Plos ONE: Normalno fibroblastov izzivati ​​E-kadherina izgube in povečanje limfnih vozlov metastaz v želodca Cancer

Povzetek

Ozadje

šteje Tumor heterogen kompleks v tridimenzionalnem okolju, ki je sperite z patofizioloških in biomehanskih signalov. Cell-stromalni interakcije usmerja razvoj in nastanek tumorjev. Tukaj smo oceniti prispevke normalnih fibroblastov za raka želodca.

metodologija /glavnih ugotovitev

Z coculturing normalnih fibroblastov v plast BGC-823 želodčne rakavih celic, tumorske celice občasno razvila kratka, vreteno Tretja pot morfološke značilnosti in dokazali okrepljeno širjenje in invazivni potencial. Poleg tega so transformirane tumorske celice dokazali zmanjšal nastanek tumorjev in povečano lymphomatic in črevesno metastatskega potenciala. Non-transformirane BGC-823 celic, v nasprotju s tem pokazala, primarni nastanek tumorjev in zamudo v črevesju in bezgavk invazijo. Opazili smo tudi izgubo E-kadherina in uravnavanjem vimentina izražanja v transformiranih tumorskih celic, ki je predlagal, da je bilo povečanje metastaz jih povzroča epitelnih-do-mezenhimskega prehoda.

Zaključek

S kolektivno naši podatki kažejo, da običajne fibroblasti dovolj povzroči epitelija do mezenhimske prehod v rakavih celicah, kar vodi do metastaz

Navedba. Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et al. (2014) Normalni fibroblastov izzovite E-kadherina izgube in povečanje limfnih vozlov metastaz želodčnega raka. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10,1371 /journal.pone.0097306

Urednik: Elad Katz, AMS biotehnologija, Velika Britanija

Prejeto: 10. decembra 2013; Sprejeto: 16. april 2014; Objavljeno: 20. maj 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta raziskave je podprta s sredstvi iz državnega posebnega sklada za zdravstveno Key (http://program.most.gov.cn; No.200802112), Nacionalni odbor za znanost sklada (http://www.nsfc.gov.cn; splošno projekta št .81372302 No.81272120), ministrstvo za zdravje sklad (http://program.most.gov.cn, No.2007A093) je ključni projekt v provinci Zhejiang (http://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). Naravoslovno sklad province Zhejiang (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 in Z2080514) in tradicionalne kitajske medicine predsedstva sklada (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

metastaze so odgovorni za do 90% smrtnosti, povezane z rakom. Mnogi bolniki, ki dokažejo, da ni dokazov o metastaz na prvi diagnozi bo sčasoma razvijejo metastaze. Čeprav metastaze povzroči največ smrti zaradi raka, je ta proces še vedno ena od najbolj enigmatičnih vidikov bolezni.

metastatskega tumorske celice začne tkivo preko ekstravazacije. Tkivo pa je podvržen nejasnih postopkov, s katerimi so celice vlit v matrici tkiva in pridejo v neposredni stik s stromalnih celic, ki so večinoma normalne fibroblaste. Tumorske celice imajo vse možnosti, da pridejo v stik z stromalnih celic, vključno neoplastične in metastatskih celic [1]. To vodi do vzajemne navzkrižne pogovor z običajnimi fibroblastov v tkivu.

fibroblastov so najbolj bogate stromalni celice, in jih spodbuditi mikrookolje in služi kot bogat vir za parakrin poti med tumorigeneze in napredovanje. Učinki normalnih fibroblastov na tumorskih celic sporna. Ugotovljeno je bilo, da je normalno fibroblasti zatreti maligne pretvorbe ovekovečil epitela prostate [2], medtem ko je v tumorjih dojke so fibroblasti preoblikovati duktalni karcinom v invazivni karcinom [3].

To nesoglasje kaže, da je vpliv fibroblastov na tumorskih celicah je drugačen kot pri KGZS (rakom povezana fibroblasti). V tej študiji smo cocultured tumorske celice z običajnimi fibroblastov v petrijevke, da posnemajo, kako tumorskih celic stik fibroblaste. Osredotočili smo se na prispevek normalnih fibroblastov raka želodca. gojimo smo normalne fibroblaste, da se tvori gosto monoslojev, ki so jih nato razširijo s tumorskimi celicami, da posnemajo metastaznih tumorskih celic. Domnevali smo, da bi lahko visoko razmerje med fibroblastov v tumorske celice posnemajo tkiva, kjer metastaziral tumorske celice prebivajo. Tako smo uporabili dermalna fibroblasti zdravih posameznikov, da dobimo celično okolje. Želodca raka celična linija, BGC-823, je bila tu uporabljena, ker je morfološko razlikuje od fibroblastov.

