PLoS ONE: Normal Fibroblasten E-Cadherin-Verlust herbeiführen und Lymphknotenmetastase in Gastric Cancer

Abstrakt

Hintergrund

Ein Tumor gilt als eine heterogene Komplex in einer dreidimensionalen Umgebung erhöhen, die ist bündig mit pathophysiologischen und biomechanische Signale. Zell-Stroma-Interaktionen führen die Entwicklung und Erzeugung von Tumoren. Hier bewerten wir die Beiträge von normalen Fibroblasten zu Magenkrebs.

Methodik /wesentlichen Ergebnisse

Nach Cokultivierung normalen Fibroblasten in Monolayern von BGC-823 Magenkrebs-Zellen, Tumorzellen sporadisch kurze entwickelt, Spindel -ähnlich morphologischen Eigenschaften und zeigten eine verbesserte Verbreitung und invasive Potential. Darüber hinaus zeigten die transformierten Tumorzellen verminderte Tumorbildung und erhöhte lymphomatic und Darm-metastatischen Potential. Nicht-transformierte BGC-823-Zellen im Gegensatz dazu gezeigt, primäre Tumorbildung und verzögerte Darm- und Lymphknoteninvasion. Wir beobachteten auch E-cadherin-Verlust und die Hochregulation von Vimentin-Expression in den Tumorzellen transformiert, die vorgeschlagen, dass die Erhöhung der Metastasierung von epithelial-to-mesenchymalen Übergang induziert wurde.

Schlussfolgerung

Zusammengefasst unsere Daten zeigten, dass normale Fibroblasten ausreichend epithelial-to-mesenchymale Transition in Krebszellen induzieren, was zu einer Metastasierung führenden

Citation. Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et al. (2014) Normale Fibroblasten E-Cadherin-Verlust herbeiführen und Lymphknoten-Metastasen in Magenkrebs erhöhen. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10.1371 /journal.pone.0097306

Editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Vereinigtes Königreich

Empfangen: 10. Dezember 2013; Akzeptiert: 16. April 2014; Veröffentlicht: 20. Mai 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Forschung , der National Science Fund Committee (http://www.nsfc.gov.cn, allgemeine Projekt Nein, wurde durch Zuschüsse aus dem National Health Key Sonderfonds (No.200802112 http://program.most.gov.cn) unterstützt .81372302 No.81272120), der Abteilung Gesundheit Fonds (http://program.most.gov.cn; No.2007A093), das Key-Projekt in der Provinz Zhejiang (http://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). Der Natural Science Fund in der Provinz Zhejiang (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 und Z2080514) und der traditionellen chinesischen Medizin Bureau Fund (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Metastasen verantwortlich sind für bis zu 90% des Krebs assoziierten Sterblichkeit. Viele Patienten, die keine Anzeichen von Metastasen bei der ersten Diagnose zeigen schließlich Metastasen entwickeln. Obwohl Metastasen die meisten Todesfälle durch Krebs verursachen, bleibt dieser Prozess einer der rätselhaftesten Aspekte der Krankheit.

metastatischen Tumorzellen Gewebe über Extravasation eingeben. Das Gewebe unterliegt jedoch unklar Verfahren, mit denen die Zellen in der Gewebematrix und kommen in direkten Kontakt mit Stromazellen eingebettet sind, von denen die meisten normalen Fibroblasten sind. Die Tumorzellen haben alle Chancen, in Kontakt mit Stromazellen zu kommen, einschließlich neoplastischen und metastatischen Zellen [1]. Dies führt zu einer gegenseitigen Übersprechens mit normalen Fibroblasten im Gewebe.

Fibroblasten sind die am häufigsten vorkommenden Stromazellen, und sie stimulieren die Mikroumgebung und dienen als eine reiche Quelle für den parakrinen Weg während der Tumorentstehung und Progression. Die Auswirkungen der normalen Fibroblasten auf Tumorzellen sind umstritten. Es wurde berichtet, dass normale Fibroblasten die bösartige Umwandlung von verewigte Prostata-Epithel [2], während in Brusttumoren unterdrücken, die Fibroblasten duktale Carcinoma in invasives Karzinom umwandeln [3].

Diese Uneinigkeit zeigt an, dass der Einfluss von Fibroblasten auf Tumorzellen anders ist als für CAFs (Krebs-Fibroblasten). Für diese Studie wurden cokultiviert wir Tumorzellen mit normalen Fibroblasten in Petrischalen, um zu imitieren, wie Tumorzellen Fibroblasten in Verbindung. Wir konzentrierten uns auf den Beitrag der normalen Fibroblasten zu Magenkrebs. Wir kultiviert die normalen Fibroblasten dichten Monoschichten zu bilden, die dann mit Tumorzellen, um metastatische Tumorzellen zu imitieren disseminierte wurden. Wir stellten die Hypothese, dass das hohe Verhältnis von Fibroblasten zu Tumorzellen könnten die Gewebe nachahmen denen metastasierende Tumorzellen befinden. So wurden Hautfibroblasten von gesunden Individuen verwendet, um die zelluläre Umgebung zu erzeugen. Die Magenkrebs-Zelllinie, BGC-823 wurde hier verwendet, weil es morphologisch unterscheiden sich von Fibroblasten ist.

