PLoS ONE: priešnavikinis poveikis yra Sirtuin inhibitoriumi Tenovin-6, nuo skrandžio vėžio ląsteles per mirties receptoriaus 5 UP-straipsnį

Anotacija

Iki reguliuojama sirtuin 1 (SIRT1), NRS ^{+ - priklauso III klasei histono deacetilazės, deacetylates p53 ir slopina jo transkripcijos veiklą, todėl į mobiliuosius išlikimą. SIRT1 raiška buvo pranešta prognozuoja prastą išlikimą kai piktybinių navikų, įskaitant skrandžio vėžio. Tačiau priešnavikinis poveikis SIRT1 slopinimas išlieka silpnas skrandžio vėžio. Čia mes ištirti priešvėžiniai mechanizmus tam sirtuin inhibitoriumi tenovin-6, iš septynių žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų (keturi ląstelių linijų su laukinio tipo TP53
, du su mutantas tipo TP53
ir viena su null TP53
). Įdomu tai, kad tenovin-6 sukeltos apoptozės visų ląstelių linijas, o ne tik tuos, su laukinio tipo TP53,
bet mutantas tipo ir null versijos, lydimi iki reguliavimo mirties receptoriaus 5 (DR5). Į KatoIII ląstelių linijos (, TP53
-null), DR5 triukšmo slopinimo ženkliai susilpnintas tenovin-6 sukeltos apoptozės, rodo, kad lemiamas mechanizmas už jos priešvėžiniai efektai pagal aktyvavimo mirties receptoriaus signalo kelyje. Nors Endoplazminis tinklas stresas sukelia sirtuin inhibitoriais buvo pranešta, kad sukelti DR5 iki reguliavimo kitose vėžio ląstelių linijas, mes negalėjome rasti pažymėtą aktyvavimo juo susijusių molekulių, tokių kaip ATF6, gražintis ir pjaustyti, skrandžio vėžio ląstelių gydomiems tenovin- 6. Tenovin-6 kartu su docetakseliu arba SN-38 darė šiek tiek vidutinio sunkumo sinergetinį citotoksiškumo nuo skrandžio vėžio ląsteles. Taigi, tenovin-6 yra stiprus priešvėžinėmis žmogaus skrandžio vėžio ląsteles per DR5 iki reglamentavimą. Mūsų rezultatai turėtų būti naudingi ateityje klinikinės raidos sirtuin inhibitorių}

nurodomoji dalis:. Hirai S endo S Saito R Hirose, M, Ueno T Suzuki O et al. (2014) priešnavikinis poveikis yra Sirtuin inhibitoriumi Tenovin-6, nuo skrandžio vėžio ląsteles per mirties receptoriaus 5 UP-reglamentą. PLoS ONE 9 (7): e102831. Doi: 10,1371 /journal.pone.0102831

redaktorius: Andrejus L. Gartel, Ilinojaus universitetas Čikagoje, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Spalio 28, 2013; Priėmė: Gegužės 23, 2014 m Paskelbta: Lie 17, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Hirai et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijos-in-pagalbos iš švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų Japonijos (iki IH) ministerijos. buvo gauta jokių papildomų išorės finansavimas šiame tyrime. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš pagrindinių priežasčių vėžio mirties visame pasaulyje [1], [2]. Nors buvo sukurta įvairių chemoterapiniais vaistiniais preparatais išplitusiu skrandžio vėžiu, prognozė vis dar prastas ir naujų priešvėžinių vaistų nuo skrandžio vėžio, reikia. Skrandžio vėžys yra biologiškai ir genetiškai nevienalytė vėžys įtraukiant daug genetinių mutacijų ir epigenetinius taisyti ir [3]. Tarp jų anomalijas TP53
navikas slopintuvas genų vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis [4], [5]. Maždaug 30% pacientų, sergančių skrandžio vėžiu yra , TP53 mutacija
[6]. Net vėžinių ląstelių su laukinio tipo (WT) TP53
, buvo pranešta, kad funkcijos , TP53
slopina neigiamą reglamente, įskaitant ubiquitination, metilinimo ir deacetilinant [7], [8]. Šiame kontekste jis būtų perspektyvus strategija manyti, kad šių neigiamų reguliatoriai rezultatų gerinimo priešvėžiniai poveikio slopinimas per aktyvavimo p53 WT TP53
vėžio. Pelių dvigubai minutę 2 (MDM2) yra pagrindinis fiziologinis antagonistas p53 [7]. Mes anksčiau pranešė, kad MDM2 inhibitorius, nutlin-3, parodė stiprus priešvėžinius poveikį prieš skrandžio vėžio ląsteles per aktyvavimo p53 keliu [9]

