PLoS ONE: Normalus Fibroblastai Skatinti El cad praradimas ir padidinti limfmazgių metastazių skrandžio Cancer

Anotacija

Fonas

navikas yra laikomas nevienalytė kompleksą trimatis aplinkoje, kuri yra Nenuleisti su patofiziologinių ir biomechaninių signalus. Mobilaus stromos sąveika gidas plėtrą ir kartos auglių. Čia mes įvertinti normalių fibroblastų įmokas į skrandžio vėžį.

metodika /Principal išvados

coculturing normalus fibroblastus į monosluoksnių apie bgc-823 skrandžio vėžio ląsteles, naviko ląstelės sporadiškai sukurtas trumpas, verpstės -kaip morfologinės savybės ir parodė sustiprintą platinimu ir invazinių potencialą. Be to, transformuotos naviko ląstelės parodė sumažėjo auglio susidarymą ir padidinti lymphomatic ir žarnyno metastazavusiu potencialą. Netransformuotos BGC-823 ląstelių, atvirkščiai, parodė pirminio naviko formavimąsi ir uždelstas žarnyno ir limfmazgiuose invaziją. Mes taip pat pastebėjo, El cad nuostolių ir vimentin išraiškos ląstelę į transformuotų vėžinių ląstelių, kurie leidžia manyti, kad metastazių padidėjimas buvo sukeltas epitelio-to-mezenchimos perėjimą.

Išvada

Bendrai mūsų duomenys rodo, kad normalus fibroblastai pakankamai sukelti epitelio iki mezenchiminių perėjimą į vėžio ląsteles, dėl ko metastazių

nurodomoji dalis:. Xu W Hu X Chen Z Zheng x Zhang, C Wang G ir kt. (2014) Normalus Fibroblastai Skatinti El cad praradimas ir padidinti limfmazgių metastazių skrandžio vėžio. PLoS ONE 9 (5): e97306. Doi: 10,1371 /journal.pone.0097306

redaktorius: Elad Katzas AMS biotechnologijos, Jungtinė Karalystė

Įstojo: Gruodžio 10, 2013; Priėmė: Balandžio 16, 2014 m Paskelbta: Gegužės 20, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Xu et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijas iš nacionalinio sveikatos Key specialiojo fondo (http://program.most.gov.cn; No.200802112), Nacionalinės mokslo fondo komitetas (http://www.nsfc.gov.cn; bendras projekto Nr .81372302 No.81272120), sveikatos departamentas fondas (http://program.most.gov.cn; No.2007A093), raktas projektas Zhejiang Province (http://www.zjkjt.gov.cn; Nr 2013C030445 2009C030125). Gamtos mokslai fondas Zhejiang Province (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 ir Z2080514) ir tradicinė kinų medicina Biuro fondo (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Metastazių yra atsakingi už iki 90% vėžio susijęs mirtingumas. Daugelis pacientų, kurie parodys jokių metastazių įrodymų pirminės diagnozės ilgainiui sukurti metastazes. Nors metastazių sukelti daugiausiai mirčių nuo vėžio, šis procesas išlieka viena paslaptingiausių aspektus ligos.

metastazavusiu vėžinių ląstelių įvesti audinį per ekstravazacija. Audinių, tačiau, patiria neaiškios procesai, kuriais ląstelės yra įterpta į audinių matricos ir tiesiogiai liečiasi su stromos ląstelėse, kurių dauguma yra normalus fibroblastai. Naviko ląstelės turi visas galimybes susiliesti su stromos ląstelių, įskaitant navikinių ir metastazavusiu ląstelių [1]. Tai veda prie abipusio kryžminio aptarimas su normaliomis fibroblastų į audinį.

