Plos ONE: protitumorsko Učinki Sirtuin Zaviralec, Tenovin-6, proti želodca raka celic preko Death receptorjev 5 Up-Uredbe

Povzetek

Up-urejeno Sirtuin 1 (SIRT1), ki je NAD ^{+ - odvisno od razreda III histon-dezacetiliran p53 in zavira njeno transkripcijske aktivnosti, ki vodijo do mobilnih preživetje. SIRT1 overexpression so poročali napovedati slabo preživetje v nekaterih malignih bolezni, vključno z rakom želodca. Vendar protitumorsko učinek inhibicije SIRT1 še ni dosežena, raka želodca. Tukaj smo raziskovali mehanizme protitumorne z zaviralcem Sirtuin, tenovin-6, v sedmih človeških želodčnih raka celičnih linijah (štiri vrstice celic z divjim tipom TP53
, dve z mutiranim tipa TP53
in eno z ničelno TP53
). Zanimivo je, da tenovin-6 inducirano apoptozo v vseh celičnih linijah, ne samo za tiste z divjim tipom TP53,
ampak tudi mutant tipa in null različice, ki jih spremlja up-regulacije smrti receptorja 5 (DR5). V KatoIII celične linije ( TP53
-null), DR5 utišanje močno oslabljen tenovin-6-inducirano apoptozo, kar kaže, da je ključni mehanizem za svojimi protitumornih učinkov temelji na aktiviranju signala poti v smrt receptorja. Čeprav je Endoplazemski Retikulum stres, ki ga Sirtuin inhibitorji povzroča poročali, da povzroči DR5 up-regulacije v drugih raka celičnih linijah, nismo mogli najti izrazito aktivacijo njegovih povezanih molekul, kot so ATF6, Perk in CHOP, v celicah želodca z rakom, zdravljenih s tenovin- 6. Tenovin-6 v kombinaciji z docetakselom ali SN-38, ki deluje rahlo do zmerno sinergistično citotoksičnost proti želodca rakavih celic. Skratka, tenovin-6 ima močan protitumorsko aktivnost proti človeške želodčne rakavih celic preko DR5 regulacijo navzgor. Naši rezultati bi morali biti koristna za nadaljnji kliničnega razvoja Sirtuin zaviralcev}

Navedba. Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) protitumorsko Učinki Sirtuin inhibitor, Tenovin-6, proti želodca raka celic preko Death receptorjev 5 Up-pravilniku. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10,1371 /journal.pone.0102831

urednika: Andrej L. Gartel, University of Illinois v Chicagu, Združene države Amerike

Prejeto: 28. oktober 2013; Sprejeto: 23. junij 2014; Objavljeno: 17. julij 2014

Copyright: © 2014 Hirai et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi v obliki pomoči od Ministrstva za izobraževanje, kulturo, šport, znanost in tehnologijo Japonske (do IH). Nobena dodatna zunanja sredstva prejela za to študijo. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden od glavnih vzrokov smrti zaradi raka po svetu [1], [2]. Čeprav so bili pripravljeni različni kemoterapijami za napredovalega raka želodca, je prognoza še vedno so potrebni revni in nova zdravila proti raku za raka želodca. Rak želodca je biološko in genetsko heterogena raka, ki vključuje številne genske mutacije in epigenetski Premene [3]. Med njimi nenormalnosti TP53
zaviralnih genov igrajo pomembno vlogo pri tumorigeneze [4], [5]. Približno 30% bolnikov z rakom želodca imajo TP53
mutacija [6]. Tudi v rakavih celic z divjim tipom (WT) TP53
, pa so poročali, da je funkcija TP53
zavirajo negativne predpise, vključno s ubikvitinacije metilacije in deacetiliranja [7], [8]. V tem kontekstu bi bilo obetavno strategijo za domnevo, da inhibicije teh negativnih regulatorji rezultati pri krepitvi protitumornih učinkov z aktivacijo p53 v mas TP53
raka. Murine dvojna minut 2 (Mdm2) je glavna fiziološka antagonist p53 [7]. Smo že poročali, da je zaviralec Mdm2, nutlin-3, je pokazala močan protitumorne učinke proti želodčnih rakavih celic z aktivacijo p53 poti [9]