Materiali in metode

Etični kodeks

Primary človeških kožnih tkiv so bili pridobljeni od otrok, ki so doživeli obrezovanje po pridobitvi pisno privolitev iz njihovih skrbnikov, ki je bil vključen v svojih zdravstvenih kartotek. Ta poskus je bil pregledan in institucionalnega pregleda krovu drugega odvisnimi bolnišnica Zhejiang University School of Medicine je odobril (etični kodeks pregled: raziskave 2013-047). Bolniki v tej študiji so bili opremljeni s kopijo pisnega soglasja, in je dal dovoljenje za objavo.

Vsi eksperimenti so bili izvedeni v skladu s smernicami za nego in laboratorijskih živalih Sveta za znanost in tehnologijo Kitajske. Protokol študije je odobril odbor za živali oskrbe in uporabe Zhejiang University.

Reagenti in Protitelesa

Penicilin G /streptomicin,-fosfatni pufer s soljo (PBS), Triton X-100, goveje serum albumin, tip kolagenaze I, in tripsina smo nabavili pri JiNuo (Kitajska). DMEM High-glukoza je bila pridobljena iz Gipco (Kitajska) in fetalni goveji serum (FBS) je bila kupljena od Gipco (SA). Cisplatina, 5-fluorouracil, puromicin, in vrsta kolagen mi smo nabavili pri Sigma (ZDA). Cisplatin raztopimo v dimetilformamidu (DMF), 5-fluorouracil v DMSO, in puromicin v PBS, da bi fotografije rešitve, ki so nato shranjene pri -20 ° C. Tip kolagen I (5 mg /ml) smo razredčili na 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole · HCl) v PBS je bila pridobljena iz Roche in kozje anti-mouse in zajec IgG, sekundarna protitelesa, TIRTC in sekundarnih protiteles so bili pridobljeni iz ZSGB-Bio (Kitajska). Antihumani-E-kadherina zajec (ab40772), antihumani-vimentin zajec (ab92547), in zajec protitelesa antihumani-β-catenin (ab9274) so ​​bili pridobljeni iz Abcam (UK). Antihumani-pan-CK protitelesa miške (C11) in N-kadherina zajec protiteles (C4061) so bili pridobljeni iz signalizacijo med celicami Technology (Kitajska) in anti človeško-β-aktina in sekundarni koze anti-zajec protitelesa so bili pridobljeni iz Boster (Kitajska) . Protitelesa razredčimo s 5% FBS, da delajo koncentracije, razen če ni drugače navedeno.

Cell Culture

ustanovljena celična linija, rakave človek želodca celice BGC-823, ki se uporabljajo v našem poskusu so bile kupljene iz celične banke Guangzhou inštituta v zvezi z biomedicino in zdravje. Celice odtajamo in pasaže za 4-5-krat, nato pa so bili uporabljeni pri poskusih na co-kulture. Primarni kožni fibroblasti so bili pridobljeni iz kirurške osebkov otrok, ki so opravili obrezovanje in predvidenih soglasja. Fibroblasti so bili uporabljeni po tretjem prehoda (v 50 prehodov), kultiviranim v DMEM visoko glukozo, ki vsebuje 10% FBS in vzdrževati v navlaženem inkubatorju (5% CO _{2) pri 37 ° C. Medij celica je bila zamenjana vsak drugi dan.}

Za generacije TBGCs se fibroblasti (FBS) in BGC-823 celice cocultured v razmerju 10:1 za dodatnih 10 dni po kultiviranih celic dosegla sotočje. Dome oblikovanje opazili v sistemu co-kulture. Zmes celice smo nato vnesejo z trypsinization sveže fibroblastov (1 x 10 ^{6 celic /ml). V drugem in nadaljnjih prehodov, očitno tvorbo doom in suspendiranih celic okrogle oblike so se pojavile, ki razstavljene različne morfološke značilnosti in dolgotrajno prilogo po prehodu. Po petem prehod mešanih suspendiranih celic in gosto normalnih fibroblastov, enotna, kratke, vretena podobnih celic, tako imenovanimi "TBGCs" so bile izdelane in niso dokazali morfološko vrnitvi v BGC-823 celic do >. 10-15 prehodov}