Sirtuin 1 (SIRT1) NRS ^{+ -. Priklauso histono deacetilazės (HDAC), turi dalyvaujančių chromatino nuslopinami, ilgaamžiškumas ir genomo stabilumo funkcijų įvairovė. Jis randamas branduolio ir veikia kaip ląstelių medžiagų apykaitos būklės jutiklis išlikimo ir senėjimo pagal genotoksinio ir oksidacinio streso [10], [11]. Be Histonas deacetilinant, šios funkcijos iš dalies priklauso nuo įvairių ne Histonas baltymų, kuriuose yra transkripcijos faktorius deacetilinant: p53, forkhead dėžė (FOXO) šeimos baltymų, branduolinės veiksnys κB, C-Myc N-Myc, E2F1 ir hipoksija-indukuojamąją transkripcijos veiksniai (HIF) 1α /2α; chromatino susijusių fermentų: histono acetiltransferazė, P300, nuo DNR priklausantį kinazės subvieneto Ku80, ir TIP60; DNR remonto elementai: Ku70, RAD51 ir NBS1; ir ląstelių signalinių veiksniai: stat3, β-kateninai ir Smad7 [11] - [13]. SIRT1 fiziologiškai sąveikauja su p53 ir sumažina savo funkcijas vykdo per deacetilinant savo C-galinio Lys382 liekanos [12]. Padidėjusi SIRT1 buvo rasta daug vėžio, pavyzdžiui, skrandžio ir storosios žarnos [10], [14], ir pranešė, kad veiktų kaip naviko rengėjas. SIRT2 yra vienas iš citoplazmos NAD + - priklausomų Histonas deacetilazių ir deacetylates Histonas H3 lizino 56 (H3K56) ir alfa-tubulino. Jis taip pat pritaria ne Histonas substratai apie FOXO1, FOXO3 ir p53 su SIRT1 [11]. Tačiau tiksli vaidmuo SIRT2 išlieka silpnas vėžio biologija.}

Atsižvelgiant į tai, mes ištirti, ar tenovin-6, mažas molekulių junginys, kuris slopina SIRT1 ir SIRT2 funkcijas [15], [16], kuria priešvėžiniai poveikis per aktyvavimo p53 keliu skrandžio vėžio ląsteles. Neseniai buvo pranešta, kad SIRT inhibitoriai iki reguliuojama mirties receptorių 5 (DR5), yra naviko nekrozės faktoriaus receptoriaus šeimos narį, kai kurių vėžio formų [17], [18]. Mes papildomai studijavo šio receptoriaus dalyvavimą priešvėžiniai aktyvumą tenovin-6 skrandžio vėžio. Be to, mes išnagrinėjo tenovin-6 optinė sinergija su tradiciniais citotoksinių vaistų ateityje klinikinių tyrimų skrandžio vėžio.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linijos

Septyni skrandžio vėžio ląstelių buvo naudojamas eilutės: keturios ląstelių linijas su WT TP53
(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), dvi ląstelių linijos su mutantas tipo (mt) TP53
(NUGC-3, STKM-1), ir vienas ląstelių linija su null TP53
(KatoIII) [19] - [21]. Mobilaus ryšio linijos su WT TP53
(MCF-7 krūties vėžys, HEK293 žmogaus embriono inkstų ląstelių) ir MRC-5 žmogaus normalieji fibroblastai buvo įtrauktos kaip kontrolės šiame tyrime. MKN-45, NUGC-4, KatoIII ir MRC-5 ląstelių linijos buvo gauti iš RIKEN BRC Mobilusis bankas (Tsukuba, Japonija). SNU-1 ir MCF-7 ląstelių linijos buvo įsigyti iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (Rockville, MD). NUGC-3 ir HEK293 ląstelių linijos buvo gauti iš Sveikatos mokslų mokslinių tyrimų išteklius banko (Osaka, Japonija). STKM-1 ir STKM-2 ląstelių linijos buvo maloniai pateikė dr Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japonija).

Chemija

Tenovin-6 buvo įsigytas iš Cayman cheminis Įmonės (Ann Arbor, MI). Docetakselis, SN-38, cisplatina, 5-fluorouracilu (5-FU), doksorubicino ir thapsigargin buvo gauti iš WAKO (Osaka, Japonija). Jie buvo ištirpinta dimetilsulfokside (DMSO), esant 20 mM koncentracijos ir mėginiai buvo laikomi -20 ° C temperatūroje. Pradiniai tirpalai buvo praskiestas iki norimo galutinė koncentracija būtų su augimo terpe prieš naudojimą.