Sirtuin 1 (SIRT1) je NAD ^{+ -. Odvisno histon deacetilaze (HDAC), ima številne funkcije, ki sodelujejo pri kromatina utišanje, dolgoživosti in genomske stabilnosti. To se nahaja v jedru in deluje kot senzor statusa celične presnove preživetja in staranje pod genotoksično in oksidativnega stresa [10], [11]. Poleg histon deacetiliranja, te funkcije delno odvisna od deacetilacije različnih non-histonskih proteinov, ki vključujejo transkripcijske faktorje: p53, forkhead polje (FOXO) družinske beljakovine, faktor κB jedrska, c-myc, N-myc, E2F1, in inducirajo s hipoksijo transkripcijski faktorji (HIF) 1α /2α; povezanih kromatin encimov: histon acetil, P300, DNK-odvisne kinaze podenote Ku80 in TIP60; popravilo DNA elementi: Ku70, RAD51 in NBS1; in dejavniki celic signalizacijo: stat3, β-catenin in Smad7 [11] - [13]. SIRT1 fiziološko komunicira z p53 in zmanjša svojo funkcijo v okviru deacetiliranja na svoji Lys382 C-terminalnega ostanka [12]. Čezmerno SIRT1 je bilo v mnogih vrst raka, kot sta želodec in debelega črevesa [10], [14], in poroča, da deluje kot promotor tumorjev. SIRT2 je eden od citoplazemskega NAD + - vzdrževane histonskih deacetilaz in dezacetiliran histona H3 lizin 56 (H3K56) in alfa-tubulina. Strinja se tudi non-histon substrate FOXO1, FOXO3 in p53 z SIRT1 [11]. Vendar pa ostaja natančna vloga SIRT2 izmuzljiv v raka biologije.}

Glede na to, smo raziskovali, ali tenovin-6, majhna molekula spojina, ki zavira SIRT1 in SIRT2 funkcije [15], [16], ki deluje antitumorskih učinke preko aktivacije p53 poti v želodcu rakavih celic. V zadnjem času pa so poročali, da SIRT inhibitorjev reguliran smrtno receptor 5 (DR5), član družine dejavnik receptorja tumor nekroze, v nekaterih vrst raka [17], [18]. Dodatno smo preučevali vključevanje tega receptorja v aktivnost proti tumorjem v tenovin-6 za rakom želodca. Poleg tega smo pregledali Sinergizam za tenovin-6 z običajnimi citotoksična zdravila za prihodnji klinični razvoj raka želodca.

Materiali in metode

Celične linije

Seven želodca rakava celica uporabljeni so bili linije: štiri celične linije z tež TP53
(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, snu-1), dve celične linije z mutiranim tipa (mt) TP53
(NUGC-3, STKM-1), in ena celična linija z ničlo TP53
(KatoIII) [19] - [21]. Celične linije z ut TP53
(MCF-7 rak dojke, HEK293 človeške embrionalne ledvične celice) in MRC-5 normalna človeška fibroblasti so bili vključeni kot nadzora v tej študiji. MKN-45, NUGC-4, KatoIII in MRC-5 celične linije smo dobili od Riken BRC celic banki (Tsukuba, Japonska). Snu-1 in MCF-7 celične linije smo nabavili pri American Type Culture Collection (Rockville, MD). NUGC-3 in HEK293 celične linije so bili pridobljeni iz Health Science Research virov banke (Osaka, Japonska). STKM-1 in STKM-2 celične linije so sami pripravili dr Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japonska).

Kemikalije

Tenovin-6 je bila kupljena od Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Docetaksel, SN-38, cisplatin, 5-fluorouracil (5-FU), doksorubicina in thapsigargin smo dobili od Wako (Osaka, Japonska). So bili raztopimo v dimetilsulfoksidu (DMSO) pri koncentraciji 20 mM in alikvote shranili pri -20 ° C. Osnovne raztopine razredčimo do želene končne koncentracije na gojišču pred uporabo.