Proliferation Vsebnost

eksponentni bile rastoče celice zasejali v 96 vdolbinami za dodatnih 6 dneh inkubacije pri 37 ° C v navlaženi 5% CO _{2 atmosferi. Celično proliferacijo bila izmerjena ponovljen petkrat vsak dan s pipeto 20 ul CellTiter 96 Vodno One raztopino reagenta (Promega, ZDA) v vsako vdolbino, ki je vsebovala 100 ml visoko glukozni DMEM, potem smo celice inkubirali še 2 uri, preden določanje relativne absorbance pri 490 nm z bralnikom mikrotitrski plošči.}

drog zavira Vsebnost

Pet podvajanja eksponentno rastoče celice smo zasejali čez 96 vdolbinami in inkubirali 24 ur. Po 24 urah smo gojišče zamenjali z različnimi koncentracijami zdravil (0-80 um) in gojimo še dodatnih 24 ur. toksičnosti drog smo ocenili z merjenjem števila živih celic s pomočjo testa proliferacije opisano zgoraj.

Praskanje Vsebnost

Celice smo zasejali v 24-vdolbinami (5 x 10 ^{4 celic /dobro) in kultivirani sotočju. konice pipet so bile uporabljene za ustvarjanje praske. PBS je bila uporabljena za odstranjevanje ostankov celic, nato pa nadomeščen z FBS proste mediju. Slike smo dobili 3 zaporedne dni. Širina nič smo merili z ImageJ 1,47 programsko opremo za Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) in narisan kot praske razdalji na dan.}

migracije in Invasion Vsebnost

Cell gibljivost testiranjem je bila izvedena z transwell vložke (8 mikrometrov velikost por) (Corning, ZDA). Celice-GFP (Green Fluorescent Protein) (1 × 10 ^{5/500 xl) suspendiramo v FBS-prostem mediju in postavi nad vložki v treh izvodih, s 800! Li gojitvenem mediju naložen spodaj. Po inkubaciji preko noči, so bili vložki izperemo 3 x s PBS in obrisati z navlaženem blazinico zgoraj, kjer je pritrjen s 4% PFA spodaj in opazili pri uporabi fluorescentni mikroskop (Olympus, Japonska). Enak postopek smo uporabili za izvedbo invazijo testa, vendar so bili uporabljeni vložki, ki so bile predhodno prevlečene z Matrigel (BD, ZDA). Oba testa sta bila količinsko kot število celic, preštetih v 5 naključnih polj (200 × povečava).}

Apoptoza Vsebnost

Apoptotična celice so bile izmerjene z uporabo V-FITC komplet za odkrivanje apoptoza aneksina (keygen, Kitajska) v skladu z navodili proizvajalca. Celice so bile bodisi neobdelane ali z zdravili za 24 ur in nato poberemo dvakrat sprali s PBS, resuspendirali v vezavnem pufru, ki vsebuje 5 ul FITC aneksinom V in 5 ul PE in inkubiramo pri sobni temperaturi 30 minut. Analiza je bila izvedena s pomočjo citometrija (FACSCalibur, Becton Dickinson, ZDA).

Kvantitativna Real-time PCR

Nuklearne ekstrakte smo pripravili s pomočjo mini-kit RNeasy v skladu z navodili proizvajalca. Vzorci prečiščena RNA (1 ug) v DEPC vodo so bile obrnjene prepisani z PrimeScript II 1. Sklop cDNA zbirno Kit (Takara, Kitajska). RT-PCR in pomnoževanje smo izvedli z uporabo kompleta SYBR Predmešanica Ex Taq II (Takara).

20 xl reakcijski sistem, ki vsebuje 1 p popravljenega cDNA vzorci, 10 ml SYBR premiks Ex Taq II (2 x), 0,4 xl ROX Reference Dye (50 x), 7 xl sterilni dvakrat destilirano H _{2O in 1 ul naprej in reverzne primerje (glej materiale in metode S1) so bile pripravljene in ovrednotene s pomočjo analize taljenje krivulje in primerjalno praga cikel (CT) Postopek. uporabljeni naslednji kolesarski pogoji so bili: 95 ° C za 10 minut, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 15 sekund in 58 ° C za 1 minuto. GAPDH smo uporabili kot gen kontrole.}

