PLOS ONE: normala fibroblaster Framkalla E-cadherin Förlust och öka Lymph Node Metastaser i Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

En tumör anses vara en heterogen komplex i en tredimensionell miljö som är i jämnhöjd med patofysiologiska och biomekaniska signaler. Cell-stroma interaktioner styra utvecklingen och generering av tumörer. Här, vi utvärdera bidragen från normala fibroblaster till magcancer.

Metodik /viktigaste resultaten

Genom samodling normala fibroblaster i monolager av BGC-823 gastric cancerceller, tumörceller sporadiskt utvecklat kort, spindel -Som morfologiska egenskaper och visade ökad spridning och invasiv potential. Dessutom de transformerade tumörceller visade minskad tumörbildning och ökad lymphomatic och tarmmetastatisk potential. Icke-transformerade BGC-823-celler, i motsats härtill visade primär tumörbildning och fördröjd tarm och lymfkörtel invasion. Vi observerade också E-cadherin förlust och uppreglering av vimentin uttryck i de transformerade tumörceller, vilket tyder på att ökningen av metastaser framkallades av epitel till mesenkymala övergång.

Slutsats

Kollektivt våra data indikerade att normala fibroblaster inducerar tillräckligt epitelceller till mesenkymala övergång i cancerceller, vilket leder till metastaser

Citation. Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et al. (2014) normala fibroblaster inducerar E-cadherin Förlust och öka Lymph Node Metastaser i magcancer. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10.1371 /journal.pone.0097306

Redaktör: Elad Katz, AMS Biotechnology, Storbritannien

Mottagna: 10 december 2013, Accepteras: 16 april 2014. Publicerad: 20 maj 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Denna forskning har finansierats med bidrag från National Health Key särskild fond (http://program.most.gov.cn, No.200802112), National Science fonden (http://www.nsfc.gov.cn, allmänna projekt nr .81372302 No.81272120), hälsaavdelningen fonden (http://program.most.gov.cn, No.2007A093), Key Project i Zhejiang-provinsen (http://www.zjkjt.gov.cn; Nej 2013C030445 2009C030125). Naturvetenskaps fonden i Zhejiang-provinsen (http://www.zjnsf.gov.cn, No.Y2080001, Y12H160121 och Z2080514), och traditionell kinesisk medicin Bureau Fund (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Metastaser är ansvariga för upp till 90% av cancer-associerad dödlighet. Många patienter som visar inga tecken på metastaser vid den första diagnosen så småningom kommer att utveckla metastaser. Även metastaser orsakar de flesta dödsfall i cancer, förblir denna process ett av de mest gåtfulla aspekter av sjukdomen.

Metastatiska tumörceller anger vävnad via extravasation. Vävnaden dock genomgår oklara processer genom vilka cellerna inbäddade i vävnadsmatrisen och kommer i direkt kontakt med stromaceller, varav de flesta är normala fibroblaster. Tumörceller har alla chanser att komma i kontakt med stromala celler, inkluderande neoplastiska och metastatiska celler [1]. Detta leder till ömsesidig överhörning med normala fibroblaster i vävnaden.

fibroblaster de vanligast förekommande stromaceller, och de stimulerar mikro och fungera som en rik källa för parakrina vägen under tumörbildning och progression. Effekterna av normala fibroblaster på tumörceller ifrågasätts. Det har rapporterats att normala fibroblaster undertrycka maligna omvandlingen av odödlig prostata epitel [2], medan i brösttumörer, fibroblaster omvandla duktal cancer i invasiv cancer [3].

Denna oenighet visar att påverkan av fibroblaster på tumörceller är annorlunda än för CAFS (cancer associerade fibroblaster). För denna studie, samodlades vi tumörceller med normala fibroblaster i Petri-skålar för att efterlikna hur tumörceller kontaktar fibroblaster. Vi fokuserade på bidrag normala fibroblaster till magsäckscancer. Vi odlade de normala fibroblaster för att bilda täta monoskikt, som sedan sprids med tumörceller i syfte att efterlikna metastatiska tumörceller. Vi antog att det höga förhållandet av fibroblaster till tumörceller skulle kunna efterlikna de vävnader där metastaserade tumörceller bor. Således var dermala fibroblaster från friska individer användes för att producera den cellulära miljön. Den magcancer cellinje BGC-823, användes här eftersom det är morfologiskt skiljer sig från fibroblaster.

Material och metoder

Etiska riktlinjer

Primära humana dermala vävnader erhölls från barn som genomgick omskärelse efter att ha erhållit skriftligt informerat samtycke från deras vårdare, som ingick i deras journaler. Detta experiment granskades och godkändes av Institutional Review Board av andra Anslutna sjukhuset i Zhejiang University School of Medicine (etikprövning kod: Forskning 2013-047). De patienter som ingick i studien fick en kopia av skriftligt informerat samtycke och gav tillåtelse att publicera.

Alla experiment genomfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur i rådet för vetenskap och teknik Kina. Studieprotokollet godkändes av Animal Care och användning kommittén för Zhejiang University.