Fibroblastai yra gausiausi stromos ląstelės, ir jie stimuliuoja mikroaplinka ir tarnauti kaip turtingas šaltinį paracrine keliu Tumorigenesis ir progresavimo metu. Normalios fibroblastų poveikis naviko ląstelių ginčijamasi. Buvo pranešta, kad normalus fibroblastai slopinti piktybinis konversija įamžino prostatos epitelio [2], o krūties navikų, kad fibroblastai transformuoti latakų karcinoma į invazinės karcinomos [3].

nesutarimų rodo, kad fibroblastų įtaka nuo vėžinių ląstelių yra kitoks, nei už kovos su sukčiavimu strategijoje (vėžio susiję fibroblastus). Dėl Šiame tyrime mes cocultured navikines ląsteles su normaliu fibroblastų Petri lėkštelėse, siekiant imituoti, kaip vėžinių ląstelių susisiekti fibroblastus. Mes sutelktas į normalių fibroblastų indėlį į skrandžio vėžį. Mes išauginti normalų fibroblastus suformuoti tankią monosluoksnių, kurie tuomet buvo platinama su vėžinių ląstelių siekiant imituoti neišplitusios navikines ląsteles. Mes iškėlė hipotezę, kad didelis santykis fibroblastų į vėžinių ląstelių gali imituoti audinius, kur Metastazė naviko ląstelės gyvena. Tokiu būdu, odos fibroblastuose iš sveikų asmenų buvo naudojamas gaminti korinio ryšio aplinką. Skrandžio vėžio ląstelių linija, BGC-823, buvo čia naudojama, nes ji yra morfologiškai skiriasi nuo fibroblastų.

Medžiagos ir metodai

Etikos pareiškimas

Pirminis žmogaus odos audiniuose buvo gauti vaikams, kuriems buvo atlikta apipjaustymą gavusi rašytinį informuoto sutikimo iš jų prižiūrėtojams, kuris buvo įtrauktas į savo medicininiais dokumentais. Šis eksperimentas buvo peržiūrėtas ir institucinės peržiūros valdybos Antrojo filialas ligoninės Zhejiang universiteto medicinos mokyklos patvirtinta (etinės peržiūros kodas: TYRIMAI 2013-047). Įtrauktų pacientų šio tyrimo buvo pateikta su raštiško sutikimo kopijuoti ir davė leidimą publikuoti.

Visi eksperimentai buvo atliekami pagal už rūpestį ir naudojimo laboratorinių gyvūnų nuo mokslo ir technologijų tarybos nustatytas gaires Kinijoje. Tyrimo protokolas buvo patvirtintas gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto Zhejiang University.

Reagentai ir Antikūnai

penicilino G /streptomicino, fosfato buferinis tirpalas (PBS), "Triton X-100, galvijų serumo albuminas, aš kolagenazės tipas ir tripsino buvo įsigytas iš JiNuo (Kinija). Aukštos-gliukozės DMEM buvo gauta iš Gibco (Kinijos), ir buvo įsigytas vaisiaus jaučio serumo (FBS) iš Gibco (SA). Cisplatina, 5-fluorouracilu, puromicino ir kolageno I tipo buvo įsigytas iš Sigma (JAV). Cisplatina buvo ištirpinta dimetilformamido (DMF), 5-fluorouracilo DMSO, ir puromicino PBS, siekiant, kad pradinius tirpalus, kad tada buvo laikomi -20 ° C temperatūroje. I (5 mg /ml) tipo kolageno buvo praskiestas iki 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindolo · HCl) PBS buvo gauta iš Roche ir ožkos anti-pelės ir triušio IgG, vidurinio antikūnų TIRTC ir antriniai antikūnai buvo gauti iš ZSGB-Bio (Kinija). Antihuman-E-cad triušis (ab40772), antihuman-vimentin triušis (ab92547) ir antihuman-β-kateninai triušio antikūnai (ab9274) buvo gauti iš Abcam (JK). Antihuman-visos CK pelės antikūnas (C11) ir N-cad triušio antikūnai (C4061) buvo gauti iš ląstelių Signalizacijos technologijos (Kinija), ir anti žmogaus β-aktino ir antrinė ožkų kovos su triušio antikūnai buvo gauti iš Boster (Kinija) , Antikūnai buvo skiedžiamas 5% FBS dirbti koncentracijas, jei nenurodyta kitaip.