Materialien und Methoden

Ethische Erklärung

Primäre humane Hautgewebe wurden erhalten von Kindern, die Beschneidung nach Erhalt eine schriftliche Einverständniserklärung von ihren Betreuern unterzog, die in ihren medizinischen Unterlagen enthalten war. (: Forschung 2013-047 ethische Überprüfung Code) Dieser Versuch wurde von der Institutional Review Board des Zweiten Affiliated Hospital der Zhejiang University School of Medicine, geprüft und genehmigt. Die Patienten in dieser Studie mit einer Kopie der schriftlichen Einverständniserklärung zur Verfügung gestellt wurden und die Erlaubnis gab, zu veröffentlichen.

Alle Versuche entsprechend für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Rates für Wissenschaft und Technologie zu den Leitlinien durchgeführt wurden, von China. Das Studienprotokoll wurde von der Animal Care und Use Committee der Zhejiang Universität genehmigt.

Reagenzien und Antikörper

Penicillin G /Streptomycin, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), Triton X-100, Rinder- Serumalbumin, Kollagenase Typ I und Trypsin wurden von Jinuo (China) erworben. High-glucose DMEM wurde von Gibco (China) erhalten werden, und fötales Rinderserum (FBS) wurde von Gibco (SA) erworben. Cisplatin, 5-Fluoruracil, Puromycin und Kollagen Typ I von Sigma (USA) erworben wurden. Cisplatin wurde in Dimethylformamid (DMF) gelöst, 5-Fluorouracil in DMSO und Puromycin in PBS, um Stammlösungen zu machen, die dann bei -20 ° C gelagert wurden. Kollagen Typ I (5 mg /ml) wurde zu 1 mg /ml verdünnt. DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol · HCl) in PBS wurde von Roche erhalten, und Ziege-anti-Maus- und Kaninchen-IgG, sekundären Antikörper-TIRTC und sekundäre Antikörper wurden von ZSGB-Bio (China) erhalten. Antihuman-E-Cadherin-Kaninchen (ab40772), Anti-Human-Kaninchen-Vimentin (ab92547) und Anti-Human-β-Catenin-Kaninchen-Antikörper (ab9274) wurden von Abcam (UK) erhalten. Anti-Human-pan-CK-Maus-Antikörper (C11) und N-Cadherin-Kaninchen-Antikörper (C4061) wurden von Cell Signaling Technology (China) erhalten wurde, und Anti-Human-β-Actin und sekundären Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper wurden aus Boster (China) erhalten . Die Antikörper wurden mit 5% FBS verdünnt, um Konzentrationen arbeiten, sofern nicht anders erwähnt.

Cell Culture

Die etablierte Zelllinie, die menschliche Magenkrebs BGC-823 in unserem Experiment verwendeten Zellen aus der Zellbank erworben wurden Guangzhou Institute Biomedizin und Gesundheit. Die Zellen wurden aufgetaut und für 4-5 mal passagiert und dann in der Co-Kultur-Experimente verwendet wurden. Primäre dermalen Fibroblasten wurden aus den chirurgischen Proben von Kindern erhalten, die Beschneidung unterzogen hatten und informierte Zustimmung zur Verfügung gestellt. Fibroblasten wurden nach dem dritten Durchgang (innerhalb von 50 Passagen), kultiviert in Hoch-glucose DMEM, enthaltend 10% FBS und gehalten in einem befeuchteten Inkubator (5% CO _{2) bei 37 ° C verwendet. Das Zellmedium wurde jeden zweiten Tag ersetzt.}

Für die Erzeugung der TBGCs, die Fibroblasten (FBs) und BGC-823-Zellen in einem Verhältnis von 10.01 für weitere 10 Tage nach den kultivierten Zellen cokultiviert wurden erreicht Einmündung. Kuppelbildung wurde in dem Co-Kultursystem beobachtet. Das Zellgemisch wurde dann durch Trypsinisierung mit frischen Fibroblasten (1 × 10 ^{6 Zellen /ml) passagiert. Während der zweiten und nachfolgenden Passagen, scheinbare Verhängnis Bildung und die suspendierten runden Zellen erschienen, die vielfältige morphologische Merkmale und verlängerte Bindung nach der Passage ausgestellt. Nach dem fünften Durchgang der gemischten suspendierten Zellen und dichten normalen Fibroblasten, Uniform, kurz, spindelförmige Zellen als "TBGCs" wurden produziert und morphologische Rückkehr zu BGC-823 Zellen bis >nicht zeigen;. 10-15 Passagen}

