PLoS ONE: normalne fibroblaste Izazvati E-kadherina gubitak i povećanje limfnog čvora metastaze u rak želuca

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Tumor se smatra heterogeni kompleks u trodimenzionalnom okruženju koje je u istoj razini s patofiziološkim i biomehaničkih signala. Staničnog stromi interakcije vode razvoj i stvaranje tumora. Ovdje ćemo procijeniti doprinos normalnih fibroblasta do raka želuca. Pregled

Metodologija /glavne nalaze

coculturing normalne fibroblaste u jednoslojnih BGC-823 želučane stanice raka, tumorske stanice sporadično razvijena kratka, vreteno nalik na morfološke karakteristike i pokazala pojačanu proliferaciju i invazivni potencijal. Nadalje, transformirane stanice tumora pokazale smanjen nastajanje tumora i povećana lymphomatic i crijevne metastaziranja. Non-transformirane BGC-823 stanice, za razliku od, pokazalo formiranje primarnog tumora i odloženo crijeva i limfni čvor invazije. Također smo uočili gubitak E-kadherina i reguliranje prema vimentin izražavanja u transformiranim stanicama tumora, koji je sugerirao da je povećanje metastaza je inducirana epitela-na-mczcnhimnog tranzicije. pregled

Zaključak pregled

Kolektivno naši podaci pokazuju da normalni fibroblasti dovoljno inducira epitela za mezenhimalnih prijelaz u stanicama raka, što dovodi do metastaze pregled

Izvor. Xu W, X Hu, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et al. (2014) normalne fibroblaste Izazvati E-kadherina gubitak i povećanje limfnog čvora metastaze u rak želuca. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10,1371 /journal.pone.0097306 pregled

Urednik: Elad Katz, AMS Biotechnology, Velika Britanija pregled

Primljeno: 10. prosinca 2013. godine; Prihvaćeno: 16. travnja 2014; Objavljeno: 20. svibanj 2014 pregled

Copyright: © 2014 Xu i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo istraživanje je podržan od strane potpore iz Nacionalnog zdravstvenog Key posebnog fonda (http://program.most.gov.cn; No.200802112), Nacionalnog odbora za znanost fonda (http://www.nsfc.gov.cn, općenito projekta: .81372302 No.81272120), zdravstveno Odjel fond (http://program.most.gov.cn, No.2007A093) je ključni projekt provinciji Zhejiang (http://www.zjkjt.gov.cn; br 2013C030445 2009C030125). Prirodni fond Znanost provinciji Zhejiang (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 i Z2080514), te tradicionalne kineske medicine zavoda fonda (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Metastaze su odgovorni za do 90% smrtnosti povezane s rakom. Mnogi pacijenti koji pokazuju da nema dokaza o metastazama na početne dijagnoze na kraju će razviti metastaze. Iako metastaze uzrokuju najviše smrti od raka, taj proces i dalje jedan od najzagonetnijih aspekata bolesti. Pregled

Metastatski tumorske stanice ulaze tkivo preko izljeva. Tkivo je, međutim, prolazi kroz nejasne procese kojima se stanice uključene u matricu tkiva i dolaze u neposredan dodir s stanice strome, od kojih su većina normalnih fibroblasta. Tumorske stanice imaju svaku priliku da dođe u kontakt s stanice strome, uključujući i maligne i metastatskih stanica [1]. To dovodi do recipročnog interferencija s normalnim fibroblasta u tkivu.

Fibroblasti su najrasprostranjeniji stanice strome, a oni stimuliraju mikro i poslužiti kao bogat izvor za parakrini puta tijekom tumorigenezi i napredovanje. Učinci normalne fibroblaste na tumorske stanice su sporne. On je izvijestio da su normalni fibroblasti potiskuju malignu pretvorbu besmrtnim epitela prostate [2], dok je u tumorima dojke, a fibroblasti transformirati duktalni karcinom u invazivni karcinom. [3] pregled

