PLoS One: tumorellenes hatásai a Sirtuin inhibitor, Tenovin-6 ellen gyomorkarcinóma sejtek keresztül halálreceptor 5 Up-Regulation

absztrakt katalógusa

Up-szabályozott Sirtuin 1 (SIRT1), NAD ^{+ függő osztály III hiszton deacetiláz, dezacetiiezett p53 és gátolja annak transzkripciós aktivitását, ami a sejtek túlélését. SIRT1 overexpressziója számoltak megjósolni szegény túlélési bizonyos rosszindulatú daganatok, ideértve a gyomorrák. Azonban a tumorellenes hatásának SIRT1 gátlás megfoghatatlan marad a gyomorrák. Itt megvizsgáltuk a daganatellenes mechanizmus egy Sirtuin inhibitor, tenovin-6, a hét emberi gyomorrák sejtvonalakon (négy sejtvonal vad típusú TP53 katalógusa, két mutáns típusú TP53
, és egy null TP53 katalógusa). Érdekes, tenovin-6 indukált apoptózist minden sejtvonal, nem csak azok a vad típusú TP53,
hanem mutáns típusú és null verziók kíséretében up-regulációját halál-receptor 5 (DR5). A KatoIII sejtvonalat ( TP53
-null), DR5 hangtompító jelentősen gyengített tenovin-6-indukált apoptózis, ami arra utal, hogy a forgócsapos mechanizmus mögött tumorellenes hatásai alapul aktiválása a halál receptor jelátviteli út. Bár endoplazmatikus retikulum stressz által okozott Sirtuin inhibitorok jelentették indukál DR5 up-szabályozás más rákos sejtvonalak, nem találtunk jelentős aktiválását a kapcsolt molekulák, mint például a ATF6, PERK, és a CHOP, a gyomor rákos sejtek kezelt tenovin- 6. Tenovin-6 kombinálva docetaxel vagy SN-38 gyakorolt ​​enyhe-középsúlyos szinergikus citotoxicitás ellen gyomor rákos sejteket. Összefoglalva, tenovin-6 hatásos tumorellenes hatását humán gyomorrák sejtek keresztül DR5 up-szabályozás. Eredményeink hasznos lehet a jövőben klinikai fejlesztése Sirtuin inhibitorok. Katalógusa}

Citation: Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki, H et al. (2014) tumorellenes hatásai a Sirtuin inhibitor, Tenovin-6 ellen gyomorkarcinóma sejtek keresztül halálreceptor 5 Up-rendelet. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10,1371 /journal.pone.0102831 katalógusa

Szerkesztő: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: október 28, 2013; Elfogadva: június 23, 2014; Megjelent: július 17, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Hirai et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott Grants-in-támogatás az Oktatási Minisztérium, Kulturális, Sport, Tudományos és Technológiai Japán (az IH). Nincs szükség további külső finanszírozást kapott ebben a vizsgálatban. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

gyomorrák egyik fő oka a rák a halál világszerte [1], [2]. Habár a különböző kemoterápiás szerekkel előrehaladott gyomorrák dolgoztak, a prognózis továbbra is gyenge, és daganatellenes gyógyszerek gyomorrák van szükség. A gyomorrák egy biológiailag és genetikailag heterogén rák érintő számos genetikai és epigenetikai váltakozás [3]. Ezek között, rendellenességek a TP53
tumorszuppresszor gén fontos szerepet játszanak a tumorigenezisben [4], [5]. Körülbelül 30% -ánál a gyomorrák van TP53 mutáció katalógusa [6]. Még a rákos sejtek vad típusú (WT) TP53 katalógusa, arról számoltak be, hogy a funkció a TP53
elnyomja negatív szabályozásában, beleértve a ubikvitinezés, metilezés, és deacetiláció [7], [8]. Ebben az összefüggésben, hogy lenne egy ígéretes stratégia azt feltételezni, hogy gátlása ezek a negatív szabályozók eredményeket fokozása tumorellenes hatások aktiválása révén p53 tömeg TP53
rák. Rágcsáló kettős perc 2 (MDM2) jelentős fiziológiai antagonista p53 [7]. Mi korábban beszámolt arról, hogy egy MDM2 gátló, nutlin-3, kimutatták, hatásos tumorellenes hatások ellen gyomorrák-sejtek aktiválása révén a p53 [9].