Proliferationsassay

Exponentiell wachsende Zellen wurden in einem befeuchteten 5% CO _{2 -Atmosphäre bei 37 ° C in 96-Well-Platten für weitere 6 Tagen Inkubation beimpft. Zellproliferation in fünffacher Ausfertigung jeden Tag gemessen wurde durch 20 Pipettieren uL CellTiter 96 WÄSSRIGE Eine Lösung Reagent (Promega, USA) in jede Vertiefung, die 100 &mgr; l High-glucose DMEM enthielt, dann Zellen für weitere 2 Stunden inkubiert wurden, bevor die relative Absorption bei 490 die Bestimmung eine Mikrotiterplatten-Lesegerät nm.}

Drug-Inhibitionsassay

Fünf Vervielfältigungen von exponentiell wachsenden Zellen in einer 96-Well-Platten und inkubiert für 24 Stunden ausgesät. Nach 24 Stunden wurde das Medium mit verschiedenen Konzentrationen von Arzneimitteln (0-80 uM) und kultiviert für weitere 24 Stunden ersetzt. Arzneimitteltoxizität wurde durch Messung der Anzahl der lebensfähigen Zellen ausgewertet oben beschrieben unter Verwendung des Proliferationsassay.

Verkratzen Assay

Zellen auf 24-Well-Platten ausgesät (5 x 10 ^{4 Zellen /gut) und bis zur Konfluenz. Pipettenspitzen wurden verwendet, um Kratzer zu erzeugen. PBS wurde verwendet, um Zelltrümmer zu entfernen, und dann mit FBS-freiem Medium ersetzt. Bilder wurden an 3 aufeinanderfolgenden Tagen erhalten. Die Breite des Kratzers gemessen wurde ImageJ 1.47 Software für Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) mit und aufgetragen, wie die Kratz Entfernung pro Tag.}

Migration und Invasion Assay

Zellbewegung Testen wurde unter Verwendung von Transwell-Einsätze (8 &mgr; m Porengröße) (Corning, USA) durchgeführt. Zellen-GFP (Green Fluorescent Protein) (1 × 10 ^{5/500 ul) wurden über die Einsätze in dreifacher Ausfertigung in FBS-freiem Medium und platziert suspendiert, mit 800 &mgr; l Kulturmedium unterhalb geladen. Nach Inkubation über Nacht wurden die Einsätze 3 x mit PBS gewaschen und mit einem angefeuchteten Tupfer oben, wo mit 4% PFA abgewischt unten und beobachtet ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan) verwendet wird. Das gleiche Verfahren wurde verwendet, um die Invasionstest durchzuführen, aber Inserts, die mit Matrigel (BD, USA) wurden verwendet, vorbeschichtet wurden. Beide Assays wurden als die Anzahl der Zellen in 5 Zufallsfeldern (200-fache Vergrößerung).}

Apoptosis Assay

Apoptotische Zellen die Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Keygen verwendet wurden gemessen gezählt quantifiziert, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zellen wurden entweder unbehandelt oder mit Arzneimitteln für 24 Stunden behandelt und dann zweimal mit PBS gewaschen, geerntet, resuspendiert in Bindungspuffer, enthaltend 5 &mgr; l FITC-Annexin V und 5 &mgr; l PE, und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Analyse wurde unter Verwendung von Durchflusszytometrie (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).

Quantitative Real-time PCR

Kernextrakte wurden hergestellt, die RNeasy Mini-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Gereinigte RNA-Proben (1 ug) in DEPC Wasser wurden revers transkribiert die PrimeScript II 1. cDNA-Synthese Kit (Takara, China). RT-PCR-Amplifikation und unter Verwendung des SYBR Premix Ex Taq II-Kits (Takara) durchgeführt.

A 20 &mgr; l-Reaktionssystem, das 1 &mgr; l cDNA-Proben verdünnt, 10 &mgr; l Premix SYBR Ex Taq II (2 ×), 0,4 ul ROX Referenzfarbstoff (50 x), 7 &mgr; l sterilem doppelt destilliertem H _{2 O und 1 ul Vorwärts- und Rückwärts-Primer (siehe Materialien und Methoden S1) wurden hergestellt und bewertet, Schmelzkurvenanalyse unter Verwendung von und den Vergleichsschwellenzyklus (Ct) Methode. Die folgenden Zyklusbedingungen verwendet wurden: 95 ° C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 Sekunden und 58 ° C für 1 Minute. GAPDH wurde als Kontroll-Gen verwendet.}

Western-Blot-Analyse

Die Proteine ​​wurden aus exponentiell wachsenden Zellen extrahiert und Primärgewebe. Die Extrakte wurden in Beladungspuffer gekocht, aufgelöst auf 10% Tris-HCl SDS-Polyacrylamidgelen und auf Nitrozellulosemembranen (Millipore, USA) unter Verwendung von Standardverfahren übertragen. Die Membranen wurden mit 5% fettfreie Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST) für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Membranen wurden mit TBST gewaschen und über Nacht bei 4 ° C mit primären Antikörpern gegen E-Cadherin (1:5000), Vimentin (1:5000), β-Catenin (1:5000), N-Cadherin (1:1000) inkubiert, und β-Aktin (1:1000). Nach dem Waschen 3 x mit TBST wurde sekundären Ziege-anti-Kaninchen (1:1000) zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Immunkomplexe durch Chemilumineszenz unter Verwendung von ECL (Electro Chemical Luminescence) (Millipore) sichtbar gemacht. Die Proteinkonzentration wurde normalisiert auf &bgr; -Actin.

