PLoS ONE: normale fibroblasten Laten E-cadherine Verlies en verhoog lymfekliermetastasen in Gastric Cancer

De abstracte

Achtergrond

Een tumor wordt beschouwd als een heterogeen complex in een driedimensionale omgeving die spoelen met pathofysiologische en biomechanische signalen. Cel-stroma interacties gids ontwikkeling en vorming van tumoren. Hier evalueren we de bijdragen van normale fibroblasten aan maagkanker.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Door coculturing normale fibroblasten in monolagen van BGC-823 maagkanker cellen, tumorcellen sporadisch korte ontwikkeld spindle -zoals morfologische kenmerken en demonstreerde verbeterde proliferatie en invasieve potentieel. Bovendien is de getransformeerde tumorcellen aangetoond verminderde tumorvorming en verhoogde lymphomatic en intestinale metastatisch potentieel. Niet-getransformeerde BGC-823 cellen daarentegen, toonden primaire tumorvorming en vertraagde darmen en lymfeklieren invasie. Ook waargenomen E-cadherine verlies en de opwaartse regulatie van vimentine expressie in de getransformeerde tumorcellen, die uit de toename van metastase geïnduceerd door epitheliale naar mesenchymale transitie.

Conclusie

Collectief , onze gegevens blijkt dat de normale fibroblasten voldoende epitheliale-to-mesenchymale transitie induceren in kankercellen, hetgeen leidt tot metastase

Visum:. Xu w, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et al. (2014) normale fibroblasten induceren E-cadherine Verlies en verhoog lymfekliermetastasen bij maagkanker. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10.1371 /journal.pone.0097306

Editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Verenigd Koninkrijk

Ontvangen: 10 december 2013; Aanvaard: 16 april 2014; Gepubliceerd: 20 mei 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Nationale Special Health Fund Key (http://program.most.gov.cn; No.200802112), het Nationaal Comité Science Fonds (http://www.nsfc.gov.cn; algemene project nr .81372302 No.81272120), het ministerie van Volksgezondheid Fonds (http://program.most.gov.cn; No.2007A093), de Key Project van de provincie Zhejiang (http://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). The Natural Science Fund van de provincie Zhejiang (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 en Z2080514), en de Traditionele Chinese Geneeskunde Bureau Fund (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

metastasen zijn verantwoordelijk voor wel 90% van kanker-gerelateerde mortaliteit. Veel patiënten die geen bewijs van metastase tonen de initiële diagnose uiteindelijk ontwikkelen metastase. Hoewel uitzaaiingen veroorzaken de meeste sterfgevallen door kanker, dit proces blijft een van de meest raadselachtige aspecten van de ziekte.

uitgezaaide tumorcellen in te voeren tissue via extravasatie. Het weefsel echter onduidelijk ondergaat processen waarmee de cellen zijn ingebed in de weefselmatrix en in direct contact met stromale cellen, waarvan de meeste normale fibroblasten komen. Tumorcellen alle kansen in contact met stromale cellen, zoals neoplastische en metastatische cellen [1] komen. Dit leidt tot onderlinge overspraak met normale fibroblasten in het weefsel.

Fibroblasten zijn de meest voorkomende stromale cellen en stimuleren ze de micro en dienen als een rijke bron voor paracriene pad tijdens tumorigenese en progressie. De effecten van normale fibroblasten op tumorcellen betwist. Vermeld is dat normale fibroblasten onderdrukken de kwaadaardige omzetting van geïmmortaliseerde prostaatepitheel [2], terwijl in borsttumoren, fibroblasten transformeren ductaal carcinoom in invasief carcinoom [3].

Dit onenigheid blijkt dat de invloed van fibroblasten op tumorcellen is anders dan CAF (kanker geassocieerde fibroblasten). Voor deze studie hebben we tumorcellen tezamen gekweekt met normale fibroblasten in petrischalen om bootsen hoe tumorcellen contact fibroblasten. Ons gericht op de bijdrage van normale fibroblasten maagkanker. We gekweekte normale fibroblasten dichte monolagen, die daarna met tumorcellen werden verspreid om metastatische tumorcellen nabootsen vormen. Onze hypothese was dat de hoge verhouding van fibroblasten tot tumorcellen kan nabootsen weefsels waarin gemetastaseerde tumorcellen bevinden. Aldus dermale fibroblasten van gezonde individuen werden gebruikt om de cellulaire omgeving produceren. De maagkanker cellijn, BGC-823, werd hier gebruikt omdat het morfologisch onderscheiden van fibroblasten.