Ovo je neslaganje ukazuje na to da je utjecaj fibroblasta na tumorskim stanicama je drugačiji nego za CAFs (raka povezane fibroblasti). Za ovu studiju, cocultured smo tumorske stanice sa normalnim fibroblastima u petrijevke da bi se oponašala kako tumorske stanice kontakt fibroblaste. Usredotočili smo se na doprinosu normalnih fibroblasta do raka želuca. uzgojene smo normalne fibroblaste u obliku guste monoslojeva na koja su diseminirani tumorskim stanicama da bi se oponašala metastatskih tumorskih stanica. Mi smo pretpostavili da je visok omjer fibroblasta do tumorskih stanica može oponašati tkiva u kojima borave metastazirao tumorske stanice. Dakle, korišteni su kožni fibroblasti iz zdravih osoba kako bi se proizveo stanično okruženje. Želučana stanična linija karcinoma, BGC-823, ovdje se koristi jer je morfološki razlikuju od fibroblasta. Pregled

dobiveni su materijali i postupci

Etički Izjava pregled

Primarne ljudske kožna tkiva od djece koja su obrezani nakon primitka pismene suglasnosti od njihovih staratelja, koji je uključen u njihove medicinske dokumentacije. Ovaj eksperiment je pregledan i odobren od strane institucionalni pregled odbor Drugog SRODNE bolnice Zhejiang University School of Medicine (etičkog nadzora kod: Research 2013-047). Pacijenti uključeni u ovu studiju su dobili primjerak pisanog informiranog pristanka i dao dozvolu za objavljivanje. Pregled

Svi pokusi su provedeni u skladu sa Smjernicama za skrb i korištenje laboratorijskih životinja vijeća za znanost i tehnologiju Kine. Protokol istraživanja je odobren od strane njega i uporaba odbora Sveučilišta Zhejiang životinja. Pregled

Reagensi i Antitijela pregled

penicilin G /streptomicin, fosfat puferom (PBS), Triton X-100, goveđi serum albumin, tip kolagenaze sam i tripsina su kupljeni od JiNuo (Kina). DMEM visoke glukoze je dobiven od Gibco (Kina), te fetalnog goveđeg seruma (FBS) nabavljen od Gibco (SA). Cisplatin, 5-fluorouracil, puromicin, vrsta i kolagena I nabavljeni su od Sigma (USA). Cisplatin se otopi u dimetilformamidu (DMF), 5-fluorouracil u DMSO i puromicin u PBS kako bi se matične otopine koje su pohranjene na -20 ° C. kolagen tipa I (5 mg /mL), razrijedi se na 1 mg /ml. DAPI (4,6 diamidino-2-fenilindol HCI) u PBS-u koji je dobiven od Roche, i anti-mišjim IgG i zečja, sekundarno antitijelo-TIRTC i sekundarna antitijela su dobiveni iz ZSGB-proton (Kina). Antihumanog-E-kadherina kunića (ab40772) antihumanog-vimentin kunića (ab92547) i antihumanog-β-katenina zečja antitijela (ab9274) dobivene su od Abcam (UK). Antihumanog-pan-CK mišjih antitijela (C11) i N-kadherina zečje antitijelo (C4061) dobiveni su od tvrtke Cell Signaling Technology (Kina) i anti humani-β-aktin i sekundarni kozjim protukunićjim antitijela su dobiveni iz Boster (Kina) , Antitijela su razrijeđena s 5% FBS na radne koncentracije, osim ako nije drugačije navedeno. Pregled

Stanična kultura pregled

uspostavljena stanična linija, ljudskog karcinoma želuca BGC-823 stanice korištene u našem eksperimentu su nabavljeni iz stanične banke Guangzhou Instituta biomedicine i zdravstva. Stanice su otopljene i pasaža 4-5 puta, a zatim su korišteni u eksperimentima ko-kulture. Primarni kožni fibroblasti dobiveni su iz kirurških uzoraka djece koji su bili podvrgnuti obrezivanje i pruža informirani pristanak. Fibroblasti su korišteni nakon trećeg prijenosa (unutar 50 prolaza) uzgojene u DMEM High-glukoze koji sadrži 10% FBS, te održavane u vlažnom inkubatoru (5% CO _{2) na 37 ° C. Medij stanične je zamijenjen svaki drugi dan. Pregled}

Za generaciju TBGCs, a fibroblasti (FBS) i BGC-823 stanice su cocultured u omjeru 10:1 za dodatnih 10 dana nakon kultiviranih stanica postignut ušće. Formiranje Dome zabilježeno je u sustavu ko-kulture. Stanična smjesa je zatim propušten tripsinizacijom svježim fibroblasta (1 × 10 ^{6 stanica /mL). Tijekom drugog i narednih odlomaka, očito nastajanje doom i suspendiranih okruglog oblika stanice pojavilo koji pokazuju različite morfološke značajke i dugotrajnu vezanost nakon prolaza. Nakon petog prolaza mješovitih suspendiranih stanica i gustim normalnih fibroblasta, uniformi, kratkih, vretena, kao što su stanice nazvane "TBGCs" su proizvedeni i nisu pokazali morfološke vraćanje na BGC-823 stanica do >. 10-15 prolaza pregled}

proliferacije pregled

Eksponencijalno rastuće stanice su nasađene na ploče s 96 jažica još 6 dana inkubacije na 37 ° C u vlažnoj 5% CO _{2 atmosfere. Proliferacija stanica izmjerena je u četverostruko svaki dan s pipetom 20 ul Celltiter 96 vodena Solution reagens (Promega, USA), u svaku jažicu koja je sadržavala DMEM 100 uL visoke glukoze i zatim stanice su inkubirane još 2 sata prije određivanja relativne apsorbancije pri 490 nm pomoću čitača mikrotitarske ploče. pregled}

