PLOS ONE: antitumoraux Effets d'un Inhibiteur Sirtuin, Tenovin-6, contre les cellules cancéreuses gastrique par la mort des récepteurs 5-Up Regulation

Résumé

Up-régulé sirtuines 1 (SIRT1), un NAD ^{+ -dépendante classe III histone déacétylase, désacétyle p53 et inhibe son activité transcriptionnelle, conduisant à la survie cellulaire. surexpression SIRT1 a été rapporté pour prédire une faible survie dans certaines tumeurs malignes, notamment le cancer gastrique. Cependant, l'effet antitumoral de l'inhibition SIRT1 reste insaisissable dans le cancer gastrique. Ici, nous avons étudié les mécanismes antitumoraux d'un inhibiteur de sirtuines, tenovin-6, dans sept lignées cellulaires de cancer gastrique humain (quatre lignées cellulaires avec de type sauvage TP53
, deux avec de type mutant TP53
, et une avec null TP53
). Fait intéressant, tenovin-6 induit l'apoptose dans toutes les lignées cellulaires, non seulement ceux de type sauvage TP53,
mais aussi des versions de type mutant et null, accompagnés de la régulation du récepteur de mort 5 (DR5). Dans la lignée cellulaire KatoIII ( TP53
-null), DR5 silencing nettement atténué l'apoptose tenovin-6-induite, ce qui suggère que le mécanisme de pivotement derrière ses effets antitumoraux est basée sur l'activation de la voie de signalisation du récepteur de mort. Bien que le stress du réticulum endoplasmique causé par les inhibiteurs de sirtuines a été signalé pour induire DR5 régulation à la hausse dans d'autres lignées cellulaires de cancer, nous ne pouvions pas trouver une activation marquée de ses molécules apparentées, telles que ATF6, PERK et CHOP, dans les cellules de cancer gastrique traités avec tenovin- 6. Tenovin-6 en combinaison avec le docétaxel ou SN-38 a exercé une légère à modérée cytotoxicité synergique contre les cellules cancéreuses gastriques. En conclusion, tenovin-6 a une activité antitumorale puissante contre les cellules cancéreuses gastriques humaines par régulation à la hausse de DR5. Nos résultats devraient être utiles pour l'avenir du développement clinique des inhibiteurs de sirtuines}

Citation:. Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) antitumoraux Effets d'un Inhibiteur Sirtuin, Tenovin-6, contre les cellules cancéreuses gastrique par la mort des récepteurs 5-Up règlement. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10.1371 /journal.pone.0102831

Editeur: Andrei L. Gartel, Université de l'Illinois à Chicago, États-Unis d'Amérique

Reçu le 28 Octobre 2013; Accepté le 23 Juin 2014; Publié le 17 Juillet, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Hirai et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par des subventions-in-Aid du ministère de l'Education, Culture, sports, science et technologie du Japon (à IH). Aucun financement externe supplémentaire a été reçu pour cette étude. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde [1], [2]. Bien que diverses chimiothérapies pour le cancer gastrique avancé ont été mis au point, le pronostic est des médicaments anticancéreux pauvres et nouveaux pour le cancer gastrique sont encore nécessaires. Le cancer gastrique est un cancer biologiquement et génétiquement hétérogène impliquant de nombreuses mutations génétiques et épigénétiques alternances [3]. Parmi ceux-ci, des anomalies de la TP53
gène suppresseur de tumeur jouent un rôle important dans la tumorigenèse [4], [5]. Environ 30% des patients atteints de cancer gastrique ont TP53 de la mutation [6]. Même dans les cellules cancéreuses avec de type sauvage (wt) TP53
, il a été rapporté que la fonction de TP53
est supprimée par régulation négative dont ubiquitination, la méthylation, et désacétylation [7], [8]. Dans ce contexte, il serait une stratégie prometteuse pour supposer que l'inhibition de ces résultats négatifs régulateurs dans l'amélioration des effets antitumoraux par l'activation de p53 dans les poids des cancers de TP53. Murine deux minutes 2 (MDM2) est un antagoniste physiologique majeur de p53 [7]. Nous avons précédemment rapporté que l'inhibiteur de MDM2, nutlin-3, a démontré des effets antitumoraux puissants contre les cellules de cancer gastrique par l'activation de la voie p53 [9]