Materialen en methoden

Ethische Verklaring

De primaire menselijke huid weefsels werden verkregen van kinderen die besnijdenis ondergingen na verkregen schriftelijke toestemming van hun verzorgers, die werd opgenomen in hun medische dossiers. Dit experiment werd beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele review board van de Tweede Affiliated Hospital van Zhejiang University School of Medicine goedgekeurde (ethische code: Research 2013-047). De patiënten die in deze studie waren voorzien van een afschrift van de schriftelijke informed consent en gaf toestemming om te publiceren.

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de Raad voor Wetenschap en Technologie van China. De studie protocol werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van Zhejiang University.

reagentia en antilichamen

Penicilline G /streptomycine, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), Triton X-100, runder serumalbumine, collagenase type I en trypsine werden aangekocht bij Jinuo (China). Hoog glucose DMEM werd verkregen van Gibco (China) en foetaal runderserum (FBS) werd gekocht bij Gibco (SA). Cisplatine, 5-fluoruracil, puromycine en collageen type I werden verkregen van Sigma (USA). Cisplatine werd om voorraadoplossingen die vervolgens bij -20 ° C werden opgeslagen maken opgelost in dimethylformamide (DMF), 5-fluoruracil in DMSO en puromycine in PBS. Collageen type I (5 mg /ml) werd verdund tot 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol HCl) in PBS werd verkregen van Roche en geit anti-muis en konijn IgG secundair antilichaam-TIRTC en secundaire antilichamen werden verkregen van Bio-ZSGB (China). Anti-menselijk-E-cadherine konijn (ab40772), anti-humaan vimentine-konijn (ab92547) en anti-humaan-β-catenine konijn antilichamen (ab9274) werden verkregen van Abcam (UK). Antihumaan-pan-CK muizenantilichaam (C11) en N-cadherine konijn antilichaam (C4061) werden verkregen van Cell Signaling Technology (China) en antihumaan-β-actine en secundaire geit anti-konijn-antilichamen werden verkregen van Boster (China) . Antilichamen werden verdund met 5% FBS be- concentraties tenzij anders vermeld.

Celkweek

De gevestigde cellijn, de menselijke maagkanker BGC-823 cellen die in ons experiment werden gekocht bij de celbank Guangzhou Instituut voor medische biologie en gezondheid. De cellen werden ontdooid en gepasseerd voor 4-5 keer en dan gebruikt in de co-kweek-experimenten. Primaire huidfibroblasten werden verkregen uit de chirurgische specimens van de kinderen die de besnijdenis had ondergaan en voorzien van informed consent. Fibroblasten werden na de derde doorgang (binnen 50 passages), gekweekt in hoog glucosegehalte bevattend DMEM 10% FBS, en in een bevochtigde incubator (5% CO _{2) bij 37 ° C. Het celmedium werd vervangen om de dag.}

Voor het genereren van de TBGCs, de fibroblasten (FBS) en BGC-823 cellen werden tezamen gekweekt bij een verhouding van 10:01 gedurende nog 10 dagen na de gekweekte cellen confluentie bereikten. Koepel vorming werd waargenomen in de co-kweeksysteem. Het celmengsel werd vervolgens gepasseerd door trypsinisatie met verse fibroblasten (1 x 10 ^{6 cellen /ml). Tijdens de tweede en volgende passages schijnbare vorming doom en de gesuspendeerde rondvormige cellen zich vormden die diverse morfologische kenmerken en langdurigere verbinding na behandeling vertoonden. Na de vijfde passage van de gemengde gesuspendeerde cellen en dichte normale fibroblasten, uniform, kort, spindel-achtige cellen aangeduid als "TBGCs" werden geproduceerd en niet aan te tonen morfologische terugkeer naar BGC-823 cellen tot >. 10-15 passages}

Proliferation Assay

Exponentieel groeiende cellen werden gezaaid in 96-well platen gedurende nog 6 dagen incubatie bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO _{2 atmosfeer. Celproliferatie werd in vijfvoud dagelijks gemeten door pipetteren 20 gl CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, USA) in elk putje dat 100 ul hoog glucose DMEM bevatten, daarna werden de cellen gedurende nog 2 uur alvorens de relatieve absorptie bij 490 nm met behulp van een microtiter plaatlezer.}

remming Assay

Vijf duplicaties van exponentieel groeiende cellen werden gezaaid in een 96-putjes platen en geïncubeerd gedurende 24 uur. Na 24 uur werd het medium vervangen door verschillende concentraties van geneesmiddelen (0-80 uM) en gekweekt gedurende nog 24 uur. Geneesmiddeltoxiciteit werd geëvalueerd door het meten van het aantal levensvatbare cellen met behulp van de proliferatie-assay hierboven beschreven.