Drug Test inhibicije pregled

pet ponavljanja eksponencijalno rastuće stanice su nasađene u posudu s 96 jažica i inkubirane 24 sata. Nakon 24 sata, medij je zamijenjen s različitim koncentracijama lijekova (0-80 uM) i kultivirane tijekom dodatna 24 sata. toksičnost lijeka, procijenjena je mjerenjem broja živih stanica korištenjem proliferaciju analizu opisanu gore. pregled

grebanje Test pregled

Stanice su nasađene na 24-jažične ploče (5 x 10 ^{4 stanica /i) i do konfluentnosti. Pipeta savjeta su korišteni za stvaranje ogrebotina. PBS je korišten kako bi se odstranio talog, te zamijenjen FBS-mediju. Slike su dobiveni tijekom 3 uzastopna dana. Širina temelja mjerena je pomoću ImageJ 1,47 softver za Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) i prikažu kao ogrebotina udaljenosti po danu. Pregled}

Migracija i Test invazije

testiranje pokretljivost stanica izvedena je pomoću Transwell® umetke (8 um veličina pora) (Corning, USA). Stanice-GFP (zeleni fluorescentni protein) (1 × 10 ^{5/500 mL) se suspendira u FBS-mediju i postavljeni iznad umetaka u tri primjerka u 800 uL medija za kulturu umetnut ispod. Nakon inkubacije preko noći, umetci se isperu 3 puta sa PBS-om i obrisati navlaži vatom gore, gdje su fiksirane s 4% PFA u nastavku i promatraju pomoću fluorescentnog mikroskopa (Olympus, Japan). Isti postupak je korišten za izvođenje testa invazije, ali su se umetci koji su prethodno obložene sa Matrigel (BD, USA). Obje analize su kvantificirane kako broju stanica broji 5 slučajnih polja (povećanje 200 puta). Pregled}

Test apoptoze pregled

Apoptotičke stanice izmjerene su primjenom aneksin V-FITC otkrivanje apoptoza kit (Keygen, Kina) u skladu s uputama proizvođača. Stanice su ili netretirane ili tretirane lijekovima za 24 sata, a zatim sakupljene, dva puta isprane s PBS-om, ponovno suspendirane u veznom puferu koji sadrži 5 ul FITC-aneksin V i 5 ul PE, i inkubira na sobnoj temperaturi tijekom 30 minuta. Analiza je provedena protočnom citometrijom (Becton Dickinson FACSCalibur, SAD). Pregled

kvantitativni PCR u realnom vremenu pregled

Ekstrakti jezgre su pripravljeni uporabom RNeasy mini kompleta prema uputama proizvođača. Uzorci Pročišćeni RNA (1 ug) u DEPC vode s reverznom prepisana pomoću PrimeScript II 1. Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Kina). RT-PCR amplifikacija i dobije se pomoću SYBR Premiks Ex Taq II kita (Takara). Pregled

reakcijski sustav 20 ul koji sadrži 1 ul razrijeđenih uzoraka cDNA, 10 ul SYBR mješavina na Ex Taq II (2 ×), 0.4 ul ROX Referentni Dye (50 ×), 7 jal sterilne dvostruko destilirana H _{2O, a jedan ul naprijed i natrag početnice (vidi Materijali i metode S1) bili su pripremljeni i vrednovati pomoću analize krivulje taljenja i komparativna prag ciklusa (CT) metoda. primijeniti slijedeći uvjeti biciklističke su: 95 ° C tijekom 10 minuta, a zatim 40 ciklusa od 95 ° C u trajanju od 15 sekundi i 58 ° C tijekom 1 minute. GAPDH se koristi kao kontrolni gen. Pregled}