Sirtuin 1 (SIRT1), un NAD ^{+ -. Dépendante histone désacétylases (HDAC), a une variété de fonctions impliquées dans la répression de la chromatine, la longévité et la stabilité génomique. On le trouve dans le noyau et agit comme un capteur de l'état métabolique cellulaire et la survie sénescence sous stress génotoxique et oxydative [10], [11]. Outre la désacétylation des histones, ces fonctions dépendent en partie de la désacétylation de diverses protéines non-histones qui incluent des facteurs de transcription: p53, boîte forkhead (FOXO) des protéines de la famille, le facteur kB nucléaire, c-MYC, N-MYC, E2F1 et hypoxie-inductible les facteurs de transcription (HIF) 1α /2α; des enzymes liées à la chromatine: histone acétyltransférase, P300, sous-unité kinase dépendante de l'ADN Ku80 et TIP60; éléments de réparation d'ADN: Ku70, RAD51 et NBS1; et des facteurs de signalisation cellulaire: STAT3, β-caténine et Smad7 [11] - [13]. SIRT1 interagit physiologiquement avec p53 et atténue ses fonctions par désacétylation à sa Lys382 résidu C-terminal [12]. La surexpression de SIRT1 a été trouvée dans de nombreux cancers, tels que l'estomac et du côlon [10], [14], et rapporté à fonctionner comme promoteur de tumeur. SIRT2 est l'un des cytoplasmique NAD + - histone désacétylases dépendantes et désacétyle histone H3 lysine 56 (H3K56) et α-tubuline. Il partage également des substrats non-histones de FOXO1, FOXO3 et p53 avec SIRT1 [11]. Cependant, le rôle exact de SIRT2 reste insaisissable dans la biologie du cancer.}

Dans ce contexte, nous avons étudié si tenovin-6, un composé à petite molécule qui inhibe les fonctions de SIRT1 et SIRT2 [15], [16], exercée les effets anti-tumoraux par l'activation de la voie p53 dans les cellules cancéreuses gastriques. Récemment, il a été rapporté que les inhibiteurs de SIRT régulés à la hausse du récepteur de mort 5 (DR5), un membre de la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale, dans certains cancers [17], [18]. En outre, nous avons étudié l'implication de ce récepteur dans l'activité anti-tumorale du tenovin-6 pour le cancer gastrique. En outre, nous avons examiné la synergie des tenovin-6 avec des médicaments cytotoxiques classiques pour l'avenir du développement clinique dans le cancer gastrique.

Les lignées cellulaires de Matériels et méthodes

Sept cellules de cancer gastrique lignes ont été utilisées: quatre lignées cellulaires avec poids TP53
(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), deux lignées de cellules avec de type mutant (mt) TP53
(NUGC-3, STKM-1), et une ligne cellulaire avec null TP53
(KatoIII) [19] - [21]. Les lignées cellulaires avec poids (MCF-7 cancer du sein, des cellules de rein embryonnaire humain HEK293) de TP53 et MRC-5 fibroblastes humains normaux ont été inclus comme témoins dans cette étude. MKN-45, NUGC-4, KatoIII et MRC-5 lignées cellulaires ont été obtenues auprès RIKEN BRC banque de cellules (Tsukuba, Japon). SNU-1 et MCF-7 lignées cellulaires ont été acquises auprès de l'American Type Culture Collection (Rockville, MD). NUGC-3 et HEK293 lignées cellulaires ont été obtenus à partir de Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japon). STKM-1 et STKM-2 lignées cellulaires ont été aimablement fournies par le Dr Shunsuke Yanoma (Université de Yokohama, School of Medicine, Japon).

Produits chimiques

Tenovin-6 a été acheté chez Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Le docétaxel, le SN-38, le cisplatine, le 5-fluorouracile (5-FU), la doxorubicine et la thapsigargine ont été obtenus auprès de Wako (Osaka, Japon). Ils ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 20 mM, et des aliquotes ont été stockées à -20 ° C. Les solutions mères ont été diluées aux concentrations finales désirées avec un milieu de croissance avant l'utilisation.