Mobilusis Kultūra

įkurta ląstelių linija, žmogaus skrandžio vėžio bgc-823 ląstelių, naudojamų mūsų eksperimento buvo įsigyti iš ląstelių banką Guangzhou instituto biomedicinos ir sveikatos. Ląstelės buvo atšildyti ir passaged 4-5 kartus ir tada buvo naudojami bendrai kultūros eksperimentams. Pirminiai odos fibroblastai buvo gauti iš chirurginio egzempliorių vaikų, kuriems buvo atliktos apipjaustymą ir teikiamų informuotą sutikimą. Fibroblastai buvo vartojamas po trečio kanalas (per 50 ištraukas), kultivuojamos aukštos-gliukozės DMEM, kuriame yra 10% FBS, bei laikomi drėgnoje termostatą (5% CO _{2), esant 37 ° C temperatūroje. Ląstelių vidutinio buvo pakeistas kas antrą dieną.}

į TBGCs kartos, kad fibroblastai (FBS) ir BGC-823 ląstelės buvo cocultured esant 10:1 santykis už papildomą 10 dienų nuo išaugintų ląstelių pasiekė santakoje. Kupolas formavimas buvo stebimas bendro kultūros sistemoje. Tada ląstelių mišinys passaged iki trypsinization su šviežiomis fibroblastų (1 × 10 ^{6 ląstelių /ml). Per antruosius ir paskesnius ištraukas, akivaizdžiai doom formavimo ir suspenduotų apvalios formos ląstelių atsirado kurie eksponuojami įvairūs morfologiniai požymiai ir ilgą laiką areštas po ištrauka. Po penktojo plaukimo mišrių suspenduotų ląstelių ir tankus normaliomis fibroblastų, tolygiai, trumpas, suklio kaip ląstelių vadinami "TBGCs" buvo gaminamas ir neįrodė, morfologinę sugrįžta į BGC-823 ląstelių, kol >. 10-15 ištraukas}

neplatinimo Analizės

auga eksponentiškai ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių lėkštelėse dar 6 dienas inkubacijos 37 ° C drėgnoje 5% CO _{2 atmosferos. Ląstelių proliferacija buvo matuojamas quintuplicate kiekvieną dieną pagal pipete 20 mikrol CellTiter 96 vandeniniai vienas sprendimas reagentas (PROMEGA, USA) į kiekvieną šulinėlį, kuriame buvo 100 pL aukštos-gliukozės DMEM, tada ląstelės buvo inkubuojamos dar 2 valandas prieš nustatant santykinį absorbciją prie 490 nm, naudojant Antimikrobinėms plokštelių skaitytuvas.}

narkotikų slopinimas Analizės

penki kartojamos eksponentiškai augančių ląstelių buvo pasėjamos per 96-duobučių lėkštelėse ir inkubuojami 24 valandų. Po 24 valandų, vidutinės buvo pakeistas su skirtingų koncentracijų narkotikų (0-80 mikronų) ir kultivuojamos dar 24 valandas. toksiškumas vaistas buvo vertinamas matuojant gyvybingų ląstelių skaičius, naudojant pirmiau aprašytą platinimo tyrimą.

Kasymas Analizės

Ląstelės buvo pasėjamos į 24-duobučių lėkštelėse (5 × 10 ^{4 ląstelių /gerai) ir kultūringas, kad santakoje. Pipetės antgalius buvo naudojamas generuoti įbrėžimų. PBS buvo naudojamas pašalinti ląstelių nuolaužų, išstumtos su FBS-neturinčioje terpėje,. Vaizdai buvo gauti 3 dienas iš eilės. Iš pradžių plotis buvo matuojamas naudojant ImageJ 1.47 programinę įrangą Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) ir brėžiamas kaip įbrėžimams atstumas per dieną.}

Migracija ir invazija Analizės

Mobilusis judrumas Analizavimas buvo atliekama naudojant transwell įdėklai (8 mkm porų dydis) (Corning, JAV). Ląstelės-GFP (Žalioji Fluorescencinis baltymas) (1 × 10 ^{5/500 pl) buvo sustabdytas FBS-neturinčioje terpėje ir dedamas virš trimis egzemplioriais intarpais, su 800 iL mitybinės terpės pakrautas apačioje. Po nakties inkubacijos įdėklai buvo plaunami 3 × PBS ir nuvaloma sudrėkintu tamponu aukščiau, kur fiksuojamas mažesnis nei 4% PFA ir stebėjo naudojant fluorescencinis mikroskopas (Olympus, Japonija). Ta pati metodika buvo naudojama atlikti invazijos testo metu, tačiau buvo naudojami įdėklai, kad buvo precoated su Matrigel (BD, JAV). Abu tyrimai buvo kiekybiškai kaip ląstelių skaičiaus, skaičiuojant 5 atsitiktinių laukų (200 × priartinimas).}