Protitelesa in Western blot analiza

SDS-polyaclylamidegel elektroforeza in Western blot smo izvedli kot je opisano prej [22]. Primarna in sekundarna protitelesa, ki se uporabljajo, so bili naslednji. Rabbit poliklonska protitelesa proti SIRT1 (D739), acetiliranega (Ac) -p53 (Lys382), fosforilirani (fosfo) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubulin (Lys40), smrt receptor 5 (DR5), Fas -associated smrt domen (FADD), razklani poli (ADP) -ribose polimerazo (PARP) (Asp214) in miška monoklonska protitelesa proti p21 ^{Waf /Cip1
(DCS60), histona H3 (96C10) , P-aktina (8H10D10), α -tubulin (DM1A) in C /EBP homolog beljakovin (sesekljamo) (L63F7) in kunčjega monoklonska protitelesa proti TRAIL (C92B9), kaspaze-3 (8G10),-inozitol zahteva encimov (IRE ) 1α (14C10), in fosfo-RNA-odvisna proteinska kinaza podobnih Endoplazemski retikulum kinaze (PERK) (16F8) so bili pridobljeni iz signalizacijo med celicami tehnologijo (Danvers, MA). Mouse monoklonsko protitelo p53 (BP53-12) je bila kupljena iz celic znanosti (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monoklonsko protitelo, je bil iz Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO) in anti-aktiviranje transkripcijski faktor 6 (ATF6) monoklonsko protitelo (70B1413.1) je bil Enzo ved (Farmingdale, NY). Rabbit poliklonsko protitelo Ac-histona H3 (Lys18) je bila od Merck Millipore (Billerici, MA). Oba s hrenovo peroksidazo (HRP), označenih s anti-mouse IgG ovce in anti-rabbit IgG osel serumi so GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Protitelesa vezavo je bila odkrita z uporabo sistema za ECL predsednik Western blot Detection (GE Healthcare), v skladu s protokolom proizvajalca. Intenziteta signala je količinsko, z uporabo EZ-Capture II kemiluminescenco slikanje sistem (ATTO, Tokio, Japonska).}

Real-time kvantitativno PCR za analizo SIRT1
in SIRT2
izražanje genov

RNA vzorci so bili pridobljeni iz celičnega lizata z uporabo visokega Pure izolacije RNA kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemčija), v skladu z navodili proizvajalca. Potem smo genomsko DNA odstranili z DNaze, smo cDNA pripravimo z uporabo visoke zmogljivosti RNA-do-cDNA kit (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Realnem času kvantitativne PCR smo izvedli z uporabo Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Temeljni premazi in sonda TaqMan za SIRT1
in SIRT2
so bili pridobljeni iz Applied Biosystems (Vsebnost ID: Hs01009005 in Hs00247263, soodvetno), in tiste, za 18S ribosomske RNA (18S rRNA)
načrtovani in sintetizirajo Sigma-Aldrich, so bili naslednji: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (naprej primer), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (reverzna primerska), 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (sonda). Reakcije smo izvedli v treh izvodih pod standardnimi termociklična pogojih ob uporabi 30 ng cDNA, 900 nm primerjev, 250 nm sond, in TaqMan genske ekspresije Master Mix (Applied Biosystems), v skladu s protokolom proizvajalca.

RNA ekstrahirali od bili analizirani celice za relativnih zneskih ciljnega gena ( SIRT1, SIRT2
) in napotilo gen ( 18S rRNA
) s kvantitativno PCR v realnem času.

WST-8 cell funkcionalnosti testi

WST-8 kolorimetrične teste smo izvedli s pomočjo mobilnega Counting Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japonska), v skladu s protokolom proizvajalca. Celice smo zasejali v 96 vdolbinami z gostoto 5 x 10 ^{3 celic na dobro s 100 ul gojišču za 24 ur, zdravljenih z tenovin-6, za 72 ur, inkubiranih v prisotnosti WST-8, in nato analizirajo s iMark mikroploščnem čitalniku (Bio-Rad, Hercules, CA).}