Ak ir Western blot analizė

SDS-polyaclylamidegel elektroforezės ir imunoblotingu buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau [22]. Kai vartojama pirminė ir antriniai antikūnai buvo taip. Triušis polikloniniai antikūnai prieš SIRT1 (D739), acetilintu (AC) -p53 (Lys382), fosforilinamos (Phospho) -p53 (Ser15), BCL-2, AC-α-tubulino (Lys40), mirtis receptorių 5 (DR5), Fas -associated mirties domenas (FADD), suskaldyti poli (ADP) -ribose polimerazė (PARP) (Asp214), ir pelės monokloniniai antikūnai prieš p21 ^{Waf /CIP1
(DCS60), Histonas H3 (96C10) , beta aktino (8H10D10), α -tubulin (DM1A) ir C /EBP homologues baltymo (pjaustyti) (L63F7), ir triušiams monokloniniai antikūnai prieš takas (C92B9), kaspazės-3 (8G10), inozitolis ir reikalauja fermentų (IRE ) 1α (14C10) ir PHOSPHO-RNR priklausomą baltymų kinazės-kaip Endoplazminis tinklas kinazės (Perk) (16F8) buvo gauti iš ląstelių Signalizacijos technologijos (Danvers, MA). Pelės monokloniniai antikūnai, kad p53 (BP53-12) buvo įsigytas iš ląstelių mokslo (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monokloninis antikūnas buvo iš Sigma-Aldrich. (St Louis, MO), ir anti-aktyvavimo transkripcijos faktorius 6 (ATF6) monokloninis antikūnas (70B1413.1) buvo iš Enzo Gyvosios gamtos mokslai (Farmingdale, NY). Triušis polikloninis antikūnas prieš AC-iuose H3 (Lys18) buvo iš Merck Millipore (BILLERICA, MA). Tiek krienų peroksidazės (HRP) konjuguoto anti-pelės IgG avių ir anti-triušio IgG asilas serumai buvo GE Healthcare (Buckinghamshire, Jungtinė Karalystė). Antikūnų privalomas buvo aptiktas naudojant ECL pirmininkas Imunoblotingo aptikimo sistema ( "GE Healthcare"), pagal gamintojo protokolą. Signalas intensyvumas buvo įvertintas naudojant EZ-CAPTURE II chemiliuminescencine vaizdo gavimo sistema (ATTO, Tokijas, Japonija).}

Realaus laiko kiekybine PGR analizei SIRT1 parsisiųsti ir SIRT2
genų ekspresijos

RNR mėginiai buvo paimti iš ląstelių lizate naudojant aukšto Pure RNR išskyrimas rinkinį (Roche Diagnostics, Manheimas, Vokietija), laikantis gamintojo nurodymų. Po to, kai genominės DNR buvo pašalintas DNaze, kDNR buvo pagamintas naudojant didelės talpos RNR-į-kDNR komplektas (Life "technologijas Corp., Carlsbad, CA). Realaus laiko kiekybine PGR buvo atliekama naudojant Taikoma BIOSYSTEMS 7500 Greitas Realaus laiko PGR sistema (taikoma BIOSYSTEMS Foster City, Kalifornija). Gruntai ir TaqMan zondas, SIRT1 parsisiųsti ir SIRT2
buvo gauti iš "Applied Biosystems (praba ID: Hs01009005 ir Hs00247263, atitinkamai), ir tie, 18S ribosomų RNR (18S rRNR)
suprojektuoti ir sintetinamas Sigma-Aldrich buvo taip: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (pirmyn gruntas), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (atvirkštinis gruntas), 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (zondas). Reakcijos buvo atliekami trimis egzemplioriais standartinėmis thermocycling sąlygomis naudojant 30 ng kDNR, 900 Nm pradmenis, 250 Nm zondai, ir Togman genų ekspresijos pagrindinį mišinį (Applied Biosystems), pagal gamintojo protokolą.

RNR išgauti iš ląstelės buvo analizuojami santykinius kiekius taikinio geno ( SIRT1, SIRT2
) ir nuoroda genas (, 18S rRNR
) kiekybinė realiojo laiko PGR.

WST-8 ląstelių gyvybingumo tyrimai

WST-8 kolorimetrin tyrimai buvo atliekami naudojant Mobilusis Skaičiavimo KIT-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japonija), pagal gamintojo protokolą. Ląstelės buvo pasėjamos į 96 duobučių plokšteles tankio 5 × 10 ^{3 ląstelės per gerai su 100 pL mitybinės terpės 24 h, kurie buvo gydomi tenovin-6 72 h, inkubuojamas esant tokiam WST-8 buvimą, ir tada analizuojama su iMark mikroplokštelės skaitytojui (Bio-Rad, Heraklis, Kalifornija).}