Sirtuin 1 (SIRT1), AN NAD ^{+ - függő hiszton deacetiláz (HDAC), ahol sokféle funkciót részt kromatin hangtompító, a hosszú élettartam, és a genom stabilitásának. Megállapítást nyer, a sejtmagban és a viselkedik, mint egy érzékelő sejt metabolikus állapotát túlélés és az öregedés alatt genotoxikus és az oxidatív stressz [10], [11]. Emellett hiszton deacetiláció, ezeket a funkciókat részben függ a dezacetilezési különböző nem-hiszton fehérjék, amelyek közé tartoznak transzkripciós faktorok: p53, forkhead doboz (FOXO) család fehérjéi, a nukleáris faktor kB, c-Myc, N-Myc, E2F1, és hypoxia által indukálható transzkripciós faktorok (HIF) 1α /2α; kromatin kapcsolatos enzimek: hiszton acetiltranszferáz, P300, DNS-függő kináz alegység Ku80, és TIP60; DNS-javító elemek: Ku70, RAD51 és NBS1; és a sejt-jelző tényezők: STAT3, β-catenin, és Smad7 [11] - [13]. SIRT1 fiziológiailag kölcsönhatásba lép a p53 és csökkenti annak funkcióit keresztül dezacetilezési annak C-terminális Lys382 maradékot [12]. Overexpressziója SIRT1 találtak számos rák, mint például a gyomor és a vastagbél [10], [14], és jelenteni, hogy működjön a tumor promoter. SIRT2 egyike a citoplazmatikus NAD + - függő hiszton dezacetilázok és dezacetiiezett hiszton H3 lizin 56 (H3K56) és α-tubulin. Azt is osztja nem-hiszton szubsztrátjai FOXO1, FOXO3, és a p53 a SIRT1 [11]. Azonban a pontos szerepe SIRT2 megfoghatatlan marad a rák biológia. Katalógusa}

Mindezek alapján megvizsgáltuk, hogy tenovin-6, egy kis molekulájú vegyület, amely gátolja a SIRT1 és SIRT2 funkciók [15], [16], kifejtett tumorellenes hatások aktiválása révén a p53 a gyomor rákos sejtekben. Újabban arról számoltak be, hogy a SIRT inhibitorok felülszabályozott a halál-receptor 5 (DR5), tagja a tumor nekrózis faktor receptor család, bizonyos rákok [17], [18]. Mi Emellett vizsgáltuk a bevonását ezen receptor a tumorellenes aktivitását tenovin-6 gyomorrák. Vizsgáltuk továbbá a szinergikus tenovin-6 hagyományos citotoxikus gyógyszerek a jövőben klinikai fejlesztési gyomorrákban. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

sejtvonalak

Seven gyomorrák sejt sejtvonalakat használtuk: négy sejtvonalak tömeg TP53 katalógusa (MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), két sejtvonal mutáns típusú (MT) TP53
(NUGC-3, STKM-1) és egy sejtvonal null TP53 katalógusa (KatoIII) [19] - [21]. Sejtvonalak wt A TP53 katalógusa (MCF-7 emlőrák, HEK293 humán embrionális vese sejtek) és az MRC-5 normál humán fibroblasztok kontrollként ebben a vizsgálatban. MKN-45, NUGC-4, KatoIII, és MRC-5 sejtvonalak kaptuk RIKEN BRC Cell Bank (Tsukuba, Japán). SNU-1 és MCF-7 sejtvonalakat az American Type Culture Collection (Rockville, MD). NUGC-3 és HEK293 sejtvonalak nyerték Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japán). STKM-1 és STKM-2 sejtvonalak szívességéből Dr. Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japán). Katalógusa

Vegyszerek katalógusa

Tenovin-6-ot vásárolt Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). A docetaxel, az SN-38, ciszplatin, 5-fluor-uracil (5-FU), a doxorubicin és thapsigargin kaptuk Wako (Osaka, Japán). Ezek feloldottuk dimetil-szulfoxidban (DMSO) koncentrációban 20 mM, és aliquotokat -20 ° C-on. A törzsoldatokat hígítottuk a kívánt végső koncentrációk a növekedési közeg a használat előtt.