Analiza apoptoze s pretočno citometrijo

Celice smo zasejali v 60-mm jedi po gostoti 5 x 10 ^{5 na krožnik. Po inkubaciji s tenovin-6 (10 uM) ali ekvivalentne količine DMSO 72 urah smo celice rahlo dvigne s Accutase (ZDA Biotehnologija, Parker Ford, PA), pri sobni temperaturi 10 minut. Celice nato enkrat izperemo s fosfatnim pufrom. Apoptotske celice so odkrili z dvojnim barvanjem s propidijevim jodidom (PI) in fluorescein izotiocianatom (FITC) označenega aneksina uporabo-FITC V apoptoze Detection Kit za aneksin (Beckman Coulter, Brea, CA), v skladu s protokolom proizvajalca. Analiza Flow citometrična je bila nato izvedena s tokom FACS Calibur citometrom (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) in Cellquest (BD Biosciences).}

ciljanje siRNA DR5

siRNA ciljanje DR5 je bil zasnovan z uporabo siDirect programske opreme (http://sidirect2.rnai.jp/), kot je bilo prej [22] poročajo. siRNA transfekciji je bila izvedena s pomočjo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), v skladu z navodili proizvajalca. Nadzor siRNA je bila umetna zaporedje izdelani, da imajo najmanj homologijo v človeških in mišjih genov. So smiselne in protismiselne pramene siRNA uporabljeni v tej študiji, so bili naslednji: DR5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(smisel), 5'-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3' (antisense); Nadzor siRNA, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(smisel), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (antisense).

Za analizo učinkov siRNA na celično rast in preživetje celice zasadimo pri nizki gostota (1 x 10 ^{3 celic na vdolbino) v 96-vdolbinami, ki vsebuje 100 ml za RPMI1640 mediju z 10% fetalnega telečjega seruma (Sigma-Aldrich). Sposobnost preživetja transfekciji celic smo ocenili 72 in 120 ur po transfekciji s WST-8 testom.}

Kombinacija indeks

Če želite ugotoviti, ali lahko tenovin-6 povečajo učinke protitumorne konvencionalnih kemoterapevtikov, smo uporablja indeks kombinirano (CI) in isobologram izračunana po CalcuSyn programske opreme (Cambridge, UK), v skladu z načelom mediana učinek Chou in Talalay [23]. V tej analizi, CI > 1.3 kaže antagonizem; CI = 1,1-1,3 zmerna antagonizem; CI = 0,9-1,1 dodatek učinek; CI = 0,8-0,9 rahlo sinergija; CI = 0,6-0,8 zmerna sinergija; CI = 0,4-0,6 sinergija; in CI = 0,2-0,4 močna sinergija.

Statistična analiza

Vse poskuse smo izvajali v treh izvodih in so se ponovi vsaj trikrat. Vsi podatki so izraženi kot povprečje ± standardna deviacija (SD). Pomembnost razlik, je bila določena z t-test in Dunnettov testu. p
-values ​​< 0.05, so bile obravnavane pomembne

Rezultati

Izražanje SIRT1, SIRT2, in acetiliran (Ac) -p53 v želodcu raka celičnih linijah
.

Najprej smo preverjali raven izražanja SIRT1, SIRT2 in Ac-p53 v sedmih želodčnih raka celičnih linijah. Uporabili smo HEK293 celice za pozitivno kontrolo SIRT1 /2, in MCF-7 celic zdravijo z doksorubicinom za pozitivno kontrolo Ac-p53 [24]. Vse želodca linije rakava celica razen NUGC-4 in celic STKM-1 je izrazil visoko stopnjo SIRT1 beljakovin, in ravni SIRT2 izraz so bile nizke v vseh celičnih linij, razen za MKN-45 celice (slika 1A). stopnje izraženosti Ac-p53 so bile v vseh želodčnih linij rakavih celic z tež TP53
.

Zelo nizko smo analizirali izražanje genov za SIRT1
in SIRT2
, ki v realnem času kvantitativno PCR. MKN 45-celice razstavljena SIRT1
izražanje genov, ki je bila približno 2,5-krat večja kot v fibroblastih, ampak druge želodčne rakave celične linije ni (slika 1B). V NUGC-4 celicah, raven izražanja genov v SIRT1
je bila nizka, kot je bilo SIRT1 protein. MKN-45 celic je pokazala nekoliko previsoko SIRT2
izražanje genov, medtem ko druge celične linije pokazala precej nizke ravni izražanja.