Anticorps et analyse par Western blot

SDS-polyaclylamidegel électrophorèse et Western blot ont été réalisées comme décrit précédemment [22]. Les anticorps primaires et secondaires utilisés étaient les suivants. anticorps polyclonaux de lapin contre SIRT1 (D739), acétyle (Ac) -p53 (Lys382), phosphorylée (phospho) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubuline (Lys40), le récepteur de mort 5 (DR5), Fas domaine de mort -Associated (FADD), poly clivé (ADP) polymérase Ribose (PARP) (Asp214), et monoclonaux de souris anticorps contre p21 ^{Waf /Cip1
(DCS60), histone H3 (96C10) , β-actine (8H10D10), α tubuline (DM1A) et la protéine C /EBP homologue (CHOP) (L63F7), et le lapin anticorps monoclonaux contre TRAIL (C92B9), 3 caspase (8G10), enzyme inositol nécessitant (IRE ) 1α (14C10), et phospho-ARN-dépendante de type protéine kinase réticulum endoplasmique kinase (PERK) (16F8) ont été obtenus à partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anticorps monoclonal de souris p53 (BP53-12) a été acheté auprès de Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11), l'anticorps monoclonal était auprès de Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO), et anti-facteur d'activation de la transcription 6 (ATF6) anticorps monoclonal (70B1413.1) était de Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Anticorps polyclonal de lapin à Ac-histone H3 (Lys18) provenait de Merck Millipore (Billerica, MA). À la fois la peroxydase de raifort (HRP) conjugué à IgG anti-souris de mouton et d'IgG anti-lapin d'âne sérums provenaient de GE Healthcare (Buckinghamshire, Royaume-Uni). la liaison d'anticorps a été détecté en utilisant un système ECL premier transfert de type Western de détection (GE Healthcare), conformément au protocole du fabricant. L'intensité du signal a été quantifié en utilisant Ez-capture II chimioluminescence système d'imagerie (Atto, Tokyo, Japon).}

PCR quantitative en temps réel pour l'analyse de la SIRT1
et SIRT2
expression

des échantillons d'ARN de gènes ont été extraits de lysat cellulaire en utilisant un kit de haute pur RNA Isolation (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne), conformément aux instructions du fabricant. Après que l'ADN génomique a été éliminé par la DNase, l'ADNc a été préparé à l'aide d'une haute capacité de l'ARN de l'ADNc-kit (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant un système Applied Biosystems PCR rapide en temps réel 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Amorces et sonde TaqMan pour SIRT1
et SIRT2
ont été obtenus auprès d'Applied Biosystems (Assay ID: Hs01009005 et Hs00247263, respectivement), et ceux pour ARN ribosomal 18S (18S)
conçu et synthétisé par Sigma-Aldrich étaient comme suit: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (amorce directe), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (amorce inverse), 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (sonde). Les réactions ont été réalisées en triple exemplaire dans des conditions de thermocyclage standard en utilisant 30 ng d'ADNc, 900 amorces nm, 250 sondes nm, et une expression TaqMan Gene Master Mix (Applied Biosystems), conformément au protocole du fabricant.

ARN extraits à partir de cellules ont été analysés pour les quantités relatives du gène cible ( SIRT1, SIRT2
) et le gène de référence ( 18S
) par quantitative PCR en temps réel.

des dosages WST-8 viabilité des cellules

WST-8 dosages colorimétriques ont été effectués en utilisant une cellule de comptage Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japon), conformément au protocole du fabricant. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 5 x 10 ^{3 cellules par puits avec 100 ul de milieu de culture pendant 24 h, traité avec tenovin-6 pendant 72 heures, incubées en présence de WST-8, puis analysé avec un lecteur de microplaques iMark (Bio-Rad, Hercules, CA).}

Analyse de l'apoptose par cytométrie en flux

Les cellules ont été ensemencées dans des boîtes de 60 mm à une densité de 5 x 10 ^{5 par plat. Après incubation avec tenovin-6 (10 uM) ou une quantité équivalente de DMSO pendant 72 h, les cellules ont été doucement soulevé avec Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA) à la température ambiante pendant 10 min. Les cellules ont ensuite été lavées une fois avec du tampon phosphate salin. Les cellules apoptotiques ont été détectées par une double coloration avec de l'iodure de propidium (PI) et de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué à l'annexine V à l'aide d'un kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection (Beckman Coulter, Brea, CA), conformément au protocole du fabricant. l'analyse par cytométrie de flux a ensuite été réalisée avec un flux FACS Calibur cytomètre (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) et le logiciel CELLQuest (BD Biosciences).}