Antitestek és Western-blot-analízis

SDS-polyaclylamidegel elektroforézis és Western-blot végeztük a korábban leírtak [22]. A primer és szekunder antitesteket használt az alábbiak voltak. Nyúl poliklonális elleni antitestek SIRT1 (D739), acetilezett (Ac) -p53 (Lys382), foszforilált (Phospho) -p53 (Ser15), a Bcl-2, Ac-α-tubulin (Lys 40), halál receptor 5 (DR5), Fas -asszociált halál domént (FADD), hasított a poli (ADP) -ribose polimeráz (PARP) (Asp214), és az egér monoklonális antitestek ellen P21 ^{Waf /Cip1 katalógusa (DCS60), hiszton H3 (96C10) , β-aktin (8H10D10), α -tubulin (DM1A) és a C /EBP homológ fehérje (CHOP) (L63F7), és nyúl elleni monoklonális antitestek TRAIL (C92B9), kaszpáz-3 (8G10), inozit-igénylő enzimet (IRE ) 1α (14C10), és foszfo-RNS-függő protein-kináz-szerű endoplazmás retikulum kináz (PERK) (16F8) kaptuk a Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Egér monoklonális antitest a p53 (BP53-12) vásároltunk a Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monoklonális ellenanyagot a Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO), és az anti-aktiváló transzkripciós faktor 6 (ATF6) monoklonális antitest (70B1413.1) volt Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Nyúl poliklonális antitest Ac-hiszton H3 (Lys 18) volt a Merck Millipore (Billerica, MA). Mindkét torma-peroxidáz (HRP) konjugált anti-egér IgG-vel juhok és anti-nyúl IgG-szamár szérumok voltak a GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Antitestkötődés alkalmazásával detektáltuk ECL Prime Western Blotting Detection System (GE Healthcare), összhangban a gyártó utasításai szerint. A jel intenzitását mennyiségileg Ez-leválasztás II kemilumineszcenciás képalkotó rendszer (Atto, Tokió, Japán). Katalógusa}

Valós idejű kvantitatív PCR analízise SIRT1 katalógusa és SIRT2 katalógusa génexpresszió

RNS mintákat kivont sejt lizátum alkalmazásával High Pure RNA Isolation kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország), összhangban a gyártó utasításai szerint. Miután a genomiális DNS-t eltávolítjuk, DN-áz, cDNS-t állítunk elő a nagy kapacitású RNS-To-cDNS-készlet (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Valós idejű kvantitatív PCR-t az Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primereket és TaqMan próbát az SIRT1 katalógusa és SIRT2 katalógusa nyerték Applied Biosystems (Vizsgálat ID: Hs01009005 és Hs00247263-kal), és azokat a 18S riboszóma RNS (18S rRNS)
tervezett és szintetizált a Sigma-Aldrich a következők voltak: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (forward primer), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (reverz primer), 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (szonda). Reakciókat hajtottunk végre három párhuzamossal standard termociklusos körülmények alkalmazásával 30 ng cDNS-t, a 900 nm-primerek 250 nm szondák, és TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), összhangban a gyártó utasításai szerint.

RNS-ek extraháljuk származó sejteket elemezzük a relatív mennyisége a megcélzott gén ( SIRT1, SIRT2
) és a referencia gén ( 18S rRNS
) kvantitatív, valós idejű PCR-rel.

WST-8 sejt életképességi vizsgálatok

WST-8 kolorimetriás vizsgálatot végeztünk egy sejtszámláló Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japán), összhangban a gyártó utasításai szerint. Sejteket oltottunk 96 lyukú lapokra, a sejtsűrűség 5 × 10 ^{3 sejt per lyuk 100 ul táptalajt 24 órán kezeljük, tenovin-6-on 72 órán át, jelenlétében inkubáljuk WST-8, és ezután analizáltuk egy iMark mikrolemez leolvasóban (Bio-Rad, Hercules, CA).}

az apoptózis elemzése áramlási citometriával

sejteket szélesztettünk 60 mm-es edények sűrűségben 5 × 10 ^{5 csészénként. Inkubálás után tenovin-6 (10 uM) vagy ekvivalens mennyiségű DMSO 72 órán sejteket óvatosan felemelte Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA), szobahőmérsékleten 10 percig. A sejteket ezután egyszer mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal. Az apoptotikus sejteket mutattunk kettős festéssel propidium-jodidot (PI) és fluoreszcein-izotiocianát (FITC) jelzett annexin V segítségével egy Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, Brea, CA), összhangban a gyártó utasításai szerint. Áramlási citometriás vizsgálatot végeztünk azután egy FACS Calibur áramlási citométeren (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) és CELLQuest szoftvert (BD Biosciences).}