Tenovin-6 zaviral rast želodca rakavih celic

Da za potrditev tenovin-6 aktivnost, smo raziskovali, ali tenovin-6 vplivala na acetiliranje histon H3 in alfa-tubulina. Tenovin-6 povečala acetiliranje histon v treh (MKN-45, NUGC-4 in KatoIII) od štirih želodca raka celičnih linij testiranih, kar kaže na inhibicijo SIRT1 deacetilacije aktivnosti (slika 2A). Ac-α-tubulin povečal le v zdravljenih z tenovin-6, s tem zaviranje SIRT2 deacetilacije dejavnosti ni bilo mogoče dokončno prikazana v želodčnih rakave celice ene celične linije (MKN-45).

Nato smo ocenili potencial protitumorsko učinek tenovin-6 proti želodčnih rakavih celic. Vsak želodčni rak celična linija je kultiviramo v prisotnosti tenovin-6 (0.2, 1, 5, 10, 20 in 50 uM) za tri dni. Odmerka odvisno zaviranje rasti je bilo opaziti v vseh celičnih linijah, ne samo tiste, ki imajo mas TP53
ampak tudi mt in null različice (slika 2B). Njihove IC _{50 vrednosti v razponu od 2,34 do 4,28 uM. Poleg tega je WST-8 test izvedemo v fibroblastov humani celični liniji MRC-5 (IC 50: 6,09 um) primerjati toksičnosti tenovin-6 do želodca raka celičnih linij. Viabilnost celic NUGC-4 zdravljenih z tenovin-6 je bistveno nižja od 5 MRC-celic, kot je prikazano na sliki 2C.}

Tenovin-6 inducirano apoptotske celične smrti v želodčnih rakavih celicah

Kot je prikazano na sliki 3A in S1, tenovin-6 zdravljenje poveča izražanje p53 in p21 v mas TP53
celice (MKN45 in NUGC-4). Regulacijo navzgor Ac-p53 je prikazano v MKN-45 celice, ne pa tudi v NUGC-4 celicah. Povečano izražanje p21 so opazili tudi pri mt TP53
celice (NUGC-3). Nasprotno, bcl-2 ekspresija ni spremenila v skoraj vseh štirih želodčni rak celičnih linij. v vseh celičnih linijah testiranih so opazili povečanja DR5 in cepljen PARP izražanja. Stopnje izražanja TRAIL, ki delujejo kot ligand za spenjanje smrtni signalizacijo je bilo v vseh celičnih linijah nekoliko povečala, čeprav je izraz FADD, pomembno adapter, ki ga tenovin-6 ni bila prizadeta.

preučila, ali tenovin-6 zmanjšal izvedljivost želodčnih rakavih celic z indukcijo apoptoze celične smrti. Rakave celice so bile izpostavljene ji v koncentraciji 10 pM ali ekvivalentno količino kontrolnega vozila (DMSO) za 72 ur in nato obarvali s FITC-aneksina V in PI. Analizirani so bili s citometrije pretoka: celice negativna tako aneksina V in PI je štelo, da niso apoptotično, celice pozitivne na aneksina V šteli za zgodnje apoptotske in celice pozitivno tako aneksina V in PI samo so menili, da je prepozno apoptotske ali nekrotični. Izpostavljenost MKN-45 celic tenovin-6 povečala frakcije zgodnjih in poznih fazah apoptoze z 2,8% na 52,1% in iz 1,8% na 18,5%, v tem zaporedju (slika 3B). v drugih celičnih linijah (NUGC-4, NUGC-3, in KatoIII) so opazili podobne povečanje prebivalstva v zgodnjih in poznih fazah apoptoze. Tenovin-6 inducirano apoptozo v vseh celičnih linijah testirane, ne glede na to TP53
stanje.

Vpliv DR5
rasklapanje na tenovin-6-inducirane apoptoze

Nato se preveri, ali DR5
utišanje prizadeti tenovin-6-inducirano apoptozo, sposobnosti preživetja celic in apoptotske stopnje so bili analizirani s WST-8 testom in pretočno citometrijo, in sicer v TP53
-null KatoIII celice. Zaviranje DR5 izražanja s strani posebne siRNA (slika 4A) bistveno zmanjša tenovin-6-inducirano celično smrt in apoptozo v KatoIII celic (slika 4B in 4C). Uporabili smo tri različne siRNAs v našem predhodnem poskusu, in smo dobili podobne rezultate z vsemi siRNAs.