Reagens och antikroppar

Penicillin G /streptomycin, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), Triton X-100, nötkreatur serumalbumin, kollagenas typ I, och trypsin köptes från Jinuo (China). Hög-glukos DMEM erhölls från Gibco (Kina), och fetalt bovint serum (FBS) inköptes från Gibco (SA). Cisplatin, 5-fluoruracil, puromycin, och kollagen typ I köptes från Sigma (USA). Cisplatin löstes upp i dimetylformamid (DMF), 5-fluorouracil i DMSO, och puromycin i PBS, för att göra förrådslösningar som sedan förvarades vid -20 ° C. Kollagen typ I (5 mg /ml) späddes till 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol-HCl) i PBS erhölls från Roche, och get-anti-mus och kanin-IgG, sekundär antikropp-TIRTC, och sekundära antikroppar erhölls från ZSGB-Bio (China). Antihuman-E-cadherin kanin (ab40772), antihuman-vimentin kanin (ab92547), och antihuman-β-catenin kaninantikroppar (ab9274) erhölls från Abcam (UK). Antihuman-pan-CK-mus-antikropp (C11) och N-cadherin kaninantikropp (C4061) erhölls från Cell Signa Technology (Kina), och anti-human-β-aktin och sekundär get-anti-kanin-antikroppar erhölls från Boster (Kina) . Antikroppar späddes med 5% FBS att arbeta koncentrationer, om inte annat anges.

Cell Culture

etablerad cellinje, mänsklig magcancer BGC-823 celler som används i vårt experiment köptes från cellbanken Guangzhou Institute biomedicin och hälsa. Cellerna tinades och passe för 4-5 gånger och sedan användes i de sam-kulturexperiment. Primära dermala fibroblaster erhölls från kirurgiska exemplar av barn som genomgått omskärelse och som informerat samtycke. Fibroblaster användes efter den tredje passagen (inom 50 passager), odlades i hög-glukos DMEM innehållande 10% FBS, och hölls i en fuktad inkubator (5% CO _{2) vid 37 ° C. Cellmediet ersattes varannan dag.}

För generering av de TBGCs, fibroblasterna (FBS) och BGC-823-celler samodlades i ett förhållande av 10:01 i ytterligare 10 dagar efter de odlade cellerna nått konfluens. Kupolbildning observerades i samodlingssystemet. Cellblandningen fick sedan passe genom trypsinisering med färska fibroblaster (1 x 10 ^{6 celler /ml). Under den andra och påföljande passager, uppenbara undergång bildning och de suspenderade rundformade celler visades som uppvisade olika morfologiska egenskaper och långvarig infästning efter passage. Efter den femte passagen av de blandade suspenderade celler och täta normala fibroblaster, enhetlig, korta, spindelliknande celler benämnda "TBGCs" producerades och visade inte morfologisk återgång till BGC-823 celler tills >. 10-15 passager}

proliferationsanalys

Exponentiellt växande celler ympades i 96-brunnsplattor under ytterligare 6 dagars inkubation vid 37 ° C i en fuktad 5% CO _{2 atmosfär. Cellproliferation mättes i quintuplicate varje dag genom att pipettera 20 pl CellTiter 96 vattenhaltig One Solution Reagent (Promega, USA) till varje brunn, som innehöll 100 mikroliter med hög-glukos DMEM, då cellerna inkuberades under ytterligare 2 timmar innan man kan avgöra den relativa absorbansen vid 490 nm med användning av en mikrotiterplattläsare.}

Drug Inhibition Assay

Fem dubblering av exponentiellt växande celler ympades i en 96-brunnars plattor och inkuberades i 24 timmar. Efter 24 timmar ersattes mediet med olika koncentrationer av läkemedel (0-80 ^ M) och odlades under ytterligare 24 timmar. läkemedelstoxicitet utvärderades genom mätning av antalet livskraftiga celler med användning av proliferationsanalysen beskriven ovan.

sprätta Assay

Celler såddes på 24-brunnsplattor (5 x 10 ^{4 celler /brunn) och odlades till konfluens. Pipettspetsar användes för att generera repor. PBS användes för att avlägsna celldebris, ersattes sedan med FBS-fritt medium. Bilder erhölls i 3 på varandra följande dagar. Bredden på scratch mättes med användning av ImageJ 1,47 programvara för Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) och plottades som scratch sträcka per dag.}

migration och invasion Assay

Cell motilitet testmetoder utfördes med hjälp av transwell skär (8 pm porstorlek) (Corning, USA). Celler-GFP (grönt fluorescerande protein) (1 x 10 ^5/500

• PLOS ONE: prohibitin Expression Avreglering i Gastric Cancer är associerad med tre 'otranslaterade regionen 1630 C > T Polymorfism och kopienummer Variation
• PLOS ONE: Aktivering av mesenkymala stamceller från makrofager Frågar Human Gastric cancertillväxt genom NF-kB Pathway