siRNS célzás DR5 Matton

siRNS célba DR5 volt a célja a siDirect szoftver (http://sidirect2.rnai.jp/), amint arról korábban [22]. siRNS transzfekciót végeztünk Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), összhangban a gyártó utasításai szerint. Kontroll siRNS volt egy mesterséges szekvenciát kialakítva, hogy a legkevésbé homológiát mutat a humán és egér géneket. A szensz és antiszensz szálakat siRNS ebben a vizsgálatban alkalmazott a következők voltak: DR5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(sense), 5'-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3' (antiszensz); kontroll siRNS 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(sense), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (antiszensz).

hatásainak elemzésére siRNS sejtnövekedésre és életképességét, sejteket alacsony sűrűség (1 × 10 ^{3 sejt per mérőhely) 96 mérőhelyes lemezeken, amelyek 100 ul RPMI1640 tápközegben, amely 10% magzati borjúszérumot (Sigma-Aldrich). Az életképesség a transzfektált sejtek értékelték 72 és 120 órával a transzfekció után a WST-8 vizsgálatban.}

kombinációs index

Annak meghatározására, hogy tenovin-6 fokozza a tumorellenes hatását a hagyományos kemoterápiás szerek, mi használt kombinációs index (Cl) és egy izobologram kiszámítani CalcuSyn szoftver (Cambridge, Egyesült Királyság), összhangban a Chou és Talalay közepes hatás elvét [23]. Ebben az elemzésben, CI > 1.3 jelzi ellentét; CI = 1,1-1,3 közepes ellentét; CI = 0,9-1,1 additív hatás; CI = 0,8-0,9 enyhe szinergizmus; CI = 0,6-0,8 közepes szinergizmus; CI = 0,4-0,6 szinergizmus; és CI = 0,2-0,4 erős szinergizmus. katalógusa

A statisztikai elemzés katalógusa

Minden kísérletet három példányban, és ismételtük legalább háromszor. Minden adatot átlag ± standard deviáció (SD). Az eltérések szignifikanciáját úgy határoztuk meg, Student-féle t-próbát és Dunnett-féle teszt. p katalógusa -értékei < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

Expression SIRT1, SIRT2 és acetilezett (Ac) -p53 gyomorrákban sejtvonalak

Először megvizsgáltuk az expressziós szintek SIRT1, SIRT2, és az Ac-p53 hét gyomor rákos sejtvonalak. Használtuk HEK293 sejtek a pozitív kontroll SIRT1 /2, és az MCF-7 sejtek doxorubicinnel kezelt a pozitív kontroll Ac-p53 [24]. Minden gyomor rákos sejtvonalak kivéve NUGC-4 és STKM-1 sejtek magas szinten expresszált SIRT1 fehérje, és SIRT2 expressziós szintje alacsony volt az összes sejtvonal kivételével MKN-45 sejteket (1a ábra). Ac-p53-expresszió szintje nagyon alacsony volt mind a gyomorrák sejtvonalak tömeg TP53 katalógusa.

elemeztük a gén kifejeződését SIRT1 katalógusa és SIRT2
valós idejű kvantitatív PCR. MKN-45 sejtekben mutatott SIRT1
génexpresszió hogy körülbelül 2,5-szer nagyobb, mint az a fibroblasztok, de más gyomor rákos sejtvonalakban nem (1B ábra). A NUGC-4 sejteket, a génexpresszió szintjét a SIRT1
alacsony volt, mint volt SIRT1 fehérje. MKN-45 sejtek esetében kissé magas SIRT2 katalógusa génexpresszió, míg más sejtvonalak megmutatta meglehetősen alacsony szinteket. Katalógusa

Tenovin-6 gátolta a gyomorrák sejtek katalógusa

megerősíteni tenovin-6 aktivitását megvizsgáltuk, hogy a tenovin-6 érintette acetilezési hiszton H3 és α-tubulin. Tenovin-6 növelte a acetilezési hiszton három (MKN-45, NUGC-4 és KatoIII) a négy gyomorrák vizsgált sejtvonalban, jelezve a gátlása SIRT1 dezacetilezés aktivitás (2A ábra). Ac-α-tubulin nőtt csak az egyik sejtvonal (MKN-45) kezelt tenovin-6, így gátolja a SIRT2 deacetilálás aktivitás nem feltétlenül jelenik meg a gyomorrák sejtek. Katalógusa