smo raziskovali aktivacijo endoplazemski retikulum (ER) stresa poti, ki se navezuje na DR5 up-ureditev, kot je že poročali [17]. CHOP je eden od najmočnejših induktor DR5 in navzgor apoptoze in pogosto sprosti med ER stresom. Kot je prikazano na sliki 5A in 5B, čeprav je CHOP malo jih tenovin-6 zdravljenje navzgor regulirano v vseh štirih želodčnih raka celičnih linijah, so povišane ravni bistveno nižje kot v kontrolnih celicah, obdelanih s thapsigargin, ki je selektivni inhibitor sarkoplazemskega /Endoplazemski retikulum Ca ^{2+ - ATP in se pogosto uporablja kot celični ER stresorju [25], [26]. Na drugi rok, IRE1, ki je tipalo stres ER in se nahaja na gorvodno od CHOP, nekoliko jih tenovin-6 zdravljenje up-urejena v vseh celičnih linijah, vendar ne fosforilirano Perk in ATF6. [27] [28]. Zdelo se je, verjetno, da tenovin-6 povzročil ER stres vodi do indukcije DR5 v naših želodčnih rakavih celic.}

Antitumorsko učinek tenovin-6 v kombinaciji s kemoterapevtiki

Na koncu smo pregledali, ali tenovin- 6 izboljšano protitumorsko učinkov kemoterapevtskih sredstev, vključno docetaksela, SN-38, cisplatinom in 5-FU, v želodcu raka celičnih linijah. Štiri celične linije z tež TP53
(MKN-45, NUGC-4), so bili zdravljeni mt TP53
(NUGC-3), in null TP53
(KatoIII) s samostojno ali v kombinaciji z dvema odmerkoma (2 in 5 um) z tenovin-6 teh zdravil. Koncentracije so bile 0,25 nM docetaksel, 1 nM SN-38, 0,5 ali 1 uM cisplatinom in 0,25 iM 5-FU. Kot je prikazano v tabeli 1 (in slika S2), docetaksel in SN-38 so pokazali rahlo do zmerno sinergijski učinek na tenovin-6 zdravljenje v treh celičnih linijah in cisplatina s tenovin-6 pokazala zmerno sinergistični učinek v dveh celičnih linij, medtem 5-FU v kombinaciji z tenovin-6 pokazala nižjo učinek kot z drugimi sredstvi. Pregledali smo izraze DR5 po dajanju tenovin-6 s kemoterapevtiki. DR5 up-predpis tenovin-6 je bil okrepljen s kombinacijo docetaksel v podjetja MKN 45 celic (Slika S3).

Pogovor

Pokazali smo, da tenovin-6 je pokazala močno protitumorsko aktivnost skupaj s smrt apoptotske rakavih celic pri želodčnih rakavih celic s tež TP53
kot tudi tiste z mt TP53
. Več specifični inhibitorji sirtuins, kot sirtinol, suramin, salermide in thiobarbiturates, so poročali, da zavira rast celic pri različnih vrstah raka [29]. Večina raziskovalcev je opisal protitumorne učinke pri Sirtuin inhibitorjev v celičnih linijah s mas TP53
[15], [29] - [31] in pripisana ti do aktivacije apoptoze z acetiliranjem p53. Medtem je bilo objavljenih več poročil v zadnjih letih, ki je pokazala, da protitumorne aktivnosti Sirtuin inhibitorjev v celičnih linijah s mt TP53
s P53-neodvisni poti [17], [18]. Pokazali smo, da DR5 rasklapanje oslabljena učinke protitumorne za tenovin-6 v TP53
-null želodčne rakave celice. Aktivacija signala poti v smrt receptorjev z up-regulacijo DR5 igra osrednjo vlogo pri tenovin-6-inducirane celične smrti, kot je omenjeno v drugih poročilih o Sirtuin inhibitorjev.