Western Blot Analiza

Proteini so bili pridobljeni iz eksponencialno rastoče celice in primarni tkiv. Ekstrakte smo kuhali v pufru, rešeno na 10% Tris-HCl SDS-poliakrilamidnem gelu in prenesli na nitrocelulozne membrane (Millipore, ZDA) z uporabo standardnih metod. Membrane smo blokirali z uporabo 5% nemastno mleko v Tris pufrom s Tween-20 (TBST) 30 minut pri sobni temperaturi. Membrane smo sprali s TBST in inkubiran preko noči pri 4 ° C s primarnimi protitelesi proti E-kadherina (1:5000), vimentina (1:5000), β-catenin (1:5000), N-kadherina (1:1000) in β-aktin (1:1000). Po spiranju 3 x s TBST, dodamo sekundarni kozje anti-kunčje (1:1000) in inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi. Končno so imunski kompleksi vidne tudi s kemoluminiscenco pomočjo ECL (Electro Chemical luminiscenco) (Millipore). Koncentracijo proteina smo normalizirali na beta-aktin.

histološki in imunohistokemičnim Analize

Vzorci so bili hitro zamrznjene v tekočem dušiku, shranjenih pri -80 ° C, določene v 4% PFA in prerezana na debelino 10 um (LEICA, Nemčija).

hematoksilin in eozin (HE) barvanjem, so deparaffinized drsi obarvamo s hematoksilinom 15 minut, izperemo 3 x s PBS, kislinsko alkohol za 5 sekund, nato eozin 5 minut (Boster, Kitajska).

za imunohistokemičnim barvanjem, so diapozitivi rehidrirano in toplotno povzroča iskanje epitope je bila izvedena v citratnega pufra uporabo lonec (20 minut pri 80 pKA), blokiran s 3 %, H _{2O 2 za 15 minut in jo nato uporabljajo običajna kozji serum (30 minut pri sobni temperaturi). Ploščice smo inkubirali v naslednjih primarnih protiteles: anti-E-kadherina (1:250), anti-vimentin (1:250), anti-β-catenin (1:250) in anti-pan-CK (1:250 ). Vzorce inkubiramo preko noči pri 4 ° C, dvakrat izperemo s PBS in inkubiramo pri sekundarnih protiteles za 2 uri pri 37 ° C. DAB Plus kromogena Komplet (Boster) je bila uporabljena za odkrivanje vse antigene. Diapozitivi so jih nasprotno s hematoksilinom, dehidrirani, in vgrajeni z coverslips uporabljajo nevtralno balata. Obe analizi so ločeno opravljajo patologi in zdravniki, ki so bili slepi za skupine vzorcev. Spori so se rešiti s soglasjem.}

Imunofluorescenčni in konfokalni mikroskop

Celice so bile položene na komornih diapozitive in zamrznjene odseki so bile določene s 4% PFA in permeabiliziramo z 0,5% Triton X-100. Ploščice smo blokirali z normalnim kozji serum za 1 uro pri 37 ° C, speremo in inkubiramo preko noči s primarnimi protitelesi pri 4 ° C, nato prenesemo in inkubiramo z kozje anti-mišje in anti-kunčje-TIRTC protiteles 1 uro pri 37 ° C v temi. Ploščice smo sprali z uporabo glicerina in vgrajen tako zajemajo zdrsi. Jedra so jih nasprotno z DAPI. Fluorescence je bila odkrita z uporabo konfokalnega lasersko skeniranje mikroskopom (Olympus). V deparaffinized cryosections smo obarvali z DAPI in analizirali uporabo imunofluorescenčni mikroskopom.

Model Animal

Osemdeset štirih tednov stare samice BALB /c miši so bile kupljene iz raziskovalnega centra živali v Šanghaju in vzdržuje v poskusni živali centra akademije Zhejiang medicinske vede. V skladu s smernicami za nego in laboratorijskih živalih Sveta za znanost in tehnologijo Kitajske, so bile vse živali, ki živijo v aseptičnih sterilnih pogojih in dajati avtoklavirata hrano in vodo, v skladu z načeli skrbi za laboratorijske živali Zhejiang University. Štiriinštirideset miši so bile uporabljene v podkožnem modelu in enakomerno bile razdeljene v nadzornih in preizkusnih skupinah. V BGC-GFPs so bili uporabljeni kot kontrole, kjer so bili TBGC-GFPs uporabe kot poskusa. Tumorske celice požanjemo v fazi rasti in suspendirali v FBS brez mediju (1 x 10 ^{6 celic /ml). Celice smo pipetirali na podvozju enoceličnih in vsak raztopino 500 u.l smo subkutano inokulirali na obeh straneh prsnega koša. Miši smo evtanazirali vsaka 2 tedna do 10 tednov in so bile izvedene patološke preiskave. Vse miši smo stehtali vsakih 3 dni. Vse operacije so bile izvedene v okviru 1% natrijevim pentobarbitalom, in si je prizadevala za zmanjšanje trpljenja.}