Histologische und immunohistochemische Analysen

Die Proben wurden schnell in flüssigem Stickstoff gefroren, bei -80 ° C aufbewahrt, in 4% PFA fixiert und geschnitten zu eine Dicke von 10 um (LEICA, Deutschland).

für Hämatoxylin und Eosin (HE) -Färbung, die entparaffinierten Folien 15 Minuten lang mit Hämatoxylin gefärbt wurden, wäscht 3 x mit PBS, Säurealkohol für 5 Sekunden, dann Eosin für 5 Minuten (Boster, China).

für die immunhistochemische Färbung wurden die Objektträger rehydriert und hitzeinduzierten Epitopdemaskierung wurde in Citratpuffer mit einem Druckkochtopf (20 Minuten bei 80 pKA), blockiert mit 3 durchgeführt % H _{2 O 2 für 15 Minuten, und dann normales Ziegenserum aufgetragen wurde (30 Minuten bei Raumtemperatur). Die Objektträger wurden in den folgenden primären Antikörpern inkubiert: Anti-E-Cadherin (1:250), anti-Vimentin (1:250), anti-β-Catenin (1:250) und anti-pan-CK (1:250 ). Proben wurden bei 37 ° C über Nacht bei 4 ° C, spült zweimal mit PBS gewaschen und mit dem sekundären Antikörper für 2 Stunden inkubiert. DAB Plus-Chromogen-Kit (Boster) wurde verwendet, um alle Antigene zu erkennen. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert und montiert mit Deckgläsern mit neutralen Balata. Beide Analysen wurden getrennt von den Pathologen und Klinikern durchgeführt, die blind für die Probengruppen waren. Streitigkeiten wurden durch Konsens gelöst.}

Immunofluoreszenz und konfokale Mikroskopie

Die Zellen auf Kammer Dias plattiert wurden, und die gefrorenen Schnitte wurden mit 4% PFA fixiert und mit 0,5% Triton X-100 permeabilisiert. Die Objektträger wurden für 1 Stunde mit normalem Ziegenserum blockiert bei 37 ° C, gespült und über Nacht mit primären Antikörpern bei 4 ° C inkubiert, dann transferiert und inkubiert mit Ziegen-anti-Maus- und anti-rabbit-TIRTC Antikörper für 1 Stunde bei 37 ° C im Dunkeln. Die Objektträger wurden unter Verwendung von Glycerin gewaschen und montiert mit Deckgläsern. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Die Fluoreszenz wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Olympus) nachgewiesen. Die deparaffinierten Kryoabschnitte wurden mit DAPI gefärbt und analysiert, um eine Immunfluoreszenzmikroskop.

Tiermodell

Achtzig vier Wochen alten weiblichen Balb /c-Mäuse vom Tier Research Center von Shanghai erworben wurden und gepflegt bei dem Versuchstier Zentrum der Zhejiang Akademie der Medizinischen Wissenschaften. Gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Rates für Wissenschaft und Technologie von China wurden alle Tiere unter aseptischen sterilen Bedingungen gehalten und autoklaviert Nahrung und Wasser in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Labortierpflege von Zhejiang University verwaltet. Vierundvierzig Mäuse wurden im subkutanen Modell verwendet, und wurden gleichmäßig in Kontroll- und Testgruppen aufgeteilt. Die BGC-GFPs wurden als Kontrolle verwendet, wo die TBGC-GFPs verwendet als Experiment waren. Die Tumorzellen wurden in der Wachstumsphase geerntet und in FBS-freiem Medium (1 × 10 ^{6 Zellen /ml) suspendiert. Zellen wurden auf Einzelzellsuspensionen pipettiert und je 500 &mgr; l-Lösung wurde subkutan an beiden Seiten der Brust inokuliert. Die Mäuse wurden alle 2 Wochen bis 10 Wochen euthanasiert und pathologische Untersuchungen wurden durchgeführt. Alle wurden die Mäuse alle 3 Tage gewogen. Alle Operationen wurden unter 1% Natriumpentobarbital durchgeführt und alle Anstrengungen unternommen wurden Leiden zu minimieren.}

Sechsunddreißig Mäuse wurden in Veneninjektionsgruppe für die Beurteilung von Krebsverteilung (18 Mäuse in BGC-GFP Kontrollgruppe und 18 Mäuse in TBGC-GFP Experiment-Gruppe). 500 &mgr; l Zellsuspension (5 x 10 ^{5 Zellen) wurden in die Schwanzvene von Nacktmäusen injiziert. Die Mäuse wurden bei 2 eingeschläfert nd, 5 th, 8 th und 10 th Wochen für pathologische Untersuchung.}