siRNA ciblant DR5

siRNA ciblant DR5 a été conçu en utilisant un logiciel siDirect (http://sidirect2.rnai.jp/), tel que rapporté précédemment [22]. transfection de siRNA a été réalisée en utilisant de la Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), conformément aux instructions du fabricant. SiRNA contrôle est une séquence artificielle conçue pour avoir le moins d'homologie avec des gènes humains et murins. Les brins sens et antisens de l'ARNsi utilisés dans cette étude étaient les suivants: DR5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(sens), 5' UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3 '(antisens); siRNA contrôle, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(sens), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (antisens).

Pour l'analyse des effets de siRNA sur la croissance et la viabilité cellulaire, les cellules ont été étalées à une faible densité (1 × 10 ^{3 cellules par puits) dans des plaques à 96 puits contenant 100 pi de milieu RPMI1640 avec 10% de sérum de veau foetal (Sigma-Aldrich). La viabilité des cellules transfectées a été évaluée 72 et 120 h après la transfection par WST-8 dosage.}

indice de combinaison

Pour déterminer si tenovin-6 peut améliorer les effets antitumoraux des agents chimiothérapeutiques classiques, nous utiliser un indice de combinaison (CI) et un isobologramme calculé en utilisant le logiciel CalcuSyn (Cambridge, UK), conformément au principe de l'effet médian de Chou et Talalay [23]. Dans cette analyse, CI > 1.3 indique l'antagonisme; IC = 1,1-1,3 antagonisme modéré; CI = 0,9-1,1 effet additif; IC = 0,8-0,9 légère synergie; IC = 0,6-0,8 synergisme modérée; CI = 0,4-0,6 synergisme; et CI = 0,2-0,4 forte synergie.

L'analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en triple exemplaire et ont été répétées au moins trois fois. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (SD). L'importance des différences a été déterminée par le test t de Student et le test de Dunnett. p
-values ​​< 0,05 ont été considérées comme significatives

Les de

Résultats Expression de SIRT1, SIRT2 et acétyle (Ac) -p53 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique
.

Tout d'abord, nous avons examiné les niveaux de SIRT1, SIRT2 expression, et Ac-p53 dans sept lignées cellulaires de cancer gastrique. Nous avons utilisé des cellules HEK293 pour le contrôle positif de SIRT1 /2, et MCF-7 cellules traitées avec de la doxorubicine pour le contrôle positif des Ac-p53 [24]. Toutes les lignées cellulaires de cancer gastrique à l'exception de NUGC-4 et STKM-1 des cellules ont exprimé des niveaux élevés de protéine SIRT1, et les niveaux d'expression de SIRT2 était faible dans toutes les lignées cellulaires à l'exception des cellules MKN-45 (figure 1A). les niveaux d'expression Ac-p53 étaient très faibles dans toutes les lignées cellulaires de cancer gastrique avec poids TP53
.

Nous avons analysé l'expression du gène de la SIRT1
et SIRT2
par PCR quantitative en temps réel. MKN-45 cellules exposées l'expression du gène de SIRT1 qui était d'environ 2,5 fois supérieure à celle dans les fibroblastes, mais d'autres lignées cellulaires de cancer gastrique ne l'ont pas (figure 1B). Dans NUGC-4 cellules, le niveau d'expression du gène de la SIRT1
était faible, tout comme la protéine SIRT1. MKN-45 cellules ont montré peu élevé l'expression du gène de SIRT2, tandis que d'autres lignées cellulaires ont montré des niveaux d'expression plutôt faible.

Tenovin-6 a inhibé la croissance de

Dans des cellules de cancer gastrique afin pour confirmer tenovin-6 activité, nous avons étudié si tenovin-6 affecté l'acétylation de l'histone H3 et α-tubuline. Tenovin-6 augmente l'acétylation de l'histone dans les trois (MKN-45, NUGC-4 et KatoIII) des quatre lignées cellulaires de cancer gastrique testé, ce qui indique l'inhibition de l'activité de désacétylation SIRT1 (figure 2A). Ac-α-tubuline a augmenté dans une seule lignée cellulaire (MKN-45) traités par tenovin-6, d'où l'inhibition de l'activité de désacétylation SIRT2 ne pouvait pas être définitivement montré dans les cellules de cancer gastrique.