Krassen Assay

De cellen werden gezaaid in 24-putjes platen (5 x 10 ^{4 cellen /well) en gekweekt tot confluentie. Pipetpunten werden gebruikt om krassen te genereren. PBS werd gebruikt celresten, vervolgens vervangen FBS-vrij medium te verwijderen. Beelden werden verkregen gedurende 3 opeenvolgende dagen. De breedte van de kras werd gemeten met behulp van ImageJ 1.47 software voor Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) en uitgezet als de scratch afstand per dag.}

Migratie en Invasion Assay

celmotiliteit het testen werd uitgevoerd met Transwell inzetstukken (8 urn poriegrootte) (Corning, USA). Cellen-GFP (Green Fluorescent Protein) (1 × 10 ^{5/500 pl) werden gesuspendeerd in FBS-vrij medium en boven de inserts in drievoud geplaatst, met 800 ul kweekmedium eronder geladen. Na een nacht incubatie werden de inserts 3 x gewassen met PBS en afgeveegd met een wattenstaafje bevochtigd waarboven gefixeerd met 4% PFA in en waargenomen met een fluorescentiemicroscoop (Olympus, Japan). Dezelfde procedure werd gebruikt om de invasie assay uit te voeren, maar inserts die werden vooraf bekleed met Matrigel (BD, USA) werden gebruikt. Beide bepalingen werden gekwantificeerd als het aantal getelde cellen in 5 willekeurige velden (200 x vergroting).}

Apoptose Assay

Apoptotische cellen werden gemeten met de Annexine V-FITC apoptose detectiekit (Keygen, China) volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden ofwel onbehandeld of behandeld met geneesmiddelen gedurende 24 uur en daarna geoogst, tweemaal met PBS gewassen, opnieuw gesuspendeerd in bindingsbuffer met 5 ul FITC-Annexine V en 5 pi PE en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Analyse werd uitgevoerd met flowcytometrie (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).

Kwantitatieve real-time PCR

Nucleaire extracten werden bereid met behulp van de RNeasy mini kit volgens instructies van de fabrikant. Gezuiverd RNA monsters (1 pg) in DEPC water werden reverse-getranscribeerd met behulp van de PrimeScript II 1 Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, China). RT-PCR amplificatie en werden uitgevoerd met behulp van SYBR Premix Ex Taq II kit (Takara).

Een 20 gl reactiesysteem bevattende 1 pi verdunde cDNA monsters, 10 pi SYBR Premix Ex Taq II (2 x), 0,4 pl ROX Reference Dye (50 x), 7 gl steriel dubbel gedestilleerd H _{2O, en 1 pl voorwaartse en omgekeerde primers (zie Materialen en Werkwijzen S1) bereid en geëvalueerd middels smeltcurveanalyse en de vergelijkende drempelcyclus (Ct) methode. De volgende cyclingcondities werden gebruikt: 95 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 seconden en 58 ° C gedurende 1 minuut. GAPDH werd gebruikt als controle gen.}

Western blotanalyse

Eiwitten werden geëxtraheerd uit exponentieel groeiende cellen en primaire weefsels. De extracten werden gekookt in ladingsbuffer, gescheiden op 10% Tris-HCl SDS-polyacrylamidegels en overgebracht naar nitrocellulose membranen (Millipore, USA) onder toepassing van standaardwerkwijzen. De membranen werden geblokkeerd met 5% vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBST) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Membranen werden gewassen met TBST en gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met primaire antilichamen tegen E-cadherine (1:5000), vimentine (1:5000), β-catenine (1:5000), N-cadherine (1:1000), en β-actine (1:1000). Na wassen 3 x met TBST, secundaire geit anti-konijn (1:1000) werd toegevoegd en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Tenslotte werden immuuncomplexen gevisualiseerd door chemiluminescentie behulp ECL (Electro Chemical Luminescence) (Millipore). De eiwitconcentratie werd genormaliseerd aan ß-actine.