Statistische Analyse

Die experimentellen Daten wurden gesammelt und trat in Tabellen. Normalitäts Tests wurden durchgeführt, bevor die Daten zu vergleichen. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung von Student durchgeführt t
Test. Einweg-Varianzanalyse wurde verwendet, um zu vergleichen, > 3 Gruppen, und das Verfahren des Tukey wurde verwendet für post hoc
Vergleiche von Gruppen. In dieser Studie p
< 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird. 20.0 SPSS für Windows (IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) wurde verwendet, um alle statistischen Analysen durchzuführen. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) wurde verwendet, um alle grafischen Darstellungen zu erzeugen

Ergebnisse | <. h3> 1. Morphologische Veränderungen in BGC-823 Zellen mimick Stromal Cells

Fibroblasts (FBs) und BGC-823-Zellen wurden in einem Verhältnis von 10.01 für weitere 10 Tage nach der Konfluenz kultivierten Zellen erreicht cokultiviert. Das Zellgemisch wurde dann durch Trypsinisierung mit frischen Fibroblasten (1 × 10 ^{6 Zellen /ml) (Figur 1.1) passagiert. Kuppelbildung in den BGC-823-Zellen wurde nach dem ersten Durchgang beobachtet. Während der zweiten und nachfolgenden Passagen, suspendiert runden Zellen in der Kultursystem erschienen: einige in Cluster zusammengefasst oder Klumpen und wurden lose auf der Oberfläche der Fibroblasten verbunden. Die parallel kultivierten BGC-823 Zellen, die nur ein paar runde Zellen an der Basis gezeigt, wenn die Kultur überfüllt wurde. Die gemischten suspendierten Zellen vielfältige morphologische Merkmale und verlängerte Bindung nach der Passage ausgestellt. Diese Zellen zeigten entweder ein pflastersteinartiges Aussehen ähnlich wie BGC-823-Zellen oder kurze spindelähnliche Merkmale. Uniform, kurz, spindelförmige Zellen wurden durch den Durchgang der gemischten suspendierten Zellen und dichte normalen Fibroblasten hergestellt. Im Gegensatz dazu Passage des Überstandes der BGC-823-Zellen zeigten nur Ablagerungen nach 24 Stunden Kultivierung, in denen kleine Mengen von Zellen überlebt pflastersteinartigen Klone ähnlich wie die elterliche BGC-823-Zellen (1,3A-H) zu bilden.}

wurden anschließende Experimente durchgeführt, um die Quelle der suspendierten Zellen in der co-kultivierten System zu bestimmen. BGC-823-Zellen und Fibroblasten wurden mit GFP-puro Kassette und RFP-puro Kassette transfiziert sind und BGC-GFP und FB-RFP genannt, respectively. Nach Cokultivierung wuchs BGC-GFP in Mehrfachschichten und eine kuppelartige Struktur gebildet. Inzwischen sind die runden oder Sphäroid-Zellen, die in den Medien suspendiert wurden, wurden auf Kulturplatten überführt und mit grüner Fluoreszenz markiert, was zeigt, dass die Langzeit Cokultivierung mit Fibroblasten BGC Transformation induziert. Rund und Sphäroid-Zellen, die in dem Medium suspendiert wurden, wurden auch grüne Fluoreszenz beobachtet Verwendung und konnte ohne Zugabe von Fibroblasten (Figur 1.2A-D) passagiert werden. Nach mehreren aufeinander folgenden Runden Co-Kultur, transformiert BGC-823-Zellen (TBGCs) erhalten, die gleichmäßiger, kurz erschienen, und spindelförmige. Diese Zellen wurden dann ohne Zusatz von Fibroblasten passagiert. Interessanterweise waren diese Zellen anfälliger Sphäroid Strukturen als die Zellen zu bilden, die bis zur Konfluenz gewachsen und nicht morphologische Rückkehr zu BGC-823 Zellen bis >zeigen;. 10-15 Passagen

Eine frühere Studie berichtet, dass Fibroblasten zu hemmen das Wachstum von anderen Zellen kokultiviert wenn in vitro
durch den Mechanismus der Kontakthemmung [4]. In unseren Experimenten aber hatten normalen Fibroblasten nicht die Proliferation von BGC-823-Zellen-Kontakt hemmen. Stattdessen FB-RFPs allmählich mit BGC-GFP Proliferation zugrunde gegangen, wenn die Kultivierung auf 10 Tage verlängert. Aus diesem Grund wurde in Folge FB Ergänzung zu Passage und aufrecht zu erhalten, die stabile Produktion von TBGCs erforderlich. Wir beobachteten auch, dass, wenn eine kleine Menge von TBGCs zur konfluenten Fibroblastenblatt hinzugefügt wurde, die Tumorzellen, die außerhalb wuchsen, wurden durch die Fibroblasten weggedrückt. Im Zentrum des Tumors Kolonie wurden die Zellen runden, mit nur lose Befestigungen an der Basis (Abbildung 1.3A-H).