Ezután megvizsgáltuk a lehetséges anti-tumor hatását tenovin-6 ellen gyomor rákos sejteket. Mindegyik gyomorrák sejtvonalat tenyésztünk jelenlétében tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20, és 50 uM) három napig. Dózisfüggő növekedés gátlást figyeltek meg minden sejtvonal, nem csak azok tömeg TP53 katalógusa hanem mt null változat (2B). Az IC _{50 értékek között mozgott 2,34-4,28 um. Ezen túlmenően, WST-8 assay-t a humán fibroblaszt sejtvonal MRC-5 (IC 50: 6,09 nM), hogy összehasonlítsuk a toxicitása tenovin-6 gyomorrák sejtvonalakon. A életképességét NUGC-4 sejteket kezeltünk tenovin-6 szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az MRC-5 sejteket, amint azt a 2C ábra.}

Tenovin-6 által indukált apoptotikus sejtpusztulás gyomor rákos sejtek

Amint azt a 3A ábra és S1, tenovin-6 kezelés növelte a kifejezés a p53 és p21, tömeg TP53
sejtek (MKN45 és NUGC-4). Up-regulációját Ac-p53 volt látható MKN-45 sejtekben, de nem a NUGC-4 sejtekben. Fokozott p21 expressziója is megfigyelhető volt MT TP53
sejteket (NUGC-3). Ezzel ellentétben, a Bcl-2-expresszió nem változott szinte minden négy gyomor rákos sejtvonalak. Növeli a DR5 és a hasított PARP expressziót figyeltek meg minden vizsgált sejtvonalban. Az expressziós szintje TRAIL, amely funkcionálhat ligandum tengelykapcsoló halál jelző, kissé emelkedett volt minden sejtvonal, bár a kifejezés a FADD, egy fontos adapter, nem befolyásolta tenovin-6.

megvizsgálták, hogy tenovin-6 csökkentette a életképességét gyomorrák-sejtek indukálása útján apoptotikus sejthalál. A rákos sejtek voltak kitéve azt koncentrációban 10 jiM vagy ekvivalens mennyiségű ellenőrzés jármű (DMSO) 72 órán át, majd FITC-Annexin V és PI. Ezeket áramlási citometriával analizáltuk: a sejteket negatív mindkét annexin V és a PI tekintették, hogy nem-apoptotikus sejteket pozitív Annexin V csak tartották korai apoptotikus és cellák pozitív mind annexin V és a PI tekintették késni apoptotikus vagy nekrotikus. Expozíció MKN-45 sejtek tenovin-6 növelte a frakciók a korai és késői fázisokban az apoptózis 2,8% 52,1% és 1,8% -ról 18,5% -ra (3B ábra). Hasonló növekedés a populációk korai és késői fázisaiban apoptózisa volt megfigyelhető más sejtvonalak (NUGC-4, NUGC-3, és KatoIII). Tenovin-6 által kiváltott apoptózist minden vizsgált sejtvonalban, függetlenül attól, hogy TP53 katalógusa állapotát.

Hatása DR5 katalógusa kiütése a tenovin-6-indukálta apoptózis katalógusa

Ezután ellenőrizni, hogy DR5 katalógusa hangtompító hatással tenovin-6-indukálta apoptózis, a sejtek életképességét és az apoptózis mértéke elemeztük WST-8 assay átfolyásos illetve, illetve a TP53 katalógusa -null KatoIII sejteket. Gátlása DR5 expressziójának specifikus siRNS (4a ábra) szignifikánsan csökkentette tenovin-6-indukált sejthalált és apoptózist KatoIII sejtekben (ábra 4B és 4C). Mi három különböző siRNS mi előzetes kísérletben, és mi van a hasonló eredményt ér el siRNS. Katalógusa