analizė apoptozės tėkmės citometrijos

Ląstelės buvo pasėjamos į 60-mm patiekalų iš 5 × tankio 10 ^{5 už indą. Po inkubacijos su tenovin-6 (10 mikromolių) arba lygiavertė suma DMSO už 72 h, ląstelės buvo švelniai pakėlė su Accutase (JAV biotechnologijų Parkeris Ford, PA) kambario temperatūroje 10 min. Po to ląstelės buvo plaunamas vieną kartą fosfatinio buferio druskų tirpalu. Apoptozinės ląstelės aptinka dvigubai dažant propidiumo jodido (PI) ir fluoresceino izotiocijanato (FITC) žymėto aneksinu naudojant aneksinu-FITC apoptozę aptikimo rinkinį (Beckman Coulter, Brea, Kalifornija), pagal gamintojo protokolą. tada tėkmės citometrijos analizė buvo atlikta su FACS Calibur srauto citometro (BD biomokslų, Franklin ežerų, NJ) ir CELLQuest programinė įranga (BD Biosciences).}

siRNR orientacija DR5

siRNR orientacija DR5 buvo sukurta naudojant siDirect programinę įrangą (http://sidirect2.rnai.jp/), kaip buvo pranešta anksčiau [22]. siRNR transfekcija buvo atliekami naudojant Lipofectamine RNAiMAX (INVITROGEN, Karlovi Varai, CA) pagal gamintojo instrukcijas. Valdymo siRNR buvo dirbtinis seka, skirta turi mažiausiai homologiją žmogaus ir pelės genai. Ta prasme ir antiprasmq kryptys siRNA naudojami šiame tyrime, buvo taip: DR5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 "(prasme), 5'-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3" (priešprasminį); kontrolė siRNR, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(pojūtis), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (Priešprasminis).

analize siRNA poveikį ląstelių augimui ir gyvybingumo, ląstelės buvo pasėja žemas tankis (1 × 10 ^{3 ląstelės per šulinio) 96 duobučių lėkštelėse, turinčiose 100 įxL RPMI1640 MEDIUM su 10% serumas iš veršiuko embriono (Sigma-Aldrich). Iš perkeltų ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas 72 ir 120 h po transfekciją iki WST-8 tyrimą.}

Kombinuotas puslapis

Norėdami nustatyti, ar tenovin-6 gali sustiprinti priešvėžiniai poveikį tradicinių chemoterapiniais preparatais, mes naudojamas derinys indeksas (PI) ir isobologram, apskaičiuotas pagal CalcuSyn programinę įrangą (Cambridge, Jungtinė Karalystė) pagal su Chou ir Talalay mediana efekto principu [23]. Šioje analizėje, PI > 1,3 rodo priešiškumą; PI = 1.1-1.3 vidutinio antagonizmas; PI = 0,9-1,1 suminis poveikis; PI = 0,8-0,9 nežymus sinergija; PI = 0,6-0,8 vidutinio sinergija; PI = 0,4-0,6 sinergija; ir PI = 0,2-0,4 stiprus sinergija.

Statistinė analizė

Visi eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais ir buvo kartojamas mažiausiai tris kartus. Visi duomenys yra išreikštas vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Skirtumų reikšmės nulėmė Stjudento t-testą ir Dunnett testo. P
k dydžiai < 0,05 buvo laikomas svarbiu

Rezultatai

išraiška SIRT1, SIRT2 ir acetilintų (AC) -p53 skrandžio vėžio ląstelių linijų
.

Pirmiausia, mes išnagrinėjome raiškos lygius SIRT1, SIRT2 ir AC-p53 septyniose skrandžio vėžio ląstelių linijas. Mes naudojome HEK293 ląstelių teigiamą kontrolę SIRT1 /2 ir MCF-7 ląstelės gydomi doksorubicinu teigiamai kontrolei AC-p53 [24]. Visi skrandžio vėžio ląstelių linijas, išskyrus NUGC-4 ir STKM-1 ląstelių išreiškė aukštą SIRT1 baltymų, SIRT2 ekspresijos lygis buvo žemas visose ląstelių linijų, išskyrus MKN-45 ląstelių (1A pav.) AC-p53 ekspresijos lygis buvo labai žemas visose skrandžio vėžio ląstelių linijų su WT TP53
.

analizavo genų ekspresiją SIRT1
ir SIRT2
realaus laiko kiekybine PGR. MKN-45 ląstelių eksponuojami SIRT1
genų ekspresijos, kad buvo apie 2,5 karto didesnis nei kad fibroblastų, bet ir kiti skrandžio vėžio ląstelių linijos nebuvo (1B pav.) Be NUGC-4 ląstelių, genų ekspresijos ir lygis SIRT1
buvo mažas, nes buvo SIRT1 baltymų. MKN-45 ląstelių parodė šiek tiek aukštos, SIRT2
genų ekspresijos, o kiti ląstelių linijas parodė gana žemas raiškos lygį.