Šestintrideset miši so bili uporabljeni v vene injiciranje skupine za oceno porazdelitve raka (18 miši v BGC-GFP kontrolni skupini in 18 miši v TBGC-GFP poskusa skupine). 500 suspenzija xl celične (5 x 10 ^{5 celice) smo injicirali v repno veno golih miši. Miši so se žrtvovati za 2 nd, 5 th, 8. in 10. tednov patološkim pregledom.}

Statistična analiza
Eksperimentalni podatki so bili zbrani

in je stopil v preglednicah. Testi normalnost smo izvedli pred primerjavo podatkov. Primerjave med skupinami so bile izvedene s pomočjo t
preizkus študenta. Enosmerne analize variance smo uporabili za primerjavo > 3 skupine in metode Tukey je bila uporabljena za naknadnega
primerjav skupin. V tej študiji, p
< 0,05 šteje statistično značilne. SPSS 20.0 za Windows (IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) je bila uporabljena za opravljanje vseh statističnih analiz. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) je bila uporabljena za ustvarjanje vse grafične predstavitve

Rezultati
<. h3> 1. Morfološke spremembe v BGC-823 celic Mimick stromalnih celicah

fibroblastov (FBS) in BGC-823 celice cocultured v razmerju 10:1 za dodatnih 10 dni po kultiviranih celic dosegli sotočje. Zmes celice smo nato vnesejo s trypsinization sveže fibroblastov (1 x 10 ^{6 celic /ml) (slika 1.1). Dome tvorba v celicah BGC-823 je bila po prvem prehodu. V drugem in nadaljnjih prehodov, začasno okrogle oblike celice pojavil v kultivirani sistemu: nekateri združeni v grozde ali kepe in so ohlapno povezani s površino fibroblastov. V BGC-823 celic paralelno kultivirani je pokazala le nekaj okrogle oblike celice na dnu, ko je kultura postala prenatrpani. Mešani začasno celice razstavljene različne morfološke značilnosti in dolgotrajno prilogo po prehodu. Te celice pokazale, bodisi na tlakovanih podoben videz podoben BGC-823 celic ali kratke vretena podobne funkcije. Enotna so kratki, vretena podobne celice, ki ga proizvaja prehod mešanih suspendiranih celic in gostih normalnih fibroblastov. V nasprotju s tem prehod supernatantu celic BGC-823 izkazuje samo smeti po 24 urah gojenja, pri katerih majhne količine celic preživeli, da se tvori tlakovanih podobno klone podobne starševskih BGC-823 celice (Slika 1.3a-H).}

bile izvedene Kasnejši poskusi za določitev vira suspendiranih celic v cocultured sistemu. BGC-823 celice in fibroblaste so transfekciji s kaseto GFP-puro in kasete RFP-puro, v tem zaporedju, in ga poimenovali BGC-GFP in FB-RFP, v tem zaporedju. Po coculturing, BGC-GFP zrasel v večplastnih in oblikovali kupola podobno strukturo. Medtem smo celice okrogle oblike ali elipsoidne, ki so suspendirane v medijih prenese kulture plošče in označene z zeleno fluorescenco, kar dokazuje, da je dolgoročna coculturing z fibroblastov povzroči BGC preobrazbo. Okrogle in Sferoidna celice, ki so bile suspendirane v mediju smo tudi opazili ob uporabi zeleno fluorescenco in lahko vnesejo brez dodatka fibroblastov (slika 1.2A-D). Po več zaporednih krogih coculturing, transformirane BGC-823 celic (TBGCs) smo dobili, da se pojavili bolj enotna, kratko in vretena podobno. Te celice smo nato vnesejo brez dodatka fibroblastov. Zanimivo je, da so te celice bolj nagnjeni k tvorijo elipsoidne struktur, kot so celice, ki so rasle do sotočja in ni dokazati morfološko vrnitvi v BGC-823 celic, dokler >. 10-15 prehodov

Prejšnja študija je poročala, da fibroblasti zavirajo rast drugih celic, ko cocultured in vitro
mehanizem inhibicije kontaktne [4]. V naših poskusih, pa normalno fibroblasti ni stik, zavira širjenje BGC-823 celic. Namesto, FB-RFP postopoma izginila z BGC-GFP orožja, ko je gojenje podaljša na 10 dni. Zato smo zapored FB dopolnilo zahteva prehod in ohranjanje stabilno proizvodnjo TBGCs. Prav tako smo ugotovili, da je, ko je majhna količina TBGCs dodamo k zraščene fibroblastnega stanja so tumorske celice, ki so rasle zunaj potisne proč od fibroblaste. V središču kolonije tumorjev, smo celice okrogle oblike, z le ohlapno priključkov do baze (Slika 1.3a-H).