Western blot analiza pregled

Proteini su ekstrahirani iz eksponencijalnog rasta stanica i primarnih tkiva. Ekstrakti se kuha u puferu za punjenje, razdvojeni su na 10% Tris-HCl SDS-poliakrilamidnim gelovima i preneseni na nitroceluloznue membrane (Millipore, USA) primjenom standardnih postupaka. Membrane su blokirane pomoću 5% nemasnog mlijeka u Tris-puferiranoj slanoj otopini s Tween-20 (TBST) kroz 30 minuta na sobnoj temperaturi. Membrane su isprane s TBST i inkubiraju preko noći na 4 ° C s primarnim antitijelima protiv E-kadherina (1:5000), vimentin (1:5000), β-katenina (1:5000), N-kadherin (1:1000) i β-aktin (1:1000). Nakon ispiranja 3 × s TBST, doda se sekundarni anti-zečje (1:1000), te inkubirati 2 sata na sobnoj temperaturi. Konačno, Imunološki kompleksi su vizualizirani pomoću kemiluminiscencije ECL (elektro kemijska luminiscencija) (Millipore). Koncentracija proteina je bila normalizirana na p-aktin. Pregled

histološke i imunohistokemijske analize pregled

Uzorci su brzo smrznuti u tekućem dušiku, pohranjene na -80 ° C, fiksirane u 4% PFA i reže na debljinu od 10 um (Leica, Njemačka). pregled

hematoksilinom i eozinom (HE) bojanja deparafmizirani stakalca su obojena hematoksilinom tijekom 15 minuta, ispere se 3 puta sa PBS-om, kiselina alkohol 5 sekundi, a zatim eozinom za 5 minuta (Boster, Kina). pregled

imunohistokemijsko bojanje, stakalca su rehidratirani i toplinski induciranih epitop dohvat je provedena u citratnom puferu uz korištenje loncu (20 minuta pri 80 pKa), blokirani sa 3 % H _{2O 2 za 15 minuta, a zatim se normalni kozji serum je primijenjeno (30 minuta na sobnoj temperaturi). Rezovi su inkubirani u sljedećim primarnim antitijelima: anti-E-kadherin (1:250), anti-vimentin (1:250), anti-β-katenina (1:250) i anti-pan-CK (1:250 ). Uzorci su inkubirani preko noći na 4 ° C, isprane dva puta s PBS, i inkubirane sa sekundarnim antitijelom tijekom 2 sata na 37 ° C. DAB Plus kromogena kit (Boster) korišten je za otkrivanje svih antigena. Snimci su prebrojane s hematoksilinom i dehidrirane, a montiran s pokrovnim koriste neutralni balata. Obje analize su zasebno obavljaju patologa i kliničarima koji su bili slijepi na grupe uzoraka. Sporovi su riješeni konsenzusom. Pregled}

imunofluorescencije konfokalne mikroskopije pregled

Ćelije su bile stavljene na komornim slajdova, a zamrznute sekcije su fiksirane s 4% PFA i natopljeni s 0,5% Triton X-100. Stakalca se blokiraju s normalnim kozjim serumom tijekom 1 sata na 37 ° C, isprane i inkubirane preko noći s primarnim antitijelima na 4 ° C, zatim su prenesene u i inkubirane s kozjim anti-mišjim i anti-zec-TIRTC antitijela tijekom 1 sata na 37 ° C po mraku. Stakalca se ispiru pomoću glicerin i montiran poklopcima. Jezgre su prebrojane s DAPI. Fluorescencija se detektira pomoću konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Olympus). U deparafmizirane Kriosekcije su obojeni DAPI i analizirani pomoću imunofluorescentni mikroskopa. Pregled

Životinjski model pregled

Osamdeset četiri tjedna stare ženke BALB /c miševi su kupljeni od Animal Research Center u Šangaju i održava na pokusnoj životinji centru Zhejiang akademije medicinskih znanosti. Prema Smjernicama za skrb i korištenje laboratorijskih životinja vijeća za znanost i tehnologiju Kine, sve su životinje držane pod aseptičkim sterilnim uvjetima te daju autoclaved hrane i vode u skladu s načelima čuvanja laboratorijskih životinja Sveučilišta Zhejiang. Četrdeset i četiri miševi su korišteni u potkožnom modelu, te su ravnomjerno rasporediti u kontrolnih i eksperimentalnih skupina. BGC-GFPs su korišteni kao kontrole gdje su TBGC-GFPs su uporaba kao eksperiment. Tumorske stanice su sakupljene u fazi rasta, i suspendira u FBS-free medija (1 × 10 ^{6 stanica /mL). Stanice su pipetirani na Suspenzije pojedinačnih stanica, a svaka je 500 uL otopine subkutano inokuliraju obje strane prsa. Miševi su eutanazirani svaka 2 tjedna do 10 tjedana, a izvedeni su patološki preglede. Svi miševi su izvagani svaka 3 dana. Sve su operacije izvedene u 1% natrij pentobarbitalom, a učinjeni su svi napori kako bi se smanjili patnju. Pregled}