histologische en immunohistochemische analyses

De monsters werden snel bevroren in vloeibare stikstof bewaard bij -80 ° C, in 4% PFA gefixeerd en gesegmenteerd naar een dikte van 10 urn (LEICA, Duitsland).

voor hematoxyline en eosine (HE) kleuring, de gedeparaffineerde glasplaatjes werden gekleurd met hematoxyline gedurende 15 minuten, gewassen 3 x met PBS, zuur alcohol gedurende 5 seconden en eosine gedurende 5 minuten (Boster, China).

voor immunohistochemische kleuring, de dia's werden gerehydrateerd en warmte-geïnduceerde herstel van de epitoop werd uitgevoerd in citraatbuffer met behulp van een snelkookpan (20 minuten bij 80 pKA), geblokkeerd met 3 % H _{2O 2 gedurende 15 minuten, en daarna werd de normale geit serum toegepast (30 minuten bij kamertemperatuur). Glaasjes werden geïncubeerd in de volgende primaire antilichamen: anti-E-cadherine (1:250), anti-vimentine (1:250), anti-β-catenine (1:250) en anti-pan-CK (1:250 ). De monsters werden overnacht geïncubeerd bij 4 ° C, tweemaal gespoeld met PBS en geïncubeerd met het secundaire antilichaam gedurende 2 uur bij 37 ° C. DAB Chromogen Plus kit (Boster) werd gebruikt voor alle antigenen te detecteren. De objectglaasjes werden tegengekleurd met hematoxyline, uitgedroogd, en gemonteerd met dekglaasjes met neutrale Balata. Beide analyses werden afzonderlijk uitgevoerd door pathologen en clinici die blind voor de steekproef groepen waren. Geschillen werden opgelost door consensus.}

Immunofluorescentie en confocale microscopie

De cellen werden uitgezet op kamer dia's en de bevroren secties werden gefixeerd met 4% PFA en gepermeabiliseerd met 0,5% Triton X-100. Plaatjes werden geblokkeerd met normaal geitenserum gedurende 1 uur bij 37 ° C, gespoeld en overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 ° C, vervolgens overgebracht en geïncubeerd met geit anti-muis en anti-konijn-TIRTC antilichamen gedurende 1 uur bij 37 ° C in het donker. Dia's werden gewassen met behulp van glycerine en gemonteerd met dekglaasjes. Kernen werden tegengekleurd met DAPI. Fluorescentie werd gedetecteerd met een confocale laser scanning microscoop (Olympus). De gedeparaffineerde vriescoupes werden gekleurd met DAPI en geanalyseerd met behulp van een microscoop immunofluorescentie.

Animal Model

Tachtig vier weken oude vrouwelijke BALB /c muizen werden gekocht van de Animal Research Center van Shanghai en onderhouden bij het proefdier centrum van de Zhejiang Academie van Medische Wetenschappen. Volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren de Raad van Wetenschap en Technologie van China, werden alle dieren onder aseptische steriele omstandigheden gehouden en geautoclaveerd voedsel en water in overeenstemming toegediend met de beginselen van Laboratory Animal Care van Zhejiang University. Vierenveertig muizen werden in het subcutane model, en waren gelijkmatig verdeeld in controle- en experimentgroepen. BGC-GFP werden gebruikt als controle waarbij de TBGC-GFP werden gebruikt als het experiment. De tumorcellen werden geoogst tijdens de groeifase en gesuspendeerd in FBS-vrij medium (1 x 10 ^{6 cellen /ml). Cellen werden gepipetteerd eencellige suspensies en elke 500 pl oplossing werd subcutaan geïnoculeerd op beide zijden van de borst. Muizen werden elke 2 weken tot 10 weken gedood en pathologische onderzoeken werden uitgevoerd. Alle muizen werden elke 3 dagen gewogen. Alle operaties werden uitgevoerd onder 1% natrium pentobarbital en alle inspanningen geleverd om het lijden te minimaliseren.}

Zesendertig muizen werden in ader injectiegroep voor de beoordeling van distributie kanker (18 muizen in BGC-GFP controlegroep en 18 muizen in TBGC-GFP experiment groep). 500 ul celsuspensie (5 x 10 ^{5 cellen) geïnjecteerd in de staartader van naakt muizen. De muizen werden gedood op 2 nd, 5 e, 8 e en 10 e weken voor pathologisch onderzoek.}