2. Epitelnih-mezenhimskih Prehod iz BGC-823 celice za TBGC

Real-time PCR smo uporabili za analizo mRNA izražanja. Rezultati kažejo, da je E-kadherina izraz izredno navzdol reguliranih skupaj z uravnavanjem vimentina v TBGCs. Medtem pa so izrazi zasuk, polž, polž in N-kadherina vse molekul (slika 1.5). Imunofluorescenco in Western blot potrjujejo izguba E-kadherina in povečano izražanje vimentina, N-kadherina, in beta-catenin (slika 1.4), s čimer potrjuje, da se pojavi dolgotrajno epitelijskih-mezenhimskih prehod (EMT) v TBGCs. E-kadherina je dokazano znak EMT in vzdržuje prilogo celica-celica v epitela. Izguba E-kadherina lahko privede do tumorja oddajajo več celic off iz mase tumorja.

3. Jedrskega orožja, je bila invazija, in mobilnost TBGCs

TBGC orožja analizirajo z MTS testom. TBGCs pokazala pospešeno stopnjo proliferacije ( p
< 0,01) (slika 2.1). Citometrija (glej materiale in metode S1) kaže, da je bilo 13% TBGCs ostane v fazi S, v nasprotju s samo 7% BGC-823 celic (Slika S1.3). Praskanje test kaže, da TBGC gibljivosti se v primerjavi s očetovskih BGC-823 celic (Slika 2.2-2.3A-H). TBGC Poškodba, potrebno 3 dni po začetku praskami, medtem ko > je bilo potrebno 4 dni za BGC-823 celic ( p
< 0,05) (slika 2.2)

Rezultati. poskusa vdora v Matrigel kažejo, da so TBGCs bolj agresiven kot BGC-823 celicah. Skupno 683.67 ± 170,83 TBGCs prepojena Matrigel v primerjavi z 188.33 ± 58.62 BGC-823 celic v kontrolni skupini ( p
< 0,01) (slika 2.4, slika 2.5A, B). Vendar TBGCs pokazale znatno zmanjšanje migrirali celicah: 2-krat manjša od BGC-823 celic po transwell migracij testu ( p
< 0,01) (slika 2.4, slika 2.5C, D). Obešenega narava TBGCs lahko upošteva tega zmanjšanja, stopnja upoštevanje je bilo le 68,33 ± 10,41 na TBGCs na Matrigel%, medtem ko 99,77% ± 6,25% na 823 BGC celic, je pokazala počasno pritrditev na površino Matrigelove v TBGCs (Tabela S1) .

da bi bolje mimic in vivo
vedenje tumor, je tip kolagen I gel uporablja za ugotavljanje razmerja med fibroblastov in invazivne zmogljivosti BGC-823 celic in TBGCs. Tip kolagen I gel je bil pripravljen na transwell vložki z fibroblastov (glej materiale in metode, S1). -Fibroblastne naložen gele smo gojili 7 dni, nato pa so bile-GFP označeni rakave celice zasejali v gelu in kultiviramo v naslednjih 7 dneh. Pregled pridelanega gelov je pokazala, da so tumorske celice prodrla v kolagenskih gelov. Ko so geli naložen z fibroblastov, TBGCs razstavljene bolj okrepljeno invazivno zmogljivosti, kot BGC-823 celic, kot je navedeno s številom celic, ki infiltrirane gela (Slika S1.2).