Ensuite, nous avons évalué le potentiel l'effet anti-tumoral de tenovin-6 contre les cellules cancéreuses gastriques. Chaque lignée cellulaire de cancer gastrique a été cultivé en présence d'tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20 et 50 pM) pendant trois jours. inhibition de la croissance dépendante de la dose a été observée dans toutes les lignées cellulaires, non seulement ceux qui ont en poids TP53
mais aussi mt et versions null (Figure 2B). Leurs IC _{50 valeurs variaient de 2,34 à 4,28 uM. En outre, WST-8 essai a été réalisé dans la lignée cellulaire de fibroblaste humain MRC-5 (IC 50: 6,09 pm) pour comparer la toxicité des tenovin-6 à des lignées cellulaires de cancer gastrique. La viabilité des NUGC-4 des cellules traitées avec tenovin-6 était significativement inférieure à celle des cellules MRC-5, comme représenté sur la figure 2C.}

Tenovin-6 induit la mort cellulaire apoptotique dans les cellules cancéreuses gastriques

Comme le montre la figure 3A et S1, tenovin 6-traitement a augmenté l'expression de p53 et p21 en poids cellules de TP53 (MKN45 et NUGC-4). Régulation à la hausse de l'Ac-p53 a été montré dans les cellules MKN-45, mais pas dans NUGC-4 cellules. L'expression accrue de p21 a également été observée dans les mt Les cellules TP53 de (NUGC-3). En revanche, l'expression de Bcl-2 n'a pas changé dans presque toutes les quatre lignées cellulaires de cancer gastrique. Des augmentations de DR5 et de l'expression de PARP clivée ont été observées dans toutes les lignées cellulaires testées. Les niveaux d'expression de TRAIL, qui fonctionnent comme un ligand dans la signalisation de couplage de mort, a été légèrement augmenté dans toutes les lignées cellulaires, bien que l'expression de FADD, un adaptateur important n'a pas été affectée par tenovin-6.

Nous examiner si tenovin-6 a réduit la viabilité des cellules de cancer gastrique par l'induction de la mort cellulaire apoptotique. Les cellules cancéreuses ont été exposées à elle à une concentration de 10 uM ou une quantité équivalente du véhicule témoin (DMSO) pendant 72 heures, puis colorées avec l'annexine V-FITC et PI. Elles ont été analysées par cytométrie de flux: les cellules négatives pour les deux annexine V et PI ont été considérés comme non-apoptotique, les cellules positives pour annexine V seulement ont été considérés comme apoptotique précoce, et les cellules positives pour les deux annexine V et PI ont été considérés être en retard apoptotique ou nécrotique. L'exposition de MKN-45 cellules à tenovin-6 a augmenté les fractions de phases précoces et tardives de l'apoptose de 2,8% à 52,1% et de 1,8% à 18,5%, respectivement (figure 3B). Des augmentations similaires dans les populations dans les phases précoces et tardives de l'apoptose ont été observés dans d'autres lignées cellulaires (NUGC-4, NUGC-3, et KatoIII). Tenovin-6 induit l'apoptose dans toutes les lignées cellulaires testées, quel que soit TP53 de statut.

Effet de DR5 de l'effet de choc sur tenovin-6 induite par l'apoptose

ensuite, pour vérifier si DR5
silençage affecté l'apoptose, la viabilité cellulaire et taux apoptotique tenovin-6 induite ont été analysés par WST-8 dosage et cytométrie de flux, respectivement, dans TP53
-null cellules KatoIII. L'inhibition de l'expression DR5 par siRNA spécifique (figure 4A) a réduit significativement la mort cellulaire tenovin-6-induite et de l'apoptose dans les cellules KatoIII (figure 4B et 4C). Nous avons utilisé trois siRNA différents dans notre expérience préliminaire, et nous avons obtenu des résultats similaires avec des ARNsi.