Trideset šest miševi su korišteni u vene ubrizgavanja skupine za procjenu distribucije raka (18 miševa u BGC-GFP kontrolnoj skupini i 18 miševa u TBGC-GFP eksperimentalnoj grupi). 500 ul suspenzije stanica (5 x 10 ^{5 stanice) se ubrizgava u venu repa miševa. Miševi su eutanazirani na 2 nd, 5 th, 8 og i 10 og tjedna za patološkog pregleda. Pregled}

Statistička analiza pregled

Eksperimentalni podaci su prikupljeni i ušao u tablice. Normalnosti Ispitivanja su provedena prije nego usporedbom podataka. Usporedbe između skupina su provedena pomoću Student t
test. Jednosmjerna analiza varijance se upotrebljava za usporedbu > 3 skupine, a Tukey metoda se koristi za post hoc
usporedbe skupina. U ovom istraživanju, p izvoznici < 0,05 smatra se statistički značajnom. SPSS 20.0 for Windows (IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) se koristi za obavljanje svih statističkih analiza. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) se koristi za generiranje svih grafičkih prezentacija pregled

Rezultati pregled <. h3> 1. Morfološke promjene u BGC-823 stanicama mimick Stanice strome

fibroblaste (FBS) i BGC-823 stanice su cocultured u omjeru 10:1 za dodatnih 10 dana nakon kultiviranih stanica postignut ušće. Stanična smjesa je zatim propušten tripsinizacijom sa svježim fibroblasta (1 × 10 ^{6 stanica /mL) (Slika 1.1). Formiranje Dome u BGC-823 stanica uočeno je nakon prvog prolaza. Tijekom drugog i narednih odlomaka, suspendiran okruglog oblika stanice se pojavila u kulturan sustava: neki zbrajaju u klastere ili razredi te su labavo spojeni na površini fibroblaste. Paralelni-kulturan BGC-823 stanicama pokazali samo nekoliko stanica okruglog oblika na bazi kada je kultura postala pretrpane. Mješovite suspendiran stanice pokazivale različite morfološke značajke i dugotrajno vezanost nakon prolaza. Te stanice su pokazali bilo je kaldrmi nalik izgledu sličan BGC-823 stanice ili kratkim vretena kao značajke. Jedinstveni, kratke, vretena, kao što su stanice u produkciji prolaz mješovitih suspendiranih stanica i gustim normalnih fibroblasta. Nasuprot tome, prolaz u supernatant BGC-823 stanicama prikazuju samo krhotine nakon 24 sati uzgoja, u kojima male količine stanica preživjeli u obliku kamenim nalik klonovima slične roditeljskih BGC-823 stanicama (Slika 1.3a-H). pregled}

Naknadno eksperimenti su provedeni kako bi se utvrdilo izvor suspendiranih stanica u cocultured sustavu. BGC-823 stanice i fibroblasti su transfektirane s GFP-puro kazete i RFP-puro kazete, odnosno, koji su nazvali BGC-GFP i FB-RFP, respektivno. Nakon coculturing, BGC-GFP prerastao u višeslojnih i formirao poput svoda strukturu. U međuvremenu, okruglog oblika ili pakugle stanice koje su suspendirane u medijima su prebačeni u kulturi ploče i označen sa zelenom fluorescencije, što pokazuje da dugoročno coculturing s fibroblasta izaziva BGC transformaciju. Okrugle i sferoid Stanice su suspendirane u mediju je opaženo pomoću zelene fluorescencije, a može se propuštane bez dodatka fibroblasta (Slika 1,2 A-D). Nakon nekoliko uzastopnih rundi coculturing, transformirane BGC-823 stanice (TBGCs) dobiveni su da se pojavio još odoru, kratko i vretena slično. Stanice su zatim propušten je bez dodatka fibroblaste. Zanimljivo je da ove stanice su više skloni da se formira sferoidne strukture od stanica koje su rasle do sjedinjenja i ne pokazuju morfološke vraćanje na BGC-823 stanice do >. 10-15 prolaza pregled