Statistische analyse

Experimentele gegevens werden verzameld en ingevoerd in spreadsheets. Normaliteit testen werden uitgevoerd voor het vergelijken van de data. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van t
test van Student. One-way variantie-analyse werd gebruikt om te vergelijken > 3 groepen, en de methode Tukey's werd gebruikt voor de post-hoc
vergelijkingen van groepen. In deze studie, p
< 0,05 wordt als statistisch significant. SPSS 20.0 voor Windows (IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) werd gebruikt om alle statistische analyses uitgevoerd. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) werd gebruikt om alle grafische presentaties te genereren

Resultaten
<. h3> 1. Morfologische veranderingen in BGC-823 cellen nabootsen stromacellen

fibroblasten (FBS) en BGC-823 cellen werden tezamen gekweekt bij een verhouding van 10:01 gedurende nog 10 dagen na de gekweekte cellen confluentie bereikten. Het celmengsel werd vervolgens gepasseerd door trypsinisatie met verse fibroblasten (1 x 10 ^{6 cellen /ml) (figuur 1,1). Koepel formatie in de BGC-823 cellen werd waargenomen na de eerste passage. Tijdens de tweede en volgende passages, gesuspendeerd rondvormige cellen zich in het gekweekte systeem: sommige samengevoegd tot clusters of klonters en werden losjes verbonden met het oppervlak van de fibroblasten. De parallel-gekweekte BGC-823 cellen toonde slechts een paar rondvormige cellen aan de basis waarop de cultuur overvol geworden. Het gemengd geschorst cellen vertoonden diverse morfologische kenmerken en langdurige bevestiging na passage. Deze cellen aangetoond hetzij een geplaveide-achtige uitstraling vergelijkbaar met BGC-823 cellen of korte spindel-achtige functies. Uniform, korte, spindel-achtige cellen werden geproduceerd door de passage van de gemengde gesuspendeerde cellen en dichte normale fibroblasten. Daarentegen passage van het supernatant van de BGC-823-cellen alleen aangetoond puin na 24 uur kweken, in zeer geringe hoeveelheden cellen overleefden kasseien-achtige klonen Soortgelijke ouderlijke BGC-823 cellen (Figuur 1.3A-H) te vormen.}

Verdere experimenten werden uitgevoerd om de bron van de gesuspendeerde cellen te bepalen in het systeem tezamen gekweekt. BGC-823 cellen en fibroblasten werden getransfecteerd met GFP-puro cassette en RFP-puro cassette, respectievelijk, en genoemde BGC-GFP en FB-RFP, respectievelijk. Na coculturing, BGC-GFP groeide in multilagen en vormde een koepelachtige structuur. Intussen is de rondvormige of sferoïde cellen die in het medium gesuspendeerd werden overgebracht naar kweekplaten en voorzien van groene fluorescentie, aangetoond dat langdurige coculturing met fibroblasten induceert BGC transformatie. Rond en sferoïde cellen die in het medium gesuspendeerd werden eveneens waargenomen bij met groene fluorescentie en kan worden gepasseerd zonder toevoeging van fibroblasten (Figuur 1.2A-D). Na een aantal opeenvolgende rondes van coculturing, getransformeerd BGC-823 cellen (TBGCs) werden verkregen die meer uniform, kort, en spindel-achtige verscheen. Deze cellen werden daarna gepasseerd zonder toevoeging van fibroblasten. Interessant is dat deze cellen waren meer vatbaar voor bolvormige structuren dan de cellen die groeiden tot confluentie en niet aantoonden morfologische terugkeer naar BGC-823 cellen tot >vormen;. 10-15 passages

Een eerdere studie meldde dat fibroblasten remmen de groei van andere cellen tezamen gekweekt bij in vitro
door het mechanisme van contactremming [4]. In onze experimenten echter normale fibroblasten geen contact-remmen de proliferatie van BGC-823 cellen. In plaats daarvan, FB-RFP's geleidelijk omgekomen bij BGC-GFP proliferatie bij het kweken werd verlengd tot 10 dagen. Daarom werd FB opeenvolgende voedingsbehoefte om doorgang en houden de stabiele productie van TBGCs. We hebben ook waargenomen dat wanneer een kleine hoeveelheid TBGCs de confluente fibroblasten vel werd toegevoegd, de tumorcellen die buiten groeiden werden weggeblazen door de fibroblasten geduwd. In het midden van de tumor kolonie werden de cellen ronde vorm, met slechts losse bijlagen aan de basis (Figuur 1.3A-H).