To je poročala, da salermide okrepljeno DR5 izraz in inducirano apoptozo človeških nedrobnoceličnim celic pljučnega raka celic izvedbo mt TP53
[17]. V tem poročilu, hkratno utišanje SIRT1
in SIRT2
kot tudi salermide reguliran DR5, skupaj z up-regulacijo ER, povezanih s stresom proteinov, kot ATF4 in CHOP. Ti rezultati kažejo, da je ER stres vključen v to indukcijo DR5. razmišljal smo, da tenovin-6 pripeljalo tudi do povečanja DR5 izražanja prek aktivacije ER stresa, posredovane s Perk, IRE1, ATF6 in CHOP. Vendar pa v nasprotju s pričakovanji ni bila očitno zaznali signal pot od ER stresa, ki ga poganja tenovin-6. Kljub temu pa je bilo jasno, dokazi, da je DR5 jih povzroča tenovin-6. Obstajajo tudi druge poti za-CHOP posredovane DR5 up-ureditev: reaktivnih kisikovih spojin (ROS), v c-Jun NH _{2-terminal kinaze (JNK) pot, na p38-mitogeni aktivirani protein kinaze, in tako naprej [ ,,,0],32] - [38]. Vendar pa nismo preuči te poti sem, ker nismo mogli ugotoviti aktivacijo CHOP v naši raziskavi. Naši rezultati kažejo, da drugi p53- in CHOP-neodvisni poti sodelujejo pri tenovin-6-inducirane DR5 izražanja v želodčnih rakavih celic.}

smo dokazali, da tenovin-6 povzroča apoptotske celične smrti po aktiviranju DR5 poti. Vendar p53 in CHOP poti zdelo verjetno, da bodo vključeni v ta indukcijo DR5, in mehanizem DR5 up-ureditev ostaja nejasna. Smo pred kratkim, raziskovali protitumorne učinke tenovin-6 v različnih celičnih linijah raka debelega črevesa, in našel svojo močan protitumorsko aktivnost proti je večina od njih z up-regulacijo DR5 ter [39]. Vendar v CaCo2 celic raka kolona (mt TP53
), apoptotske celične smrti, ki ga tenovin-6 je bila manj očitna in DR5 izraz ni bil močno reguliran. CaCo2 celic so poročali, da izražajo visoko stopnjo toplotne sunke proteinov znanih kot supresorski od DR5 [40] - [43]. To razmerje je treba dodatno preučiti v prihodnosti. SIRT1 lahko deacetylate histonov H4 lizin 16 (H4K16), kot tudi H3K9, H3K14 in H1K26, ki so tesno povezane z genskim utišanje [11]. Poleg tega, da ima veliko ustrezne non-histon podlage: transkripcijske faktorje, stroji elemente popravilo DNA, jedrske receptorje,-histon spreminjanje encime in molekule celične signalizacije, kot je opisano drugje [11] - [13]. Te številne in zapletene združenja SIRT1 aktivnosti so vključeni v različnih bioloških funkcijah, kot so regulacije izražanja genov in DNK škode popravila. Rakave celice so ponavadi zahtevajo te funkcije SIRT1, da bi preživeli, razmnožujejo in popravilo katastrofalno genomsko škodo. Nedavne študije so ugotovili sposobnost tenovin-6 inducira diferenciacijo in zavira avtofagija kot del svojih antineoplazemskimi učinke na celice levkemije [44], [45]. To je lahko odvisno od obnašanja raka celic kako tenovin-6 vpliva na neoplastični dejavnost. Nadaljnje raziskave so potrebne, da se pojasni povezavo med tenovin-6-posredovano smrtni poti in kompleksnih vlog SIRT1.

smo preučevali učinke združevanja docetaksel, SN-38, cisplatina in 5-FU s tenovin -6 ker so bili pogosto uporablja za zdravljenje bolnikov z napredovalega raka želodca [46], [47]. Rahlo do zmerno sinergijske učinke docetaksela in SN-38 z tenovin-6 v želodčni rak celičnih linijah, glede na to, TP53
stanje, so bile ugotovljene.