Tenovin-6 slopinamas augimas skrandžio vėžio ląstelių

Kad patvirtinti tenovin-6 aktyvumą, mes studijavo ar tenovin-6 paveikė Histonas H3 ir alfa-tubulino acetilinimui. Tenovin-6 padidino Histonas acetilinimui trijų (MKN-45, NUGC-4 ir KatoIII) iš keturių skrandžio vėžio ląstelių linijų išbandytų, nurodant SIRT1 deacetilinant veikla (2A pav) slopinimas. AC-α-tubulino padidėjo tik viename ląstelių linijos (MKN-45) gydomi tenovin-6, taigi slopinimas SIRT2 deacetilinant veiklos negalėjo būti tikrai parodyta skrandžio vėžio ląsteles.

Be to, mes įvertino potencialo priešnavikinis poveikis tenovin-6 su skrandžio vėžio ląsteles. Kiekvienas skrandžio vėžys ląstelių linija buvo kultivuojamos iš tenovin-6 buvimą (0,2, 1, 5, 10, 20, ir 50 mikronų) tris dienas. Dozė priklauso nuo augimo slopinimas buvo stebimas visų ląstelių linijas, o ne tik tuos, su WT, TP53
bet MT ir null versijos (2b pav.) Jų IC _{50 vertės svyravo nuo 2,34 iki 4,28 mkm. Be to, BTS-8 tyrimas buvo atliktas į žmogaus fibroblastų ląstelių linijos MRC-5 (IC 50: 6.09 mikromolių) palyginti tenovin-6 toksiškumą skrandžio vėžio ląstelių linijų. Iš NUGC-4 ląstelių gydomiems tenovin-6 gyvybingumas buvo gerokai mažesnis nei MRC-5 ląstelių, kaip parodyta 2C pav.}

Tenovin-6 sukeltas Apoptozė ląstelių žūtį skrandžio vėžio ląstelių

Kaip parodyta 3A ir S1 paveiksle, tenovin-6 gydymo padidino p53 ir p21 išraišką masės TP53
ląstelių (MKN45 ir NUGC-4). Up-reguliavimo Ac-p53 buvo parodyta MKN-45 ląstelių, bet ne NUGC-4 ląstelių. Padidėjęs P21 sąvoka taip pat buvo pastebėtas mt TP53
ląstelių (NUGC-3). Priešingai, BCL-2 ekspresija nepakeitė beveik visas keturias skrandžio vėžio ląstelių linijas. Padidėjimas DR5 ir suskaldyti PARP išraiška buvo pastebėta visų ląstelių linijų išbandyti. Žodžio iš TRAIL lygių, kurie veikia kaip sankaba mirties signalizacijos ligando, buvo šiek tiek padidėjo visose ląstelių linijas, nors FADD, svarbus adapteris, išraiška nebuvo paveikti tenovin-6.

tiriama, ar tenovin-6 sumažėjo skrandžio vėžio ląstelių gyvybingumą per apoptozės ląstelių žūtį indukcijos. Vėžinės ląstelės buvo veikiamos ją iš tos 10 M koncentracijos ar tokio pat dydžio sumos kontrolės transporto priemonės (DMSO) už 72 h, ir vėliau yra nudažomi su FITC aneksino V ir PI. Jie buvo analizuojami tėkmės citometrijos: ląstelės neigiamas tiek aneksino V PI buvo laikomas ne aprotoninis, buvo laikomi ląstelės teigiami už aneksinu tik buvo laikomas anksti aprotoninis ir ląstelės teigiamas tiek aneksino V ir PI būti vėlu aprotoninis ar nekrozės. Poveikis MKN-45 ląstelių tenovin-6 padidino pradžioje ir pabaigoje etapų apoptozės frakcijas nuo 2,8% iki 52,1%, o nuo 1,8% iki 18,5%, atitinkamai (3b pav.) Panašūs padidėja gyventojų pradžioje ir pabaigoje etapų apoptozės buvo pastebėtas kitų ląstelių linijų (NUGC-4, NUGC-3, ir KatoIII). Tenovin-6 sukeltos apoptozės visų ląstelių linijų išbandyti, nepriklausomai nuo to, TP53
statusas.

Poveikis, DR5
nokdaunas ant tenovin-6-indukuotos apoptozės

Be to, patikrinti, ar DR5
triukšmo slopinimo įtakos tenovin-6 sukeltos apoptozės, ląstelių gyvybingumą ir Apoptozė norma buvo analizuojami WST-8 tyrimą ir tėkmės citometrijos, atitinkamai, TP53
-null KatoIII ląstelės. Slopinimas DR5 išraiškos konkretus siRNA (4a pav) gerokai sumažino tenovin-6-sukeltą ląstelių žūtį ir apoptozės KatoIII ląstelių (4b ir 4c paveikslą). Mes naudojome tris skirtingus siRNAs mūsų išankstinio eksperimento, ir mes gavome panašius rezultatus su bet siRNAs.