2. -Mesenchymale overgang van BGC-823 Cell om TBGC

Real-time PCR werd gebruikt om mRNA expressie te analyseren. De resultaten laten zien dat E-cadherine opmerkelijk was downgereguleerd samen met de opregulatie van vimentine in TBGCs. Ondertussen, de uitingen van twist, slak, naaktslak, en N-cadherine waren allemaal opgereguleerd (figuur 1.5). Immunofluorescentie kleuring en Western blot bevestigen E-cadherine verlies en de verhoogde expressie van vimentine, N-cadherine, en β-catenine (figuur 1,4), hetgeen bevestigt dat langlopende epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) komt in TBGCs. E-cadherine is een bewezen kenmerk van EMT en onderhoudt cel-celhechting in het epitheel. E-cadherine schade kan leiden tot de tumor cellen afstoten meer af van de tumormassa.

3. Proliferatie, invasie, en mobiliteit van TBGCs

TBGC proliferatie werd geanalyseerd met behulp van de MTS assay. TBGCs toonde een versnelde proliferatie tarief ( p Restaurant < 0,01) (Figuur 2.1). Flowcytometrie (zie Materialen en Werkwijzen S1) laat zien dat 13% van TBGCs werden vastgehouden in de S-fase, in tegenstelling tot slechts 7% van BGC-823 cellen (Figuur S1.3). De krassen assay geeft aan dat TBGC motiliteit verhoogd ten opzichte van vaderlijke BGC-823 cellen (Figuur 2.2-2.3A-H). TBGC anastomose vereist 3 dagen na het begin van de krassen, terwijl > 4 dagen nodig waren voor BGC-823 cellen ( p Restaurant < 0,05) (Figuur 2.2)

De resultaten van. de Matrigel invasie assays tonen aan dat TBGCs zijn agressiever dan BGC-823 cellen. In totaal 683,67 ± 170,83 TBGCs geïnfiltreerd de Matrigel vergeleken met 188,33 ± 58,62 BGC-823 cellen in de controlegroep ( p
< 0,01) (Figuur 2.4 Figuur 2.5A, B). Echter, TBGCs een significante vermindering van gemigreerde cellen: 2-voudig minder dan BGC-823 cellen volgens de transwell migratieanalyse ( p
< 0,01) (Figuur 2.4 Figuur 2.5C, D). De geschorste aard van de TBGCs zou goed zijn voor deze verlaging, de hechting bedroeg slechts 68,33 ± 10,41% in TBGCs op Matrigel, terwijl 99,77% ± 6,25% in BGC-823 cellen, toonde traag gehechtheid aan de Matrigel oppervlak TBGCs (tabel S1) .

om beter na te bootsen in vivo
gedrag van de tumor, collageen type I gel werd gebruikt om de relatie tussen fibroblasten en de invasieve capaciteiten van BGC-823 cellen en TBGCs vast te stellen. collageen type I gel werd opgesteld op transwell wisselplaten met fibroblasten (zie materialen en methoden S1). -Fibroblast geladen gels werden gedurende 7 dagen en vervolgens werden GFP-gemerkte kankercellen gezaaid op de gel en gedurende de volgende 7 dagen. Inspectie van de geoogste gelen bleek dat de tumorcellen in de collageengels was doorgedrongen. Wanneer de gels met fibroblasten werden geladen TBGCs vertoonden meer uitgebreide invasiecapaciteit dan BGC-823 cellen, zoals blijkt uit het aantal cellen dat de gels geïnfiltreerd (figuur S1.2).