4. TBGCs Razstavljena Cisplatin Odpornost

Nato smo ocenili občutljivost TBGCs do standardnih želodca kemoterapevtiki raka. Izvedljivih BGC-823 celice in TBGCs smo določili po 24 urah izpostavljenosti cisplatin (0, 20, 40, 60, 80 uM), z merjenjem vključitev MTS. Rezultati kažejo, da TBGCs razstavljene izredno odpornost na cisplatinom, medtem ko je nekaj BGC-823 celic preživela, ko je bila koncentracija cisplatin povišano do 40 uM ( p
< 0,001) (slika 3.1). Izvedljivih TBGCs lahko tudi zaznal, ko je bila koncentracija cisplatin povišane do 200 uM (podatki niso prikazani). Opravili smo analizo celic, apoptoza uporabo citometrija, da bi preverili odpornost cisplatin. Rezultati kažejo, da je bila stopnja preživetja TBGCs približno 42,40% v primerjavi z 13,80% za BGC-823 celic po zdravljenju z 40 LM cisplatin za 24 ur (slika 3,3-3,4). Vendar pa je pri zdravljenju s 5-FU, ni bilo bistvenih razlik v inhibicijo tumorja med TBGCs in BGC-823 celic, glede na MTS testom (slika 3.2). Oba tumorskih celic je pokazala chemoresistance 5-FU (slika 3.2).

5. TBGCs Exhibit V vivo
limfnih vozlov nagnjenost

Če želite ugotoviti, vivo
distribucijo TBGCs, 5 x 10 ^{5 BGC 823-celice ali TBGCs so vbrizgali v rep veno BALB /c miši. opazili dva tedna po injiciranju, variance in pomožnega vratnih bezgavkah metastaze v obeh skupinah, kot je navedeno v oceni fluorescentne sledila (slika 4.3A-F). GFP-pozitivne celice so našli v pomožni in dimeljske bezgavke v obeh skupinah (slika 4.3A, B, D, E). Vendar GFP-pozitivne celice pojavila samo v pljučih miši v skupini BGC (slika 4.3C, F).}

Na teden 5, poleg obsežne vdora v limfne vozle, je tudi infiltracija orgle opazili. Več bezgavka invazija opazili v TBGC skupini kot kontrolno BGC skupini, v vsaki časovni točki (Slika 4.1, Video S1). Te bezgavke bila odločena, da je pan-CK pozitiven (Slika S2.1). Opazili smo tudi različne TBGC in distribucijo BGC v organih. TBGCs bili omejeni na gastrointestinalnega tkiva, medtem ko BGCs poravnajo v pljuča in črevesje (Slika 4.2a-H). 5. teden, je črevesna metastaze prvič opazili v 3/4 miših, ki so jim vbrizgali TBGCs, medtem ko le 25% miši je pokazala vidne črevesne metastaze naslednje BGC injekcije (Slika S2.3).

Kot razvili tumorji, povprečno število črevesnih TBGC metastaz povečala (5,6 ± 3,911 vs
3,5 ± 1,914 BGCs v 8. tednu; 6,33 ± 1,52 vs
5,6 ± 1.342 v 10. tednu) (Slika S4.2) . Zanimivo je, da 3 od 5 miši v skupini TBGC dokazali megascopic neoplazme v gastrum po 10 tednih, kar pa ni bilo opaziti v skupini BGC. Megascopic pljučne metastaze so bile ugotovljene pri 3 od 4 BGC miši v 8. tednu Vendar so bile v 10. tednu (Slika 4.2a-H) opazili pljučne metastaze vidna TBGC. Mikroskopski pregled je pokazala infiltracija TBGCs v materničnem vratu in aksilarno bezgavke že 1 teden po injiciranju rep ven, ker BGCs potrebno več časa (3 tedne), za vstop v te bezgavke (Slika 4.1). Pet tednov po injiciranju celic smo infiltracijo pljuč opazili v skupini BGC. Vendar pa ni bilo TBGCs do 10 tednov po injiciranju (slika 4.2b, F, slika S2.3) zazna z organi.

Imunohistokemijsko navedeno postopno povečevanje E-kadherina v bezgavkah skupine TBGC , medtem ko E-kadherina izraz v skupini BGC nekoliko zmanjšala ( p
< 0,01) (slika 4.4A-P). Razlike so bile pomembne pri 8 in 10 tednov, ko je E-kadherina izraz precej višja v skupini TBGC primerjavi s skupino BGC (slika 4.5). Izraz beta catenin povečala tudi s časom v skupini TBGC, ki je dosegla svoj vrh na 8 tednov, nato pa nekoliko zmanjšala (slika 4.5). Rezultati prav tako kažejo povečano β-catenin ekspresijo v skupini TBGC pri 5, 8 in 10 tednov ( p
< 0,01). (Slika 4.5)

6. TBGCs pokazala majhno tumorje Oblikovanje ampak Visoka limfnih vozlov metastaze zmogljivosti v naši subkutana tumorigeneze Model

