijevaju ove funkcije SIRT1 da bi preživjeli, razmnožavati i popraviti katastrofalne genomske štetu. Nedavne studije su identificirali sposobnost tenovin-6 da inducira diferencijaciju i inhibiraju autophagy kao dio svojih anti-tumorskih efekata u stanice leukemije [44], [45]. To može ovisiti o ponašanju stanica raka kako tenovin-6 utječe neoplastične aktivnost. Daljnja istraživanja potrebna su kako bi pojasniti vezu između tenovin-6-posredovane smrti puta i složenim ulogama SIRT1. Pregled

Ispitali smo učinke kombiniranja docetaksel, SN-38, cisplatin, i 5-FU s tenovin -6 jer su naširoko koristi za liječenje bolesnika s uznapredovalim rakom želuca [46], [47]. Blagi do umjereni sinergijskih učinaka docetaksel i SN-38 s tenovin-6 u staničnim linijama raka želuca, bez obzira na TP53 pregled stanja, pronađeno je, pregled

Premda postupci uključuju kombinacije docetaxela i sirtuin inhibitori nisu zabilježene, kombinacije docetaxela i drugih inhibitora HDAC kao što su trihostatin a i suberoilanilid hidroksaminsku kiselinu (SAHA) objavljeno je da imaju sinergističke učinke povezane s kaspaze aktivacije ili tubulina acetiliranja u nekoliko staničnih linija raka [48] - [50] , U našoj studiji, ostaje nejasno ako je tubulin acetiliranje by tenovin-6 je uvijek utjecala na antitumorsko djelovanje, jer je tubulin acetiliranje je prikazan samo u jednoj staničnoj liniji. SN-38 (oblik aktivnog irinotekan) je DNA inhibitor topoizomeraze koje djeluje samo u S fazu i ometa replikaciju DNA i stanične diobe [51], [52]. inhibitori HDAC izazvati acetiliranje histona i popustiti strukture kromatina, pri čemu inhibitor topoizomeraze može lakše pristupiti DNK, što olakšava oštećenja DNA [51], [53]. Osim toga, znatan porast ROS generacije je prijavljena u stanicama karcinoma pluća malih stanica nakon istovremeno djelovanje SAHA i topotekan (derivat kamptotecina) [51]. Povećanu mogućnost liječenja kombinacijom tenovin-6 i SN-38 može biti pripisati kooperativni regulaciju odgovora za oštećenje DNA. Pregled

Prednost kombinirane terapije tenovin-6 i cisplatin ili 5-FU je manja nego s drugim agentima u želučanih stanica raka, iako su nekoliko izvješća pokazala su povećanje apoptoze kombiniranom liječenju s cisplatinom ili 5-FU i drugih inhibitora HDAC u drugim tumorima [54] -. [57] pregled

što se tiče procjena toksičnost tenovin-6, koristili smo stanične linije fibroblasta kao i alternativne ne-tumorskih stanica predvidjeti toksičnost na normalne stanice koje se odnose na prethodna izvješća [15], [18]. Bilo je teško pronaći odgovarajuću normalnu kontrolu za komparativne studije, te je stoga definitivno potrebno za proučavanje toksičnost tenovin-6 (u kombinaciji s lijekovima protiv raka) in vivo pregled, pomoću životinja sa stranim tijelom modelima.

Zaključno, inhibitor sirtuin, tenovin-6, pokazalo je snažnu antitumorsko djelovanje protiv ljudskih stanica raka želuca. To je bio neovisan o TP53 pregled statusa te je inducirana putem up-regulaciji DR5. Daljnje istraživanje je potrebno razjasniti mehanizam kojim tenovin-6 regulira DR5 izraz. Tenovin-6 u kombinaciji s docetakselom i SN-38 imao mali prednost za inhibiciju proliferacije stanica raka želuca, koji bi mogao pružiti novu strategiju za liječenje uznapredovalog raka želuca. Pregled

popratne informacije pregled Slika S1. pregled Relativni intenzitet ekspresije proteini 'je prikazano na slici 3A. Semi-kvantificiranje Western blot denzitometrijska uključeni normalizacije za p-aktin razine
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0102831.s001
(TIF)
Slika S2. pregled utjecaja kemoterapijskih lijekova u kombinaciji s tenovin-6. Citotoksičnih efekata kemoterapijskih lijekova uključujući i docetaxel, SN-38, cisplatin, i 5-FU, a njihov poboljšanje učinaka tenovin-6 u želučanom stanice raka želuca stanica raka. Stanice su uzgajane tijekom 72 sata s naznačenim koncentracijama tenovin-6 i kemoterapijskih lijekova. A: Docetaksel (0.25 nM), B: SN-38 (1 nM), C: cisplatin (1 ili 0.5 uM; NUGC-3 se pomiješa s 0,5 uM cisplatinom) i D: 5-FU (0.25 uM) su dani u kombinaciji s tenovin-6. Statistička značajnost razlike između skupina procijenjena Dunnett test. * p izvoznici < 0,01; ** p izvoznici < 0.05. DOC: docetaksel, CDDP. Cisplatin pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s002 pregled (TIF) pregled slika S3. pregled DR5 izrazi nakon primjene tenovin-6 s docetakselom ili SN-38 u stanicama raka želuca (MKN-45 i KatoIII). Docetaksel, SN-38 i tenovin-6 primijenjena su u koncentraciji od 0.25 nM, 1 nM, a 2 uM. Semi-kvantificiranje Western blot denzitometrijska uključeni normalizacije na p-aktin razinama. DOC. Docetaksel pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s003 pregled (TIF) pregled