Prethodna studija je izvijestio da fibroblasti inhibiraju rast ostalih stanica kada cocultured in vitro pregled mehanizmom kontaktne inhibicije [4]. U našim pokusima, međutim, normalne fibroblaste nije kontaktirati-inhibira proliferaciju BGC-823 stanicama. Umjesto toga, FB-RFP postupno nestali s BGC-GFP proliferacije kada za kultiviranje je produžen do 10 dana. Dakle, po redu FB nosa bio je dužan prolaz i održati stabilnu proizvodnju TBGCs. Također primijetili da kad mala količina TBGCs se doda konfluentnom fibroblasta lima, tumorske stanice koje su rasle su izvan odgurne od fibroblasta. U središtu kolonije tumora, stanice su okruglog oblika, sa samo labave prilozima u bazi (slika 1.3a-H). Pregled

2. Epitela-mezenhimalne Prijelaz iz BGC-823 stanica za TBGC pregled

Real-time PCR je korištena za analizu ekspresije mRNA. Rezultati pokazuju da je ekspresija E-kadherina izvanredno je podreguliran uz upregulation vimentin u TBGCs. U međuvremenu, izrazi twist, puž, puža i N-kadherina su svi regulira prema gore (slika 1.5). Imunofluorescencija bojenje i Western blot potvrđuju gubitak E-kadherina i povećana ekspresija vimentin, N-kadherina i beta-katenina (Slika 1.4), čime se potvrđuje da je dugotrajna epitela-mezenhimalne prijelaza (EMT) pojavljuje se u TBGCs. E-kadherin je dokazana znak EMT i održava vezanje stanica-stanica u epitelu. Gubitak E-kadherina može dovesti do tumora prolijevanja više stanica se od tumorske mase. pregled

3. Proliferacija, invazija i mobilnost TBGCs

proliferacije TBGC analizirana je pomoću ispitivanja MTS. TBGCs pokazao ubrzano proliferacije ( p izvoznici < 0,01) (Slika 2.1). Protočna citometrija (vidi Materijali i metode S1) pokazuje da 13% TBGCs su zadržane u S fazi, za razliku od samo 7% od BGC-823 stanicama (Slika S1.3). Grebanje pokus pokazuje da TBGC motilitet povećana u usporedbi s roditeljskom BGC-823 stanicama (Slika 2.2-2.3A-H). TBGC anastomoze potrebno 3 dana nakon početka ogrebotina, a > bila su potrebna 4 dana za BGC-823 stanica ( p izvoznici < 0,05) (Slika 2.2) pregled

Rezultati. ispitivanja Matrigelove invazije pokazuju da TBGCs su agresivnije od BGC-823 stanicama. Ukupno, 683.67 ± 170,83 TBGCs infiltrirali u Matrigel u odnosu na 188.33 ± 58.62 BGC-823 stanica u kontrolnoj skupini ( p izvoznici < 0,01) (Slika 2.4 Slika 2.5A, B). Međutim, TBGCs pokazala značajno smanjenje migriranih stanica: 2-struko manje od BGC-823 stanica po testu Transwell® migracija ( p pregled < 0,01) (Slika 2.4 Slika 2.5C, D). Suspendirani priroda TBGCs bi moglo objasniti ovo smanjenje stopa poštivanje je samo 68,33 ± 10,41% u TBGCs na Matrigel dok 99,77% ± 6,25% u BGC-823 stanicama, pokazali sporo vezanost za Matrigel površine u TBGCs (tablica S1) . pregled

da bi se bolje oponašaju In vivo pregled ponašanje tumora, kolagen tipa i gel se koriste za utvrđivanje odnosa između fibroblasta i invazivne sposobnosti BGC-823 stanica i TBGCs. Kolagen tipa I gel je pripravljen na transjažična umetaka s fibroblasta (vidi Materijali i metode S1). Fibroblasta napunjen gelovi su kultivirane 7 dana, a zatim GFP-obilježeni kancerozne stanice su nasađene na gel i uzgajani sljedećih 7 dana. Pregled sakupljenih gelovi otkrila je da tumorske stanice su ušle u kolagen gela. Kad gelovi su učitani sa fibroblasta, TBGCs izlagao više poboljšane invazivni kapacitet od BGC-823 stanicama, kao što je navedeno od broja stanica koje se infiltrirali u gelove (Slika S1.2). Pregled