Nous avons étudié l'activation du réticulum endoplasmique (RE) voie de stress, qui est lié à DR5-régulation, comme précédemment rapportée [17]. CHOP est un inducteur plus puissant de DR5 et en amont de l'apoptose, et souvent libérée pendant le stress du RE. Comme cela est représenté sur la figure 5A et 5B, bien que CHOP était légèrement régulé à la hausse par tenovin-6 de traitement dans l'ensemble des quatre lignées cellulaires de cancer gastrique, les niveaux accrus ont été significativement plus faible que dans les cellules témoins traitées avec de la thapsigargine, qui est un inhibiteur sélectif de la sarcoplasmique /réticulum endoplasmique Ca ^{2 + - ATPase et largement utilisé comme ER stresseur cellulaire [25], [26]. Sur les autres mains, IRE1, qui est un capteur de stress du RE et situé à l'amont de CHOP, était légèrement régulé à la hausse par tenovin-6 traitement dans toutes les lignées cellulaires, mais pas PERK phosphorylée et ATF6. [27], [28]. Il semblait peu probable que tenovin-6 a causé un stress ER conduisant à DR5 induction dans nos cellules de cancer gastrique.}

Effet antitumoral de tenovin-6 en combinaison avec des agents chimiothérapeutiques

Enfin, nous avons examiné si tenovin- 6 a amélioré les effets antitumoraux d'agents chimiothérapeutiques, y compris le docétaxel, le SN-38, le cisplatine et le 5-FU, dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Quatre lignées cellulaires avec poids TP53
(MKN-45, NUGC-4), mt (NUGC-3) de TP53, et null (KatoIII)
TP53 ont été traités avec ces seuls ou en combinaison avec deux doses (2 et 5 um) de 6-tenovin agents. Les concentrations étaient de 0,25 nM de docétaxel, de 1 nM de SN-38, 0,5 ou 1 pM de cisplatine et 0,25 pM de 5-FU. Comme on le voit dans le tableau 1 (et à la figure S2), le docétaxel et le SN-38 a montré une légère à modérée effet synergique sur tenovin-6 traitement dans trois lignées cellulaires, et le cisplatine avec tenovin-6 présente un effet synergique modérée dans deux lignées cellulaires, alors que 5-FU en combinaison avec tenovin-6 ont montré un effet plus faible que les autres agents. Nous avons examiné les expressions de DR5 après l'administration de tenovin-6 avec des agents chimiothérapeutiques. DR5 up-régulation par tenovin-6 a été améliorée grâce à une combinaison de docétaxel en MKN-45 cellules (Figure S3).

Discussion

Nous avons démontré que tenovin-6 a montré une activité antitumorale puissante accompagnée de la mort cellulaire apoptotique dans les cellules cancéreuses gastriques humaines poids TP53
ainsi que ceux avec mt TP53
. Plusieurs inhibiteurs spécifiques de sirtuines, tels que sirtinol, la suramine, salermide et thiobarbiturates, ont été rapportés pour inhiber la croissance des cellules dans différents types de cancer [29]. La plupart des chercheurs ont décrit les effets antitumoraux des inhibiteurs de sirtuines dans des lignées cellulaires avec wt TP53
[15], [29] - [31], et ceux-ci ont attribué à l'activation de l'apoptose par acétylation de p53. Pendant ce temps, plusieurs rapports ont été publiés ces dernières années qui ont montré les activités antitumorales des inhibiteurs de sirtuines dans des lignées cellulaires avec mt TP53
par des voies p53-indépendante [17], [18]. Nous avons montré que DR5 effet de choc a atténué les effets antitumoraux de tenovin-6 TP53
cellules cancéreuses gastriques -null. L'activation de la voie de signalisation du récepteur de mort par l'intermédiaire d'une régulation de DR5 joue un rôle central dans la mort cellulaire induite par tenovin-6, comme mentionné dans d'autres rapports sur les inhibiteurs de sirtuines.