Mes tyrėme aktyvavimą Endoplazminis tinklas (ER) streso kelyje, kuris yra susijęs su DR5 iki reguliavimas, kaip ir anksčiau pranešė, [17]. CHOP schemą yra vienas iš labiausiai stipriai indukuoja DR5 prieš srovę apoptozės ir dažnai išleido per ER streso. Kaip parodyta 5A ir 5B pav, nors CHOP buvo šiek tiek iki-reguliuoja tenovin-6 gydymo visose keturiose skrandžio vėžio ląstelių linijų, daugėjant buvo žymiai mažesnis nei kontrolinių ląstelių, gydytų thapsigargin, kuris yra selektyvus inhibitorius sarkoplazminių /Endoplazminis tinklas Ca ^{2 + - ATPases ir plačiai naudojamas kaip korinio ER stresą [25], [26]. Dėl kitų rankas, IRE1, kuris yra ER stresas jutiklis ir kuri yra prieš srovę nuo CHOP, buvo šiek tiek daugiau-reguliuoja tenovin-6 gydymo visose ląstelių linijų, bet ne fosforilinto gražintis ir ATF6. [27], [28]. Atrodė neįtikėtina, kad tenovin-6 sukėlė ER stresą, vedantį į DR5 indukcijos mūsų skrandžio vėžio ląsteles.}

priešvėžiniai poveikis tenovin-6 kartu su chemoterapiniais preparatais

Galiausiai, mes nagrinėjo, ar tenovin- 6 sustiprintas priešnavikinį poveikį chemoterapinių agentų, įskaitant docetakselio, SN-38, cisplatinos, ir 5-FU, skrandžio vėžio ląstelių linijų. Keturi ląstelių linijos su WT TP53
(MKN-45, NUGC-4), MT, TP53
(NUGC-3) ir niekinis, TP53
(KatoIII) buvo gydomi su atskirai arba kartu su dviem dozėmis (2 ir 5 mikronų) iš tenovin-6 šių medžiagų. Koncentracija buvo 0,25 nM docetakselis, 1 nm SN-38, 0,5 arba 1 mkm cisplatina ir 0,25 mkm 5-FU. Kaip parodyta 1 lentelėje (ir S2 pav), docetakselio ir SN-38 parodė, šiek tiek arba vidutinio sunkumo sinergetinį efektą tenovin-6 gydymo trimis ląstelių linijų, ir cisplatina su tenovin-6 parodė, vidutinio sinergetinį efektą dviem ląstelių linijų, kadangi 5-FU kartu su tenovin-6 atskleidė mažesnį poveikį nei kitų medikamentų. Mes išnagrinėjo DR5 išraiškas pavartojus tenovin-6 su chemoterapiniais preparatais. DR5 iki reguliavimą pagal tenovin-6 buvo sustiprintas su docetakselio derinio MKN-45 ląstelių (S3 pav.)

Diskusijos

parodė, kad tenovin-6 parodė stiprus priešvėžinėmis kartu aprotoninis ląstelių mirtis žmogaus skrandžio vėžio ląstelių su WT TP53
taip pat tiems, su mt , TP53 pervežimas. Keletas konkrečių inhibitoriai sirtuins, pavyzdžiui, sirtinol, suramin, salermide ir thiobarbiturates, buvo pranešta, kad slopina ląstelių augimą įvairių rūšių vėžio [29]. Dauguma mokslininkų aprašyta priešvėžiniai poveikį sirtuin inhibitorių ląstelių linijų su WT TP53 pervežimas [15], [29] - [31], ir priskirti juos prie apoptozės aktyvavimo per acetilinimo p53. Tuo tarpu, keli pranešimai buvo paskelbti pastaraisiais metais įrodė, priešvėžiniai veiklą sirtuin inhibitorių ląstelių linijų mt , TP53
per p53 nepriklausomas takais [17], [18]. Mes parodėme, kad DR5 nokdaunas susilpnintas priešvėžiniai poveikį tenovin-6 , TP53
-null skrandžio vėžio ląsteles. Aktyvinimas mirties receptoriaus signalo keliu per naujausią reguliavimo DR5 vaidina svarbų vaidmenį tenovin-6 sukelta ląstelių žūtį, kaip minėta kitose ataskaitose apie sirtuin inhibitoriais.