Čeprav je zdravljenje, ki vključujejo kombinacijo docetaksel in Sirtuin niso poročali inhibitorji, kombinacije docetaksela in drugih inhibitorjev HDAC kot trichostatin A in suberoilanilid hidroksamske kisline (SAHA), so poročali, da imajo sinergijskih učinkov, povezanih z aktivacijo kaspaze ali tubulina acetilacije v več raka celičnih linijah [48] - [50] . V naši raziskavi, še vedno ni jasno, če je tubulin acetilacija ga tenovin-6 vedno vplivala na učinek protitumorsko, ker je bil tubulin acetilacija prikazan samo v eni celični liniji. SN-38 (aktivna oblika irinotekan) je inhibitor DNA topoizomeraze I, ki deluje le v fazi S in ovira replikacijo DNK in celične delitve [51], [52]. inhibitorji HDAC povzroči acetiliranje histones in popustite strukturo kromatin, v katerem lahko inhibitor topoizomeraze lažje dostopa do DNA, olajša poškodbe DNK [51], [53]. Poleg tega je bil izredno povečanje proizvodnje ROS poročali v malih celic pljučnega raka celic ob hkratni izpostavljenosti SAHA in topotekana (derivat kamptotecina) [51]. Povečana moč zdravljenja združuje tenovin-6 in SN-38 je morda mogoče pripisati kooperativno ureditev odziv na poškodbe DNA.

Prednost kombiniranega zdravljenja z tenovin-6 in cisplatinom in 5-FU od bile manjše, kot z drugimi učinkovinami v želodčnih rakavih celicah, čeprav je bilo več poročil pokazali povečanje apoptoze s kombinirano zdravljenje s cisplatinom ali 5-FU in drugih inhibitorjev HDAC v drugih tumorjev [54] -. [57]

glede vrednotenje toksičnosti tenovin-6 smo uporabili linije fibroblastne celice kot alternativnih non-tumorogenih celic predvideti toksičnosti proti normalnih celic, ki se nanašajo na prejšnjih poročilih [15], [18]. Bilo je težko najti ustrezen normalno kontrolo za primerjalne študije, in se zato dokončno potrebna za študij toksičnosti tenovin-6 (v kombinaciji z zdravili proti raku) in vivo
s pomočjo živali ksenotransplantskih modele.

na koncu, inhibitor Sirtuin, tenovin-6, je pokazala močan protitumorski učinek proti človeške želodčne rakavih celic. To je bil neodvisen od TP53
stanju in je bila povzročena z regulacijo navzgor DR5. Nadaljnja raziskava je potrebno razjasniti mehanizem, s katerim tenovin-6 uravnava DR5 izraz. Tenovin-6 v kombinaciji z docetakselom in SN-38 je imel majhno prednost za zaviranje proliferacije želodca rakave celice, ki bi lahko zagotovil novo strategijo za zdravljenje napredovalega raka želodca.

Podpora Informacije
sliki S1.
Relativna intenziteta izražanja proteinov "je prikazano na sliki 3A. Semi-kvantitativna Western blot denzitometrija vključenih normalizacije za beta-aktinske ravni
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102831.s001
(TIF)
Slika S2.
citotoksične učinke citostatikov, v kombinaciji z tenovin-6. Citotoksične učinke citostatikov, vključno docetaksela, SN-38, cisplatinom in 5-FU, in njihovo krepitev učinkov tenovin-6 v želodcu rakavih celic z želodca rakavih celic. Celice smo gojili 72 ur z označenimi koncentracijami tenovin-6 in citostatikov. so imeli 5-FU (0,25 pM); A: Docetaxel (0,25 nM), B:: SN-38 (1 nM), C in D cisplatin (NUGC-3 smo obdelali z 0.5 uM cisplatinom 1 ali 0,5 pM) v kombinaciji z tenovin-6. Statistična pomembnost razlik med skupinami je bila ocenjena s pomočjo Dunnettov testa. * p
< 0,01; ** p
< 0,05. DOC: docetaksel, CDDP. Cisplatin
doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s002
(IOD)
Slika S3.
DR5 izrazi po dajanju tenovin-6 z docetakselom ali PP-38 v želodcu rakavih celic (MKN-45 in KatoIII). Docetaksel, SN-38 in tenovin-6 smo ga upravlja v koncentraciji 0,25 nM 1 nm in 2 um. Semi-kvantitativna Western blot denzitometrija vpletene normalizacije za beta-aktinske ravni. DOC. Docetaksel
doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s003
(TIF)

• Plos ONE: Polž urejeno MIR-375 zavira migracije in invazije želodčnega raka celic z usmerjanjem JAK2
• Plos ONE: spremenjeni Delta-Shaped Gastroduodenostomy v Totally laparoskopski distalnem želodca za želodca raku: varna in izvedljiva tehnika