Megvizsgáltuk aktiválása az endoplazmás retikulum (ER) stressz útvonal, amely kapcsolódik a DR5 up-szabályozás, mint korábban számolt [17]. CHOP az egyik leghatásosabb induktor DR5 és upstream az apoptózis, és gyakran során felszabaduló az ER stressz. Ábrán látható az 5A és 5B, bár CHOP volt marginálisan up-által szabályozott tenovin-6 kezelés mind a négy gyomor rákos sejtvonalak, a megnövekedett szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll sejtekben kezelt thapsigargin, ami egy szelektív inhibitora szarkoplazmatikus /endoplazmás retikulum Ca ^{2+ - ATP és széles körben használják a celluláris ER stressz [25], [26]. Másrészt kezek, IRE1, ami egy ER stressz érzékelő található és upstream CHOP, kissé felfelé szabályozza tenovin-6 kezelés valamennyi sejtvonalban, de nem foszforilezett PERK és ATF6. [27], [28]. Úgy tűnt valószínűnek, hogy tenovin-6 okozta ER stressz vezető DR5 indukció a gyomor rákos sejtek. Katalógusa}

tumorellenes hatását tenovin-6 kemoterápiás szerekkel kombinációban

Végül megvizsgáltuk tenovin- 6 fokozott tumorellenes hatását a kemoterápiás szerek, többek között a docetaxel, az SN-38, ciszplatin, és az 5-FU, a gyomor rákos sejtvonalak. Négy sejtvonalak tömeg TP53 katalógusa (MKN-45, NUGC-4), mt TP53 katalógusa (NUGC-3), és null TP53 katalógusa (KatoIII) kezeltük ezekkel a szerekkel egyedül vagy kombinációban két adagot (2 és 5 uM) a tenovin-6. A koncentrációkat 0,25 Nm docetaxel, 1 nM az SN-38, 0,5 vagy 1 uM ciszplatin, és 0,25 | iM 5-FU. Amint az 1. táblázatban látható (és ábra S2), docetaxel és az SN-38 mutatott enyhe-mérsékelt szinergikus hatás tenovin-6 kezelés három sejtvonalak, valamint a ciszplatin tenovin-6 mérsékelten szinergetikus hatást két sejtvonalat, míg a 5-FU kombinálva tenovin-6 mutatott alacsonyabb a hatása, mint a többi anyagok. Megvizsgáltuk a megnyilvánulásai DR5 beadása után tenovin-6 kemoterápiás szerekkel. DR5 up-szabályozás tenovin-6 fokoztuk kombinációjával docetaxel MKN-45 sejtek (ábra S3). Katalógusa

Vita katalógusa

Megmutattuk, hogy tenovin-6 kimutatta tumorellenes aktivitás kíséri apoptotikus sejthalált humán gyomorrák sejtek tömeg TP53 katalógusa, valamint azokat, MT TP53 katalógusa. Számos specifikus inhibitorai sirtuins, mint például a sirtinol, suramin, salermide, és thiobarbiturates, számoltak be, hogy gátolják a sejt növekedését különböző típusú rákos [29]. A legtöbb kutató leírta a tumorellenes hatásai Sirtuin inhibitorok sejtvonalak tömeg TP53 katalógusa [15], [29] - [31], és tulajdonított ezeket az aktiválás az apoptózis révén a p53 acetilációja. Közben több jelentést is megjelent az elmúlt években, hogy megmutatta a tumorellenes tevékenységét Sirtuin inhibitorok sejtvonalak mt TP53
keresztül p53-független utak [17], [18]. Kimutattuk, hogy a DR5 knockdown csökkentette a tumorellenes hatásai tenovin-6 TP53
-null gyomor rákos sejteket. Aktiválása halál receptor jelátviteli út keresztül up-regulációját DR5 játszik döntő szerepet tenovin-6-indukált sejthalál, mint említettük, más jelentések Sirtuin inhibitorok.