2. Epithelial-mesenchymale Transition von BGC-823 Cell TBGC

Real-time PCR verwendet wurde mRNA-Expression zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass E-Cadherin-Expression wurde bemerkenswert mit der Hochregulation von Vimentin in TBGCs downregulated entlang. Inzwischen sind die Ausdrücke der Twist, schnecke, und N-Cadherin wurden alle nach oben reguliert (Abbildung 1.5). Immunofluoreszenz-Färbung und Western-Blot-confirm E-Cadherin-Verlust und die erhöhte Expression von Vimentin, N-Cadherin und β-Catenin (Bild 1.4), was bestätigt, dass die langfristige epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) in TBGCs auftritt. E-Cadherin ist ein bewährtes Markenzeichen von EMT und pflegt Zell-Zell-Bindung im Epithel. E-Cadherin Verlust konnte auf den Tumor führen mehr Zellen aus der Tumormasse zu vergießen.

3. Proliferation, Invasion und Mobilität von TBGCs

TBGC Proliferation wurde unter Verwendung des MTS-Assay analysiert. TBGCs zeigte eine beschleunigte Proliferationsrate ( p
< 0,01) (Abbildung 2.1). Durchflusszytometrie (siehe Materialien und Methoden S1) zeigt, dass 13% der TBGCs in der S-Phase gehalten wurden, im Gegensatz zu nur 7% der BGC-823-Zellen (S1.3). Das Kratzen Test zeigt an, dass TBGC Motilität im Vergleich erhöhte sich mit väterlicher BGC-823-Zellen (2.2-2.3A-H). TBGC Anastomose erforderlich 3 Tage nach dem Beginn der Kratzer, während > für 4 Tage BGC-823 Zellen benötigt wurden ( p
< 0,05) (Abbildung 2.2)

Die Ergebnisse. die Matrigel Invasion Assays zeigen, dass TBGCs aggressiver sind als BGC-823-Zellen. Insgesamt 683,67 ± 170,83 TBGCs infiltriert die Matrigel im Vergleich zu 188,33 ± 58,62 BGC-823-Zellen in der Kontrollgruppe ( p
< 0,01) (Abbildung 2.4, Abbildung 2.5A, B). Jedoch TBGCs eine signifikante Reduktion der migrierten Zellen nachgewiesen: 2-fach weniger als BGC-823-Zellen nach der Transwell-Migrationstest ( p
< 0,01) (Figur 2.4, Figur 2.5C, D). Der suspendierte Natur der TBGCs könnte für diese Reduktion ausmachen, war die Einhaltung Rate nur 68,33 ± 10,41% in TBGCs auf Matrigel, während 99,77% ± 6,25% in BGC-823-Zellen, langsame Befestigung an der Matrigel Oberfläche demonstriert in TBGCs (Tabelle S1) .

um besser zu imitieren in vivo
Tumorverhalten, I Gel Kollagen Typ verwendet wurde, um die Beziehung zwischen Fibroblasten und die invasive Kapazitäten von BGC-823-Zellen und TBGCs zu ermitteln. Kollagen Typ I Gel wurde mit Fibroblasten auf den Transwell-Einsätze vorbereitet (siehe Materialien und Methoden S1). Fibroblast-beladenen Gele wurden für 7 Tage und dann GFP-markierten Tumorzellen wurden auf das Gel ausgesät und kultiviert für die nächsten 7 Tage. Inspektion der geernteten Gele ergab, dass die Tumorzellen in den Kollagengelen eingedrungen war. Wenn die Gele mit Fibroblasten geladen wurden, zeigten TBGCs mehrere verbesserte invasive Kapazität als BGC-823-Zellen, wie durch die Anzahl der Zellen zeigte, daß die Gele (Abbildung S1.2) infiltriert.

4. TBGCs Ausgestellte Cisplatinresistenz

Als nächstes untersuchten wir die Empfindlichkeit der TBGCs Standardmagenkrebs Chemotherapeutika. Viable BGC-823-Zellen und TBGCs wurden nach 24 Stunden der Exposition gegenüber Cisplatin bestimmt (0, 20, 40, 60, 80 &mgr; M) durch den Einbau von MTS messen. Die Ergebnisse zeigen, dass TBGCs bemerkenswerte Resistenz gegenüber Cisplatin, während wenige BGC-823 Zellen überlebten ausgestellt, wenn die Cisplatin-Konzentration auf 40 &mgr; M erhöht wurde ( p
< 0,001) (Abbildung 3.1). Viable TBGCs konnte sogar festgestellt werden, wenn der Cisplatin-Konzentration bis zu 200 uM erhöht wurde (Daten nicht gezeigt). Wir führten Zell-Apoptose-Analyse mittels Durchflusszytometrie Cisplatinresistenz zu validieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Überlebensrate von TBGCs etwa 42,40% betrug im Vergleich zu 13,80% für BGC-823-Zellen nach der Behandlung mit 40 uM Cisplatin für 24 Stunden (Abbildung 3,3-3,4). wenn allerdings behandelt mit 5-FU, gab es keine signifikanten Unterschiede in der Tumorhemmung zwischen TBGCs und BGC-823-Zellen nach dem MTS-Assay (Bild 3.2). Beide Tumorzellen Chemoresistenz zu 5-FU (Abbildung 3.2) unter Beweis gestellt.