4. TBGCs Izloženi cisplatin Otpor

Zatim, procjenjuje osjetljivost TBGCs sa standardnim kemoterapijska sredstva protiv raka želuca. Živih BGC-823 stanice i TBGCs određene su 24 sata nakon izlaganja cisplatina (0, 20, 40, 60, 80 uM) mjerenjem ugradnje MTS. Rezultati pokazuju da TBGCs izlagao izuzetnu otpornost na cisplatin, dok je nekoliko BGC-823 stanice preživjela kada je koncentracija cisplatin je uzdignut na 40 uM ( p izvoznici < 0,001) (slika 3.1). Živih TBGCs i mogu se detektirati kada koncentracija cisplatin je uzdignut do 200 uM (podaci nisu prikazani). Izvršili smo stanične apoptoze analizu protočnom citometrijom za provjeru otpora cisplatinom. Rezultati pokazuju da je stopa preživljavanja TBGCs je oko 42.40% u usporedbi s 13,80% za BGC-823 stanica nakon tretmana s 40 uM cisplatinom 24 sata (slika 3.3-3.4). Međutim, kada se tretiraju sa 5-FU, nije bilo značajne razlike u inhibiciji tumora između TBGCs i BGC-823 stanice u skladu s MTS testa (Slika 3.2). Obje tumorske stanice pokazale kemijska otpornost na 5-FU (Slika 3.2). Pregled

5. TBGCs Izložbeni In vivo pregled limfnih čvorova Sklonost pregled

Da bi se odredila in vivo
distribuciju TBGCs, 5 × 10 ^{5 BGC-823 stanice ili TBGCs se injektira u vene BALB /c miševa. Dva tjedna nakon injekcije, varijance u pomoćnim i limfnih čvorova na vratu metastaze zabilježen je u obje skupine, kao što je navedeno od strane procjenu fluorescentne crtač (Slika 4.3A-F). GFP-pozitivne stanice su pronađeni u pomoćnom i Slabinski limfni čvor u obje skupine (slika 4.3A, B, D, E). Međutim, GFP-pozitivne stanice se pojavila samo u plućima miševa u BGC skupini (Slika 4.3C, F). Pregled}

5. tjedna, osim velikim invaziju u limfnim čvorovima, infiltracija organa je također promatranom. Više limfni čvor invazija zabilježeno je u TBGC skupini nego u kontrolnoj skupini BGC u svakoj vremenskoj točki (slika 4.1, Video S1). Ove limfni čvorovi su određena kao pan-CK pozitivni (Slika S2.1). Također smo uočili različite TBGC i BGC-distribuciju u organima. TBGCs bili ograničeni samo na gastrointestinalnom tkivu, dok BGCs naselili u pluća i crijeva (Slika 4.2A-H). Na tjedan 5, intestinalna metastaza najprije se promatra u 3/4 miševa koji su injicirani s TBGCs, dok je samo 25% miševa pokazala vidljivi crijevne metastaze sljedeće BGC injekcije (Slika S2.3). Pregled

tumori razvijen prosječan broj crijevnih TBGC metastaza porasla (5,6 ± 3,911 vs
3,5 ± 1,914 BGCs u 8. tjednu; 6,33 ± 1,52 vs Netlogu 5,6 ± 1.342 na tjedan 10) (Slika S4.2) , Zanimljivo je da su 3 od 5 miševa u TBGC skupini pokazali megaskopski novotvorine u gastrum nakon 10 tjedana, što nije primjećeno u BGC grupi. Megaskopski plućne metastaze su pronađeni u 3 od 4 BGC miševa u 8. tjednu Međutim, nije vidljiva TBGC plućne metastaze su zamijećene u tjednu 10 (Slika 4.2A-H). Mikroskopski pregled otkrio infiltracija TBGCs u vrata maternice i aksilarne limfne čvorove već jedan tjedan nakon repnu venu injekcijom, dok BGCs potrebno više vremena (3 tjedna) za ulazak tih limfnih čvorova (Slika 4.1). Pet tjedana nakon ubrizgavanja stanica, pluća infiltracija je uočena u BGC grupi. Međutim, bez TBGCs otkrivene su u organima do 10 tjedana nakon injekcije (slika 4.2B, F, slika S2.3). Pregled

Imunohistokemijsko bojanje ukazuje na postupno povećanje E-kadherina u limfnim čvorovima TBGC grupe , dok je ekspresija E-kadherina neznatno pala u BGC grupe ( p izvoznici < 0,01) (Slika 4.4a-p). Razlike su značajne u 8 i 10 tjedana, kada je ekspresija E-kadherina bio mnogo veći u TBGC skupine u odnosu na BGC skupine (Slika 4.5). Ekspresija P-katenina povećao se s vremenom u TBGC grupe, koji je kulminirao na 8 tjedana, a zatim malo je smanjena (Slika 4.5). Rezultati također pokazuju povećanu ekspresiju β-katenina u TBGC skupine na 5, 8 i 10 tjedana ( p izvoznici < 0,01). (Slika 4.5) pregled

6. TBGCs pokazali su slabu tumorske Formiranje ali visoko limfnog čvora metastaza kapaciteta u našem potkožnog tumorigenezi Model Netlogu