Il a été rapporté que salermide améliorée expression DR5 et l'apoptose induite dans les cellules de cancer du poumon non à petites cellules humaines portant mt TP53
[17]. Dans ce rapport, le silençage simultané de SIRT1
et SIRT2
ainsi que salermide régulés à la hausse DR5, accompagné de la régulation positive des protéines liées au stress ER, comme ATF4 et CHOP. Ces résultats suggèrent que le stress du RE a été impliqué dans cette induction DR5. Nous avons spéculé que tenovin-6 a également conduit à une augmentation de l'expression DR5 via l'activation de stress du RE médiée par PERK, IRE1, ATF6 et CHOP. Cependant, contrairement aux attentes, la voie de signalisation du stress du RE activé par tenovin-6 n'a pas été évidemment détectée. Néanmoins, il y avait des preuves claires que DR5 a été induite par tenovin-6. Il existe d'autres voies de CHOP médiée par DR5 régulation à la hausse: les espèces réactives de l'oxygène (ROS), le _{kinase 2-terminal (JNK) de c-Jun NH, la voie de la protéine kinase activée par le mitogène p38, et ainsi de suite [ ,,,0],32] - [38]. Cependant, nous n'avons pas examiné ces voies ici parce que nous ne pouvions pas identifier l'activation de CHOP dans notre étude. Nos résultats suggèrent que d'autres voies p53 et CHOP-indépendants participent à DR5 expression induite par tenovin-6 dans des cellules de cancer gastrique.}

Nous avons démontré que tenovin-6 induit la mort cellulaire apoptotique par l'activation de la voie DR5. Cependant, p53 et CHOP voies semblaient peu susceptibles d'être impliqués dans cette induction DR5, et le mécanisme de DR5 la régulation reste incertaine. Nous avons, récemment, a examiné les effets antitumoraux de tenovin-6 dans plusieurs lignées de cellules de cancer du côlon, et a trouvé son activité antitumorale puissante contre la plupart d'entre eux avec une régulation de DR5 ainsi [39]. Cependant, dans les cellules CaCo2 de cancer du côlon (mt TP53
), la mort cellulaire apoptotique par tenovin-6 était moins évidente et l'expression DR5 n'a pas été fortement régulée à la hausse. cellules CaCo2 ont été rapportés pour exprimer un niveau élevé de protéines de choc thermique connu en tant que suppresseur de DR5 [40] - [43]. Cette relation devrait être étudiée plus à l'avenir. SIRT1 peut désacétyler histone H4 lysine 16 (H4K16) ainsi que H3K9, H3K14 et H1K26, qui sont étroitement liés au silençage génique [11]. En outre, il présente de nombreux substrats correspondants non histones: facteurs de transcription, des éléments de la machinerie de réparation d'ADN, des récepteurs nucléaires, des enzymes de modification des histones et des molécules de signalisation cellulaire, comme il est décrit par ailleurs [11] - [13]. Ces associations nombreuses et complexes de l'activité SIRT1 sont impliqués dans diverses fonctions biologiques, telles que la régulation de l'expression des gènes et l'ADN de réparation des dommages. Les cellules cancéreuses ont tendance à exiger ces fonctions de SIRT1 pour survivre, proliférer, et réparer les dommages génomique catastrophique. Des études récentes ont identifié la capacité de tenovin-6 pour induire la différenciation et inhiber l'autophagie dans le cadre de ses effets anti-néoplasiques dans les cellules leucémiques [44], [45]. Cela peut dépendre du comportement des cellules cancéreuses comment tenovin-6 affecte l'activité néoplasique. D'autres études sont nécessaires pour clarifier le lien entre la voie de la mort tenovin-6-médiation et les rôles complexes de SIRT1.

Nous avons examiné les effets de la combinaison docétaxel, SN-38, le cisplatine et le 5-FU avec tenovin -6 parce qu'ils ont été largement utilisés pour le traitement des patients atteints d'un cancer gastrique avancé [46], [47]. Légère à modérée des effets synergiques du docétaxel et du SN-38 avec tenovin-6 dans les lignées cellulaires de cancer gastrique, quelle que soit TP53 de statut, ont été trouvés.

Bien que les traitements impliquant des combinaisons de docétaxel et sirtuines les inhibiteurs n'a été rapportée, des combinaisons de docetaxel et d'autres inhibiteurs de HDAC, tels que la trichostatine A et acide subéroylanilide hydroxamique (SAHA) ont été rapportés comme ayant des effets synergiques associées à l'activation des caspases ou tubuline acétylation dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses [48] - [50] . Dans notre étude, on ne sait pas si l'acétylation tubuline par tenovin-6 toujours affecté l'effet antitumoral, parce que l'acétylation tubuline a été montré que dans une seule lignée cellulaire. SN-38 (la forme active de l'irinotécan) est un ADN topoisomérase I inhibiteur qui agit seulement pendant la phase S et interfère avec la réplication de l'ADN et la division cellulaire [51], [52]. Les inhibiteurs de HDAC induisent acétylation des histones et desserrer la structure de la chromatine, de sorte que l'inhibiteur de la topoisomérase peut plus facilement accéder à l'ADN, ce qui facilite les dommages de l'ADN [51], [53]. En outre, une augmentation remarquable de la production de ROS a été rapportée dans des cellules de cancer du poumon à petites cellules lors d'une exposition simultanée à SAHA et le topotécan (un dérivé de la camptothécine) [51]. L'activité accrue du traitement associant tenovin-6 et le SN-38 pourraient être attribuables à une régulation coopérative de la réponse aux dommages de l'ADN.