5. TBGCs Exhibit In-vivo-
Lymph Node Anschaffungsneigung

die in vivo
Verteilung von TBGCs zu bestimmen, 5 x 10 ^{5 BGC-823-Zellen oder TBGCs injiziert wurden in die Schwanzvene von Balb /c Mäusen. Zwei Wochen nach der Injektion, die Varianz in Hilfsmittels und zervikalen Lymphknoten Metastasen wurde in beiden Gruppen beobachtet, wie durch Beurteilung eines fluoreszierenden Indikators (Figur 4.3A-F) angegeben. GFP-positive Zellen wurden in dem Hilfs und inguinalen Lymphknoten in beiden Gruppen (Abbildung 4.3A, B, D, E) vorhanden. Allerdings GFP-positive Zellen nur in den Lungen der Mäuse in der BGC Gruppe erschien (Abbildung 4.3c, F).}

In Woche 5, zusätzlich zu den umfangreichen Invasion in die Lymphknoten, war Organinfiltration auch beobachtete. Weitere Lymphknotenbefall wurde in der TBGC Gruppe als die BGC Kontrollgruppe zu jedem Zeitpunkt (Abbildung 4.1, Video S1) beobachtet. Diese Lymphknoten wurden bestimmt pan-CK positiv (Abbildung S2.1) zu sein. Wir beobachteten auch unterschiedliche TBGC und BGC Verteilung in den Organen. TBGCs wurden auf die Magen-Darm-Gewebe beschränkt, während BGCs in die Lunge und Darm besiedelt (Abbildung 4.2A-H). In Woche 5 wurde Darm-Metastasen zuerst in 3/4 Mäusen beobachtet, die mit TBGCs injiziert wurden, während nur 25% Mäusen nach Injektion BGC (Abbildung S2.3) sichtbar Darm-Metastasen nachgewiesen.

Wie die Tumoren entwickelt, die mittlere Anzahl der Darm TBGC Metastasen erhöht (5,6 ± 3,911 vs
3,5 ± 1,914 BGCs in Woche 8; 6,33 ± 1,52 vs
5,6 ± 1.342 bei Woche 10) (Abbildung S4.2) . Interessanterweise 3 von 5 Mäusen in TBGC Gruppe zeigte megascopic Neoplasmen im Gastrum nach 10 Wochen, die nicht in der Gruppe beobachtet wurde, BGC. Megascopic Lungenmetastasen in 3 von 4 BGC Mäusen in Woche gefunden wurden 8 jedoch keine sichtbaren TBGC Lungenmetastasen wurden in Woche beobachtet 10 (4.2A-H). Eine mikroskopische Untersuchung ergab die Infiltration von TBGCs in die Hals-und axillären Lymphknoten bereits am 1. Woche nach der Schwanzveneninjektion, während BGCs mehr Zeit (3 Wochen) erforderlich, um diese Lymphknoten (Abbildung 4.1) eingeben. Fünf Wochen nach der Zellinjektion, Lungeninfiltration wurde in der BGC-Gruppe beobachtet. Allerdings wurden in Organen nachgewiesen keine TBGCs bis 10 Wochen nach der Injektion (Abbildung 4.2B, F, Abbildung S2.3).

Die immunhistochemische Färbung zeigte die allmähliche Zunahme von E-Cadherin in den Lymphknoten der TBGC Gruppe , während E-Cadherin-Expression verringerte sich leicht in der BGC-Gruppe ( p
< 0,01) (Abbildung 4.4A-P). Die Unterschiede waren signifikant bei 8 und 10 Wochen, in denen E-Cadherin-Expression viel höher in der TBGC Gruppe war im Vergleich mit der BGC-Gruppe (Abbildung 4.5). Die Expression von β-Catenin auch mit der Zeit in der TBGC Gruppe erhöht, die nach 8 Wochen ihren Höhepunkt erreicht und dann leicht zurückgegangen (Abbildung 4.5). (Abb. 4.5)

6; Die Ergebnisse zeigen auch β-Catenin-Expression in der TBGC Gruppe bei 5, 8 und 10 Wochen (0,01 p
<) erhöht. TBGCs Low Tumorbildung Nachgewiesene aber hohe Lymphknotenmetastase Kapazität in unserem Subkutan Tumorigenesis Modell