Budući da tumorske stanice imaju veću vjerojatnost da se formira neoplazme kada potkožno implantira, (GFP +) TBGCs i BGCs su implantirani ubrizgavanjem 5 × 10 ^{5 izvediv tumorske stanice u potkožnom tkivu na obje strane prsnog koša. U nastajanju tumora u BGC skupini su otkrivena najranije 3 dana nakon implantacije, a svi miševi u BGC skupine razvili tumore na mjestima ugradnje nakon 1 tjedna inkubacije (Slika 5.1A). Zapanjujuće je da su implantirani TBGCs dala nikakve nemoguće otkriti tumore do 8 tjedana (Slika 5.1, Video S2). Eskalaciju doze TBGC 5-10 × 10 6 implantirani stanice samo dovelo do formiranja malih tumornih nakupina i spor povećanje zapremine tumora uz vrijeme inkubacije. Osim toga, miševi u BGC grupe postali umrtvljeni, navodno zbog povećanog opterećenja tumora (podaci nisu prikazani). Pregled}

cijelog tijela obdukcija u svakom vremenskom intervalu pokazuju da TBGCs, umjesto vidljivih primarnih tumora, infiltrirali u susjedstvu a distalne limfni čvorovi, dok BGC-generiranih tumorske mase su ograničeni na netaknutim fibroznih kapsula kod mjesta injektiranja (Video S2). Regionalna globalna limfni čvorovi metastaze u TBGC skupine pronađeni su već 2 tjedna nakon implantacije, dok su regionalni limfni čvorovi metastaze otkrivena na 4 tjedna u BGC skupini (Slika 5.2). Kaplan-Meier analiza pokazuje da TBGCs pokazali veći rizik za razvoj u limfnih čvorova metastaze od BGCs (Slika 5.2). Pregled

Opsežna crijevnih su metastaze također vidljivo u svim miševima u TBGC skupine na 8 tjedana, a nakon toga (Slika S4.1 Slika S4.4). Prosječan broj crijevnih kvržica bila je 5,50 ± 1,73 u 8. tjednu i 7,33 ± 1,79 na tjedan 10. Za razliku od toga, samo jedan miš u BGC skupini pokazali 3 crijevne infiltracije na tjedan 9 (Slika S4.1). Pregled

GFP traganje pokazuje stvaranje lokalne tumora u BGC grupe na mjestu ubrizgavanja bez regionalnih limfnih čvorova infiltracije. Nasuprot tome, TBGCs pojavila u aksilarnih limfnih čvorova, ali zeleni fluorescentni nije detektiran u tkivima na mjestu injekcije (Slika 5.3). U tjednu 6, TBGCs-GFP nakupila u rektalne i mezenteričkih limfnih čvorova. Međutim, samo 1 miš s pozitivnim mezenterijskog limfnog čvora metastaziranje je otkriven u BGC skupini. pan-CK imunohistokemijski bojenje pokazuje da TBGCs metastazirao na regionalnim (rano) i distalnih limfnih čvorova (kasno), dok BGCs samo metastazirao na regionalne limfne čvorove (kasno) u razdoblju pokusa (Slika S4.5). TBGCs i metastazirao u crijevima na tjedan dana kad ga nisu mogli naći u BGC grupi. Pregled

On bojenje pokazuje da abnormalne stanice se pojavila u regionalnim limfnim čvorovima u ranim fazama TBGC grupi i kasne faze u BGC skupina (Slika S4.6). Imunohistokemijska analiza ekspresije proteina 2 tjedna pokazuje podreguliranje E-kadherina i beta-katenina i poboljšanu ekspresiju vimentin u TGBC-LNS u odnosu BGC-neoplazija. Ti rezultati su dalje potvrditi Western blot analizom uzoraka tkiva, koji nisu otkrivaju E-kadherina u TGBC-LNS; U međuvremenu, N-kadherina također oštro regulirani u TGBC-LNS (Slika S3.3-3.4). pregled

Imunohistokemijsko bojanje ukazuje na postupno povećanje E-kadherina u limfnim čvorovima TBGC skupine kako je vrijeme prolazilo, dok je ekspresija E-kadherina neznatno pala u BGC grupe ( p izvoznici < 0,01) (Slika 5.4).

• PLoS ONE: Prohibitin Expression Deregulacija u rak želuca je povezana s 3 'neprevedenih regiji 1630 C > T Polimorfizam i kopiranje Broj Variation
• PLoS ONE: Aktivacija mczcnhimnog matične stanice makrofagi Prompts Ljudski rak želuca rast kroz NF-kB Pathway