Leírták, hogy salermide fokozott DR5 expresszió és indukált apoptózist emberi nem-kissejtes tüdőrák hordozó sejtek MT TP53 katalógusa [17]. Ebben a jelentésben egyidejű elhallgattatása SIRT1 katalógusa és SIRT2 katalógusa valamint salermide fel szabályozott DR5 kíséretében az up-reguláció Az ER stressz kapcsolódó fehérjék, mint például ATF4 és KMOP. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ER stressz részt ebben DR5 indukció. Azt gondolták, hogy tenovin-6 is vezetett a növekedés DR5 expressziójának aktiválása révén ER stressz által közvetített PERK, IRE1, ATF6, és vágjuk. Azonban a várakozásokkal ellentétben, a jel útját ER stressz által aktivált tenovin-6-ot nem nyilvánvalóan kimutatható. Mindazonáltal nem volt egyértelmű bizonyíték arra, hogy a DR5 váltottuk ki tenovin-6. Vannak más utak CHOP által közvetített DR5 up-reguláció: reaktív oxigén (ROS), a c-Jun NH _{2-terminális kináz (JNK) útvonal, a p38 mitogén-aktivált protein kináz útvonal, és így tovább [ ,,,0],32] - [38]. Mi azonban nem vizsgálta ezen utak itt, mert nem tudtuk azonosítani CHOP aktiválás a vizsgálatba. Eredményeink azt sugallják, hogy más p53- és a CHOP-független útvonalakat vesz részt tenovin-6-indukált DR5 expresszió gyomor rákos sejtekben.}

Kimutattuk, hogy tenovin-6 által indukált apoptotikus sejthalál aktiválása révén a DR5 útvonalon. Azonban, a p53 és KMOP utak tűnt valószínűnek, hogy részt vegyen ebben a DR5 indukció, és a mechanizmus a DR5 up-reguláció továbbra is tisztázatlan. Mi, a közelmúltban, vizsgálták tumorellenes hatásai tenovin-6 több vastagbélrákos sejtvonalak, és megállapította, hogy hatásos tumorellenes aktivitást legtöbbjük up-regulációját DR5 is [39]. Azonban CaCo2 vastagbélrák sejtek (mt TP53 katalógusa), apoptotikus sejthalált tenovin-6 kevésbé volt nyilvánvaló a DR5 expressziója nem volt erősen fel szabályozni. CaCo2 sejt leírták, hogy kifejezze a magas szintű hősokkfehérjék ismert, mint a szuppresszor DR5 [40] - [43]. Ez az összefüggés még tanulmányozni kell a jövőben tovább. SIRT1 deacetilál- hiszton H4 lizin 16 (H4K16), valamint a H3K9, H3K14 és H1K26, amelyek szorosan kapcsolódnak géncsendesítést [11]. Ezen kívül számos megfelelő nem-hiszton szubsztrátok: transzkripciós faktorok, a DNS-javító gépek elemek, a nukleáris receptorok, hiszton-módosító enzimeket, és a sejt jelátviteli molekulák, amit a leírásban máshol [11] - [13]. Ezek a számos és bonyolult társulásai SIRT1 aktivitás vesz részt különféle biológiai funkciók, mint például a génexpresszió szabályozását és DNS sérülés javítására. A rákos sejtek hajlamosak szükség ezeket a funkciókat SIRT1 érdekében szaporodni, és a javítás katasztrofális genomi károkat. A legújabb tanulmányok azonosították a képességét tenovin-6 differenciálódását indukáló és gátolják autofágiának részeként daganatellenes hatást leukémiás sejtekben [44], [45]. Ez függhet a rákos sejtek viselkedésének milyen tenovin-6 befolyásolja a daganatos tevékenység. További vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, a kapcsolat a tenovin-6 által közvetített halál útvonal és az összetett szerepét SIRT1. Katalógusa

hatását vizsgáltuk ötvözi docetaxel, az SN-38, cisplatin és 5-FU tenovin -6 mert már széles körben használják a betegek kezelésére előrehaladott gyomorrák [46], [47]. Enyhe vagy közepesen súlyos szinergikus hatását a docetaxel és az SN-38 tenovin-6 A gyomorrák-sejtvonalak, függetlenül attól, hogy TP53 katalógusa állapotát, talált. Katalógusa