Ker so tumorske celice bolj verjetno, da tvorijo neoplazme pri subkutano vsadijo, (GFP +) TBGCs in BGCs so vsaditi vbrizgavanjem 5 × 10 ^{5 izvedljive tumorske celice v podkožnega tkiva na obeh straneh prsnega koša. Nastajajoči tumorji v skupini BGC so odkrili že v 3 dneh po implantaciji, in vse miši v skupini BGC razvilo tumorje na mestih implantaciji po 1 tednu inkubacije (slika 5.1A). Presenetljivo je, da se vsadi TBGCs ni prinesla nezaznavne tumorje do 8 tednov (slika 5.1, Video S2). Stopnjevanje doze TBGC 5-10 x 10 6 vsajene celice vodili le k tvorbi majhnih tumorskih kepe in počasnim povečanjem volumna tumorja skupaj z inkubacijskim časom. Poleg tega miši v skupini BGC postal umirajoči, očitno zaradi povečanega tumorsko (podatki niso prikazani).}

celega telesa obdukcije pri vsakem časovnem intervalu kažejo, da TBGCs namesto vidnih primarnih tumorjev, infiltrirane sosednji in distalne bezgavke, ker BGC ustvarjenih tumorskih gmot bili omejeni na intaktnih fibroze kapsul na mestu injiciranja (Video S2). Regionalna Globalna bezgavke metastaze v skupini TBGC je bilo ugotovljeno že v 2 tednih po implantaciji, medtem ko so regionalne bezgavke metastaze odkrita na 4 tedne v skupini BGC (slika 5.2). Kaplan-Meier analiza kaže, da so TBGCs je pokazala večje tveganje za razvoj v bezgavkah metastaze kot BGCs (slika 5.2).

Obsežna črevesne metastaze so se tudi kaže v vse miši v skupini TBGC na 8 tednov in po njem (Slika S4.1 Slika S4.4). Povprečno število črevesnih gomoljev je bila 5,50 ± 1,73 v 8. tednu in 7,33 ± 1,79 v 10. tednu V nasprotju s tem, samo 1 miš v skupini BGC dokazana 3 črevesno infiltracije na 9 tednu (Slika S4.1).

GFP sledenje kaže lokalno nastanek tumorjev v skupini BGC na mestu injiciranja brez regionalni infiltracijo bezgavk. V nasprotju s tem, TBGCs pojavil v aksilarna bezgavkah, vendar zelene fluorescence niso odkrili v tkivih na mestu injiciranja (slika 5.3). V 6. tednu, TBGCs-GFP nabrali v danke in mezenterićne limfne vozle. Vendar pa je bila samo 1 miška s pozitivnim mezenteričnih bezgavk metastaz zaznali v skupini BGC. pan-CK Imunohistokemijsko kaže, da TBGCs metastaziral na regionalne (predčasno) in distalnih bezgavk (prepozno), medtem ko BGCs metastaziral le na regionalnih bezgavk (prepozno) v obdobju poskusa (Slika S4.5). TBGCs metastaziral tudi na črevesju v tednu, ko ni bilo mogoče najti v skupini BGC.

HE obarvanje dokazuje, da nenormalne celice pojavil v regionalnih bezgavkah v zgodnjih fazah v skupini TBGC in poznih fazah, v BGC skupina (Slika S4.6). Imunohistokemijsko analiza protein izražanje pri 2 tednih kaže downregulation za E-kadherina in beta-catenin in okrepljeno vimentina izražanja v TGBC-LNS v primerjavi z BGC-novotvorb. Ti rezultati so potrdile tudi blot analizo zahodni vzorcev tkiv, ki ne zaznavajo E-kadherina v TGBC-LNS; Medtem, N-kadherina je tudi močno v TGBC-LNS (slika S3.3-3.4) navzdol reguliranih.

Imunohistokemijsko kaže postopno povečanje E-kadherina v bezgavkah skupine TBGC kot Sčasoma, ker izraz E-kadherina v skupini BGC nekoliko zmanjšala ( p
< 0,01) (slika 5.4).

• Plos ONE: Prohibitin Expression Deregulacija želodčnega raka je povezana s 3 'neprevedeno regijo 1630 C > T polimorfizma in kopiranje Število Različica
• Plos ONE: Aktivacija mezenhimskih matičnih celic, ki jih Makrofagi Prompts Human Rak želodca rast skozi NF-κB Pathway