4. TBGCs Tentoongesteld cisplatine Resistance

Vervolgens onderzochten we de gevoeligheid van TBGCs standaard maagkanker chemotherapeutica. Levensvatbare BGC-823 cellen en TBGCs werden na 24 uur blootstelling aan cisplatina (0, 20, 40, 60, 80 uM) bepaald door de incorporatie van MTS. De resultaten tonen aan dat TBGCs tentoongesteld opmerkelijke weerstand tegen cisplatine, terwijl enkele BGC-823 cellen overleefden toen de cisplatinaconcentratie werd verhoogd tot 40 micrometer ( p Restaurant < 0,001) (Figuur 3.1). Levensvatbare TBGCs kan zelfs worden gedetecteerd wanneer de cisplatinaconcentratie was verhoogd tot 200 pM (gegevens niet getoond). We voerden cel apoptose-analyse met behulp van flowcytometrie met cisplatine weerstand te valideren. De resultaten tonen aan dat de overlevingskans van TBGCs ongeveer 42,40% tegenover 13,80% voor BGC-823 cellen na behandeling met 40 uM cisplatine gedurende 24 uur (figuur 3.3-3.4). Echter, bij behandeling met 5-FU, waren er geen significante verschillen tussen tumorremming TBGCs en BGC-823 cellen volgens de MTS assay (figuur 3,2). Zowel tumorcellen aangetoond chemoresistance aan 5-FU (figuur 3,2).

5. TBGCs Exhibit In vivo
lymfkliertest Propensity

Om de In vivo
distributie van TBGCs, 5 x 10 ^{5 BGC-823 cellen of TBGCs werden geïnjecteerd in te bepalen de staartader van BALB /c muizen. Twee weken na injectie variantie Bijkomende en cervicale lymfeknopen metastasen werd waargenomen in beide groepen, zoals blijkt uit de beoordeling van een fluorescerende tracer (Figuur 4.3a-F). GFP-positieve cellen werden gevonden in de hulp- en inguinale lymfeklier in beide groepen (figuur 4.3a, B, D, E). Echter, GFP-positieve cellen zich alleen in de longen van de muizen in de groep BGC (figuur 4.3c, F).}

In week 5, naast doordrong in de lymfeknopen, orgaan infiltratie was waargenomen. Meer lymfeklieren invasie werd waargenomen in de groep dan TBGC BGC controlegroep op elk tijdspunt (Figuur 4,1, Video S1). Deze lymfeklieren waren vastbesloten om pan-CK positief (figuur S2.1) zijn. We zagen ook verschillende TBGC en BGC distributie in de organen. TBGCs werden beperkt tot de Maagdarm weefsels, terwijl BGCs geregeld in de longen en de darmen (Figuur 4.2A-H). In week 5, werd intestinale metastase eerst waargenomen in 3/4 muizen die werden geïnjecteerd met TBGCs, terwijl slechts 25% muizen aangetoond zichtbaar intestinale uitzaaiingen volgende BGC injectie (figuur S2.3).

Als de tumoren ontwikkelden, het gemiddelde aantal intestinale TBGC metastasen verhoogd (5,6 ± 3,911 vs
3,5 ± 1.914 BGCs in week 8; 6,33 ± 1,52 vs
5,6 ± 1,342 in week 10) (Figuur S4.2) . Interessant 3 van 5 muizen in groep TBGC aangetoond megascoops- neoplasmen in de Gastrum na 10 weken, die niet werd waargenomen in de groep BGC. Megascoops- longmetastasen gevonden in 3 van 4 BGC muizen in week 8 zijn echter geen zichtbare TBGC longmetastasen waargenomen in week 10 (Figuur 4.2A-H). Microscopisch onderzoek onthulde de infiltratie van TBGCs in het cervicale en axillaire lymfklieren al 1 week na injectie in de staartader, terwijl BGCs vereist meer tijd (3 weken) om deze lymfeknopen (Figuur 4.1) voeren. Vijf weken na celinjectie werd longinfiltratie waargenomen in BGC groep. Er werden echter geen TBGCs aangetroffen in organen tot en met 10 weken na de injectie (figuur 4.2b, F, figuur S2.3).

Immunohistochemische kleuring gewezen op de geleidelijke toename van E-cadherine in de lymfeklieren van de TBGC groep , terwijl de E-cadherine licht gedaald in de BGC groep ( p Restaurant < 0,01) (Figuur 4.4A-P). Verschillen waren significant op 8 en 10 weken bij E-cadherine-expressie was veel hoger in de TBGC groep vergeleken met de groep BGC (figuur 4,5). De expressie van β-catenine ook toegenomen met de tijd in de TBGC groep, die een piek van 8 weken en dan licht gedaald (figuur 4.5). De resultaten tonen ook verhoogd β-catenine expressie in de TBGC groep 5, 8 en 10 weken ( p
< 0,01). (Figuur 4,5)