Bár kezelések kombinációban a docetaxel Sirtuin inhibitorok, de nem jelentettek, kombinációk a docetaxel és az egyéb HDAC inhibitorokkal, például Trichostatin a és szuberoilanilid hidroxámsav (SAHA) leírták, hogy szinergetikus hatást kapcsolódó kaszpáz-aktiválás vagy tubulin acetiláció több rákos sejtvonalakban [48] - [50] . Vizsgálatunkban nem világos, hogy a tubulin acetilezéssel által tenovin-6 mindig érinti a tumorellenes hatással, mert az tubulin acilezését mutatja csak egy sejtvonal. SN-38 (aktív formája irinotekán) egy DNS-topoizomeráz I inhibitor, amely működik kizárólag az S fázis, és zavarja a DNS-replikáció és a sejtosztódás [51], [52]. HDAC inhibitorok indukálják acetilezése a hiszton és lazítsa meg a kromatin szerkezet, amelynek topoizomerázinhibitor sokkal könnyebben hozzáférhet a DNS, amely megkönnyíti a DNS-károsodás [51], [53]. Ezen túlmenően, egy figyelemre méltó növekedést ROS-termelés leírták kissejtes tüdőrák-sejtek upon egyidejű kitettség SAHA és topotekán (a kamptotecin származék) [51]. A megnövekedett hatás a kezelés kombinálása tenovin-6 és az SN-38 következőknek tulajdonítható együttműködési szabályozás a DNS-károsodás válasz. Katalógusa

Az előnye kombinált terápia tenovin-6 és ciszplatin vagy 5-FU kevesebb volt, mint a a többi ágensek gyomorrák-sejtek, bár számos beszámoló demonstrálta a javítása apoptózis kombinált kezelés ciszplatinnal vagy 5-FU és egyéb HDAC inhibitorokkal, más tumorokban [54] - [57].

Ami a toxicitás értékelése tenovin-6, használtuk egy fibroblaszt sejtvonal, mint az alternatív, nem tumorképző sejtekkel megjósolni a toxicitás elleni normális sejtek utalva a korábbi jelentések [15], [18]. Nehéz volt megtalálni a megfelelő normál kontroll összehasonlító tanulmányok, és ezért véglegesen szükség, hogy tanulmányozza a mérgező tenovin-6 (kombinálva rákellenes gyógyszerek) in vivo katalógusa, az állati xenograftmodellekben.

Végeredményben a Sirtuin inhibitor, tenovin-6, mutatott erőteljes tumorellenes hatást az emberi gyomor rákos sejteket. Ez független volt a TP53 katalógusa állapot és váltottuk át fel-szabályozása DR5. További vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, az a mechanizmus, amely tenovin-6 szabályozza DR5 kifejezést. Tenovin-6 kombinált docetaxel és az SN-38 volt egy kis előnyt gátlása gyomorrák sejt proliferáció, amely megadná új stratégiát kezelésére előrehaladott gyomorrák.

Támogató információ
ábra S1.
relatív intenzitás a fehérjék "kifejezés ábrán látható a 3A. Félig kvantitatív Western-blot denzitometriának részt normalizálás béta-aktin-szintre. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
citotoxikus hatását kemoterápiás szerek kombinációban tenovin-6. Citotoxikus hatásait kemoterápiás gyógyszerek, beleértve a docetaxel, az SN-38, ciszplatin, és az 5-FU, és azok fokozása a hatásait tenovin-6 gyomorrák sejtek gyomor rákos sejteket. A sejteket tenyésztettünk 72 órán át a jelzett koncentrációjú tenovin-6 és a kemoterápiás gyógyszereket. A: a docetaxel (0,25 nM), B: az SN-38 (1 nM), C: ciszplatin (1 vagy 0,5 nM; NUGC-3 készült oldatához 0,5 jiM cisplatin), és D: 5-FU (0,25 uM) kaptak kombinálva tenovin-6. A statisztikai szignifikanciáját csoportok közötti különbségek értékeltük Dunnett teszt. * p katalógusa < 0,01; ** p katalógusa < 0,05. DOC: docetaxel, CDDP: ciszplatin. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s002 katalógusa (TIF) hotelben ábra S3.
DR5 kifejezések beadása után tenovin-6 docetaxel vagy SN-38 gyomorrák sejtek (MKN-45 és KatoIII). A docetaxel, az SN-38 és tenovin-6-ot adminisztrátora koncentrációban 0,25 nM, 1 nM és 2 uM. Félig kvantitatív Western-blot denzitometriának részt normalizálás béta-aktin-szintre. DOC: docetaxel. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s003 katalógusa (TIF) hotelben

• PLoS One: Csiga-Szabályozott miR-375 Gátolja migrációs és behatolás gyomorrák sejtek által célzás JAK2
• PLoS One: Módosított Delta-Shaped Gastroduodenostomy a Totally laparoszkópos distalis resectio gyomorrák: A biztonságos és megvalósítható technika