Da Tumorzellen eher Neoplasmen zu bilden, wenn sie subkutan implantiert, (GFP +) TBGCs und die BGCs wurden von 5 × 10 Injektion implantiert ^{5 lebensfähige Tumorzellen in das subkutane Gewebe auf beiden Seiten der Brust. Nascent Tumoren in der BGC-Gruppe wurden bereits 3 Tage nach der Implantation festgestellt, und alle Mäuse in der BGC Gruppe Tumoren an den Standorten der Implantation nach 1 Woche Inkubation (Abbildung 5.1A) entwickelt. Es fällt auf, dass die implantierten TBGCs keine nicht nachweisbaren Tumoren bis 8 Wochen (Abbildung 5.1, Video-S2) ergab. Eskalierenden die TBGC Dosis 5-10 × 10 6 implantierten Zellen nur für die Bildung von kleinen Klumpen Tumor geführt und der trägen Augmentation des Tumorvolumens zusammen mit der Inkubationszeit. Zusätzlich Mäuse in der Gruppe, der HGF wurden moribund, offenbar wegen der erhöhten Tumorlast.
(Daten nicht gezeigt)}

Ganzkörper Autopsien bei jedem Zeitintervall anzeigen, das TBGCs anstelle von sichtbaren Primärtumoren, die benachbart infiltriert und distalen Lymphknoten, während BGC generierte Tumormassen wurden auf intakte fibrotische Kapseln an den Injektionsstellen (Video S2) beschränkt. Die regionale globale Lymphknoten Metastasen in der TBGC Gruppe wurden bereits 2 Wochen nach der Implantation gefunden, während regionalen Lymphknoten-Metastasen bei 4 Wochen in der BGC-Gruppe (Abbildung 5.2) nachgewiesen wurden. Kaplan-Meier-Analyse zeigt, dass die TBGCs demonstriert höheres Risiko der Entwicklung in Lymphknotenmetastasen als BGCs (Abbildung 5.2).

Umfangreiche Darm-Metastasen bei 8 Wochen in der TBGC Gruppe in allen Mäusen auch offensichtlich waren und danach (Abbildung S4.1 Abbildung S4.4). Die durchschnittliche Zahl der Darm Knötchen war 5,50 ± 1,73 in Woche 8 und 7,33 ± 1,79 in Woche 10. Im Gegensatz dazu zeigten nur 1 Maus in der Gruppe 3 BGC intestinalen Infiltrationen in Woche 9 (Abbildung S4.1).

GFP-Tracing zeigt ohne regionale Lymphknoten Infiltration an der Injektionsstelle Bildung lokalen Tumor in der BGC-Gruppe. Im Gegensatz dazu erschien TBGCs in den axillären Lymphknoten, sondern grüne Fluoreszenz wurde in Gewebe an der Injektionsstelle (Bild 5.3) nicht erkannt. In Woche 6 akkumulierten TBGCs-GFP in der rektalen und mesenterischen Lymphknoten. Jedoch nur 1 Maus mit positiven Metastasierung Mesenteriallymphknoten wurde in der BGC-Gruppe festgestellt. pan-CK immunhistochemischen Färbung zeigt an, dass TBGCs auf regionale metastasiert (früh) und distalen Lymphknoten (spät), während BGCs nur in die regionalen Lymphknoten (Ende) innerhalb des Experiments Periode (Abbildung S4.5) metastasiert. TBGCs auch in einer Woche in den Darm metastasiert, wenn es nicht in der BGC Gruppe gefunden wurde.

HE-Färbung zeigt, dass abnormale Zellen während der frühen Stadien in der TBGC Gruppe und späten Stadien in die in die regionalen Lymphknoten erschienen BGC-Gruppe (Abbildung s4.6). Immunhistochemische Proteinexpressionsanalyse nach 2 Wochen zeigt die Herunterregulierung von E-Cadherin und β-Catenin und verbesserte Vimentinexpression in TGBC-LNs im Vergleich zu BGC-Neoplasie. Diese Ergebnisse wurden durch Western-Blot-Analyse der Gewebeproben bestätigt, die nicht E-Cadherin in TGBC-LNs hat erkennen; mittlerweile wurde N-Cadherin auch in TGBC-LNs (Abbildung S3.3-3.4) scharf nach unten reguliert.

Die immunhistochemische Färbung zeigt die allmähliche Zunahme von E-Cadherin in den Lymphknoten der TBGC Gruppe wie die Zeit voranschritt, während die Expression von E-Cadherin leicht in der BGC-Gruppe verringerte sich ( p
< 0,01) (Abbildung 5.4).

• PLoS ONE: Prohibitin Expression Deregulation in Magenkrebs ist im Zusammenhang mit der 3 'untranslatierten Region 1630 C > T Polymorphismus und Copy Number Variation
• PLoS ONE: Die Aktivierung von mesenchymalen Stammzellen durch Makrophagen Prompts menschlichen Magenkrebswachstum durch NF-kappaB-Bahn