6. TBGCs Aantoonbare Low tumorvorming maar High lymfekliermetastasen Capacity in onze Onderhuids Tumorgenese Model

Omdat tumorcellen hebben meer kans om tumoren te vormen wanneer subcutaan geïmplanteerd, (GFP +) TBGCs en de BGCs werden geïmplanteerd door het injecteren van 5 x 10 ^{5 levensvatbare tumorcellen in het onderhuidse weefsel aan beide zijden van de borst. Ontluikende tumoren in BGC groep werden gedetecteerd zo vroeg als 3 dagen na implantatie, en alle muizen in de BGC groep ontwikkelde tumoren op de plaatsen van implantatie na 1 week incubatie (figuur 5.1A). Opvallend is dat de geïmplanteerde TBGCs leverde geen ondetecteerbaar tumoren tot 8 weken (Figuur 5.1, Video S2). Kilocalorieën TBGC dosis 5-10 x 10 6 geïmplanteerde cellen alleen geleid tot de vorming van kleine klonters tumor en de trage vergroting van tumorvolume samen met de incubatietijd. Bovendien muizen BGC groep werd stervende, blijkbaar omdat verhoogde tumorlast (gegevens niet getoond).}

Gehele lichaam autopsies elk tijdsinterval blijkt dat TBGCs plaats van primaire tumoren toegankelijk, geïnfiltreerd de aangrenzende en distale lymfeklieren, terwijl BGC gegenereerde tumormassa's werden beperkt tot fibrotische intacte capsules op de injectieplaatsen (Video S2). De regionale mondiale lymfeklieren uitzaaiingen in de TBGC groep bleken al vanaf 2 weken na implantatie, terwijl de regionale lymfeklieren uitzaaiingen bij 4 weken in de BGC groep (Figuur 5.2) werden gedetecteerd. Kaplan-Meier-analyse blijkt dat de TBGCs toonde een groter risico op het ontwikkelen van in lymfeklier metastase dan BGCs (Figuur 5.2).

Uitgebreide intestinale uitzaaiingen waren ook zichtbaar in alle muizen in de TBGC groep na 8 weken en daarna (figuur S4.1 Figuur S4.4). Het gemiddelde aantal intestinale knobbeltjes was 5,50 ± 1,73 in week 8 en 7,33 ± 1,79 in week 10. Daarentegen, slechts 1 muis BGC-groep een 3 intestinale infiltraties in week 9 (figuur S4.1).

GFP tracing geeft aan lokale tumorvorming in de BGC groep op de injectieplaats zonder regionale lymfeklieren infiltratie. Daarentegen TBGCs verscheen in de axillaire lymfeklieren, maar groene fluorescentie werd niet gedetecteerd in weefsels op de injectieplaats (figuur 5,3). In week 6, TBGCs-GFP verzameld in de rectale en mesenteriale lymfeknopen. Slechts 1 muis met positieve mesenterische lymfeknoop metastasen gedetecteerd in BGC groep. pan-CK immunohistochemische kleuring geeft aan dat TBGCs uitgezaaid naar regionale (vroeg) en distale lymfeknopen (late), terwijl BGCs alleen uitgezaaid naar regionale lymfklieren (laat) binnen het experiment periode (figuur S4.5). TBGCs ook uitgezaaid naar de darmen in een week wanneer het niet werd gevonden in de groep BGC.

HE kleuring toont aan dat abnormale cellen zich in de regionale lymfeknopen in de beginfase van de TBGC groep en late stadia van de BGC groep (Figuur S4.6). Immunohistochemische analyse op eiwitexpressie 2 weken toont de downregulatie van E-cadherine en β-catenine en vimentine verhoogde expressie in TGBC-LNS ten opzichte BGC-neoplasie. Deze resultaten werden verder bevestigd door Western blot analyse van de weefselmonsters, die niet gedetecteerd E-cadherine in TGBC-LNS; Intussen werd N-cadherine fors neerwaarts gereguleerd in TGBC-LNS (figuur S3.3-3.4).

Immunohistochemische kleuring geeft de geleidelijke toename van E-cadherine in de lymfeklieren van de TBGC groep naarmate de tijd vorderde, terwijl de expressie van E-cadherine licht gedaald in de BGC groep ( p Restaurant < 0,01) (Figuur 5.4).

• PLoS ONE: prohibitine Expression Deregulering bij maagkanker wordt geassocieerd met de 3 'onvertaalde gebied 1630 C > T polymorfisme en Copy Number Variation
• PLoS ONE: Activering van mesenchymale stamcellen door macrofagen aanwijzingen Human maagkanker Groei door NF-KB Pathway