L'avantage de la thérapie combinée avec tenovin-6 et le cisplatine ou le 5-FU était inférieure à celle avec les autres agents dans les cellules cancéreuses gastriques, bien que plusieurs rapports ont démontré l'amélioration de l'apoptose par le traitement combiné avec le cisplatine ou le 5-FU et d'autres inhibiteurs de HDAC dans d'autres tumeurs [54] - [57].

en ce qui concerne la évaluation de la toxicité des tenovin-6, on a utilisé une lignée cellulaire de fibroblastes que les cellules non tumorigènes alternatives pour prédire la toxicité contre des cellules normales se référant aux rapports antérieurs [15], [18]. Il était difficile de trouver un contrôle normal approprié pour des études comparatives, et est donc définitivement nécessaire pour étudier la toxicité des tenovin-6 (en combinaison avec des médicaments anti-cancer) in vivo
, en utilisant des modèles de xénogreffe animale.

En conclusion, un inhibiteur de sirtuines, tenovin-6, a montré un effet antitumoral robuste contre les cellules cancéreuses gastriques humaines. Ce fut indépendant de TP53
statut et a été induite par l'intermédiaire d'une régulation de DR5. Une étude plus poussée est nécessaire pour clarifier le mécanisme par lequel tenovin-6 régule l'expression DR5. Tenovin-6 combiné avec le docétaxel et le SN-38 avait un petit avantage pour l'inhibition de la prolifération gastrique des cellules cancéreuses, ce qui pourrait fournir une nouvelle stratégie pour le traitement du cancer gastrique avancé.

Informations complémentaires
Figure S1.
Intensité relative de l'expression de protéines représentée sur la figure 3A. Semi-quantification de blot densitométrie normalisation occidentale impliquée à la ß-actine niveaux
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102831.s001
(TIF)
Figure S2. effets
cytotoxiques de médicaments chimiothérapeutiques en combinaison avec tenovin-6. effets cytotoxiques des agents chimiothérapeutiques, y compris le docétaxel, le SN-38, le cisplatine et le 5-FU, et leur mise en valeur des effets de tenovin-6 dans des cellules de cancer de l'estomac avec des cellules de cancer gastrique. Les cellules ont été cultivées pendant 72 heures avec les concentrations de tenovin-6 et des médicaments chimiothérapeutiques indiqués. A: Le docétaxel (0,25 nM), B: SN-38 (1 nM), C: cisplatine (1 ou 0,5 uM; NUGC-3 a été traitée avec 0,5 uM de cisplatine), et D: 5-FU (0,25 M) ont été donnés en combinaison avec tenovin-6. La signification statistique des différences entre les groupes a été évaluée en utilisant le test de Dunnett. * p
< 0,01; ** p
< 0,05. DOC: docétaxel, CDDP:. Cisplatine
doi: 10.1371 /journal.pone.0102831.s002
(TIF)
Figure S3.
expressions DR5 après l'administration de tenovin-6 avec le docétaxel ou le SN-38 dans les cellules de cancer gastrique (MKN-45 et KatoIII). Le docétaxel, le SN-38 et tenovin-6 a été administré à une concentration de 0,25 nM, 1 nM et 2 uM. Semi-quantification de densitométrie blot normalisation impliqués Western à ß-actine niveaux. DOC:. Docetaxel
doi: 10.1371 /journal.pone.0102831.s003
(TIF)

• PLOS ONE: Snail réglementés miR-375 inhibe la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique par ciblage JAK2
• PLOS ONE: Un Gastroduodenostomy Delta-forme modifiée en Totally laparoscopique Distal gastrectomie pour cancer gastrique: une technique sûre et réalisable