Buvo pranešta, kad salermide sustiprintas DR5 išraiška ir sukeliama apoptozė žmogaus nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžio ląstelių vykdyti mt TP53
[17]. Toje ataskaitoje, sinchroninis triukšmo slopinimo ir SIRT1
ir SIRT2
taip pat salermide iki reguliuojama DR5, lydimas up-reguliavimo ER streso baltymų, pavyzdžiui, ATF4 ir sukapoti. Šie rezultatai rodo, kad ER stresas buvo įtrauktas į šį DR5 indukcija. Mes spėliojo, kad tenovin-6 taip pat lėmė ir DR5 raiškos padidėjimas per aktyvavimo ER streso tarpininkaujant gražintis, IRE1, ATF6, ir sukapoti. Tačiau, priešingai nei tikėtasi, signalas kelias ER streso aktyvuota tenovin-6 nebuvo akivaizdžiai aptikta. Nepaisant to, kai buvo aišku, kad DR5 buvo sukeltas tenovin-6. Yra kitų būdų CHOP schemą tarpininkaujant DR5 iki reguliavimą: reaktyvių deguonies formų (ROS), C-Birželio NH _{2-terminalas kinazės (JNK) keliu, kad p38 mitogenu aktyvinto proteino kinazės keliu, ir taip toliau [ ,,,0],32] - [38]. Tačiau mes nenagrinėjo šių kelius, nes čia mes negalėjome nustatyti CHOP aktyvacijos mūsų tyrime. Mūsų rezultatai rodo, kad kiti p53- ir sukapoti nepriklausomas keliai dalyvauti tenovin-6 sukeltos DR5 raiškos skrandžio vėžio ląsteles.}

parodė, kad tenovin-6 sukeltas Apoptozė ląstelių žūtį per aktyvavimo DR5 keliu. Tačiau p53 ir sukapoti keliai atrodė mažai tikėtina, kad dalyvauti šiame DR5 indukcijos, ir DR5 mechanizmas iki reguliavimą lieka neaiškus. Mes neseniai, ištirtas priešvėžinius poveikį tenovin-6 keliose gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų ir rado savo galingą priešvėžinėmis, dauguma jų su up-reguliavimo DR5, taip pat [39]. Tačiau CaCo2 gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse (mt , TP53
), apoptozės ląstelių žūtį tenovin-6 buvo mažiau akivaizdus ir DR5 išraiška nebuvo stipriai iki reguliuojama. CaCo2 ląstelių buvo pranešta išreikšti aukštą šilumos šoko baltymų žinomas kaip DR5 [40] slopintuvas - [43]. Šis santykis turėtų būti toliau tiriamas ateityje. SIRT1 gali deacetylate iuose H4 lizino 16 (H4K16), taip pat H3K9, H3K14 ir H1K26, kuri yra glaudžiai susijusi su genai yra nuslopinami [11]. Be to, ji turi daug atitinkamus ne Histonas substratai transkripcijos faktorius, DNR reparacijos mašinų elementai, branduolio receptorius, Histonas keičiančių fermentus ir ląstelių signalinės molekulės, kaip aprašyta kitur [11] - [13]. Šie daug ir sudėtingų asociacijos SIRT1 veiklos dalyvauja įvairių biologinių funkcijų, tokių kaip reguliuoti genų ekspresiją ir DNR pažaidų taisymo. Vėžio ląstelės yra linkę reikalauti šių SIRT1 funkcijas tam, kad išgyventų, plisti, ir remontas katastrofišką genomo žalą. Naujausi tyrimai nustatė, kad tenovin-6 sugebėjimą sukelti diferenciaciją ir slopina autofagija kaip dalį savo antinavikiniais poveikio leukemijos ląstelių [44], [45]. Tai gali priklausyti nuo vėžio ląstelių elgesį kaip tenovin-6 paveikia neoplastinį veiklą. Tolesni tyrimai yra reikalingi išaiškinti tarp tenovin-6-tarpininkaujant mirties keliu ir sudėtingų vaidmenų SIRT1 nuorodą.

išnagrinėjo derinant docetakselio poveikis, SN-38, cisplatinos ir 5-FU su tenovin -6, nes jie buvo plačiai naudojamas gydyti pacientams, sergantiems progresuojančiu skrandžio vėžio [46], [47]. Šiek tiek vidutinio sunkumo sinergetinį poveikį docetakselio ir SN-38 su tenovin-6 skrandžio vėžio ląstelių linijas, nepriklausomai nuo to, TP53
statusas, buvo rasta.

Nors gydymas dalyvauja derinius docetakselio ir sirtuin nebuvo pranešė inhibitoriai, buvo pranešė, kad deriniai docetakselio ir kitų HDAC inhibitorių, pavyzdžiui, trichostatin A ir suberoylanilide hidroksamo rūgšties (SAHA) turėti sinergetinį poveikį, susijusį su kaspaze aktyvinimo ar tubulino acetilinimo keliose vėžio ląstelių linijų [48] - [50] , Mūsų tyrimo duomenimis, vis dar neaišku, jei tubulino acetilinimo iki tenovin-6 visada paveikė priešvėžiniai poveikį, nes tubulino acetilinimo buvo parodyta tik viena ląstelių linijos. SN-38 (aktyvi forma irinotekano) yra DNR topoizomerasės Aš inhibitorius, veikia tik S fazės metu ir trukdo DNR replikacijos ir ląstelių dalijimąsi [51], [52]. HDAC inhibitoriai sukelia acetilinimui iš Histonas ir atlaisvinkite chromatino struktūrą, pagal kurią topoizomerasės inhibitorius gali lengviau prieiti DNR, palengvinti DNR žalą [51], [53]. Be to, puikus padidėjimas ROS kartos buvo pranešė, kad į smulkiųjų ląstelių plaučių vėžio ląstelių upon vienu metu veikia SAHA ir topotekano (A kamptotecino darinio) [51]. Padidėjęs stiprumas Gydymo derinant tenovin-6 ir SN-38 gali būti priskirtinos bendradarbiavimo reguliavimo DNR pažeidimai atsakymą.

kombinuoto gydymo tenovin-6 ir cisplatina arba 5-FU pranašumas buvo mažesnis nei su kitais vaistais skrandžio vėžio ląsteles, nors keletas pranešimų įrodė apoptozės patobulinimą, kartu gydant cisplatinos arba 5-FU ir kitų HDAC inhibitorių kitų navikų [54] -. [57]

dėl toksiškumas vertinimas tenovin-6, mes panaudojome fibroblastų ląstelių linijos, kaip ir alternatyvių ne kancerogeniniam ląstelių prognozuoti toksiškumą nuo normalios ląstelės susijusius su ankstesnių ataskaitų [15], [18]. Tai buvo sunku rasti tinkamą normalaus kontrolę lyginamųjų tyrimų, todėl galutinai reikia ištirti tenovin-6 toksiškumą (kartu su priešvėžiniais vaistais) vivo
, naudojant gyvūnų ksenografiniuose modelius.

išvadą a sirtuin inhibitorius, tenovin-6, parodė tvirtą priešvėžiniai poveikį prieš žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Tai buvo nepriklausoma TP53
statusą ir buvo sukeltas per naujausią reguliavimo DR5. Reikia atlikti daugiau tyrimų siekiant paaiškinti mechanizmą, pagal kurį tenovin-6 reguliuoja DR5 išraiška. Tenovin-6 derinama su docetakseliu ir SN-38 turėjo mažą pranašumą slopinimo skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, kuris galėtų teikti naujoviškas strategiją išplitusio skrandžio vėžiui gydyti.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
Santykinis intensyvumas baltymų raiška parodyta 3A pav. Pusiau kiekybinis Vakarų blotingo densitometrijos dalyvauja normalizuoti į beta-aktino lygius
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102831.s001
(TIF)
S2 pav.
citotoksinis poveikis chemoterapinių vaistų kartu su tenovin-6. Citotoksinis poveikis chemoterapiniais vaistais, įskaitant docetakselio, SN-38, cisplatinos ir 5-FU ir jų stiprinimas iš tenovin-6 poveikio skrandžio vėžio ląstelių su skrandžio vėžio ląsteles. Ląstelės buvo auginamos 72 h, nurodantis, kaip koncentracijos tenovin-6 ir chemoterapinių vaistų. A: docetakselio (0,25 nM), B: SN-38 (1 nM), C: cisplatina (1 arba 0,5 mkm; NUGC-3 buvo gydomi 0,5 mkm cisplatina), ir D: 5-FU (0,25 mkm) buvo suteikta kartu su tenovin-6. Statistinis reikšmingumas skirtumų tarp grupių buvo vertinami naudojant Dunnett testą. * P
< 0,01; ** P
< 0,05. IOA: docetakselis, CDDP:. Cisplatina
Doi: 10,1371 /journal.pone.0102831.s002
(TIF)
S3 pav.
DR5 posakiai pavartojus tenovin-6 su docetakseliu arba SN-38 skrandžio vėžio ląstelių (MKN-45 ir KatoIII). Docetakselis, SN-38 ir tenovin-6 buvo suleidus 0,25 nM koncentracijos, 1 nm ir 2 mkm. Pusiau kiekybinis Imunoblotingo densitometrijos dalyvaujančių normalizuoti į beta-aktino lygį. DOC. Docetakselis
Doi: /journal.pone.0102831.s003
(TIF)
10,1371

• PLoS ONE: Sraigė reguliuojama MIR-375 slopina migracija ir invazija skrandžio vėžio ląstelių Nukreipimas JAK2
• PLoS ONE: modifikuotas delta formos Gastroduodenostomy į visiškai Laparoskopinė distalinio pašalintas skrandis skrandžio vėžiu: Saugus ir įmanoma Technique