Apoptozę Analizės

Apoptozinės ląstelės buvo matuojamas aneksinu-FITC apoptozė aptikimo rinkinį (Keygen, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelės buvo arba neapdorotas ar apdorotas narkotikų už 24 valandų, ir tada nuimami, plaunama du kartus PBS, sumaišymo surišant buferį, kuriame yra 5 pL FITC prie aneksino V ir 5 mikrol, PE, ir inkubuojami kambario temperatūroje 30 minučių. Analizė atlikta naudojant tėkmės citometrijos (FACSCalibur, Becton Dickinson, JAV).

Kiekybiniai Realaus laiko PGR

Branduolinės ekstraktai buvo parengtos remiantis RNeasy mini komplektas pagal gamintojo instrukcijas. Išgrynintas RNR pavyzdžiai (1 mikrogramo) in DEPC vandens buvo atvirkštinio transkripcija naudojant PrimeScript II 1. kryptis sintezei komplektas (TAKARA, Kinija). AT-PGR ir stiprinimas

20 pL reakcija sistema, turinti 1 iL praskiestus kDNR mėginiai, 10 iL SYBR Pašaro Ex Taq II (2 ×), 0,4 buvo atlikta naudojant SYBR Pašaro ex Taq II komplektą (TAKARA). pL ROX Nuoroda dažai (50 ×), 7 pL sterilus du kartus distiliuotas o _{2O ir 1 iL pirmyn ir atgal gruntai (žr medžiagas ir metodus, S1), buvo parengtas ir įvertintas naudojant lydymosi kreivės analizę ir lyginamoji slenkstinis ciklas (CT) metodas. buvo naudojami šie dviračių sąlygos: 95 ° C temperatūroje 10 minučių, po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 15 sekundžių ir 58 ° C temperatūroje 1 minutę. GAPDH buvo naudojamas kaip valdymo geno.}

Western Blot analizė

Baltymai buvo paimti iš eksponentiškai augančių ląstelių ir pirminių audiniuose. Ekstraktai virti buferinio tirpalo, išspręstas 10% Tris-HCl SDS-poliakrilamido gelyje, ir perkelti ant nitroceliuliozės membranos (Millipore, JAV), naudojant standartinius metodus. Membranos buvo užblokuoti, naudojant 5% be riebalų pieno Tris-buferio druskų tirpalu su Tween-20 (TBST) 30 minučių kambario temperatūroje. Membranos buvo plaunamos TBST ir inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje, turintis pirminių antikūnų prieš E-cad (1:5000), vimentin (1:5000), β-kateninai (1:5000), N-cad (1:1000), ir β-aktino (1:1000). Po plovimo 3 × su TBST, antrinis ožkos anti-triušio (1:1000) buvo pridėta ir inkubuojami 2 valandas kambario temperatūroje. Galiausiai, imuninės kompleksai buvo regimos cheminės liuminescencijos naudojant ECL (Elektro Chemijos liuminescensinės) (MILLIPORE). Baltymų koncentracija buvo standartizuoti beta-aktino.

histologinis ir Imunohistocheminiais analizė

Mėginiai buvo greitai užšaldyti skystame azote, saugomas -80 ° C, nustatytos 4% PFA ir suskirstyta į iš 10 mikronų (Leica, Vokietija) storis.

hematoksilinu ir eozinas (He) dėmių, kad deparaffinized skaidres buvo tamsintas hematoksilinu 15 minučių, nuplauti 3 × PBS, rūgščių alkoholį 5 sekundes, tada eozinas 5 minutes (Boster, Kinija).

imunohistocheminį dažymo, skaidrės buvo rehidrataciją ir šilumos sukelta epitopas paieška buvo atlikta citrato buferio naudojant greitpuodyje (20 minučių 80 pKa), blokavo su 3 % O _{2O 2 15 minučių, ir tada buvo pritaikytas normalus ožkos serumas (30 minučių kambario temperatūroje). Skaidrės buvo inkubuojami šių pirminių antikūnų: Anti-E-cad (1:250), anti-vimentin (1:250), anti-β-kateninai (1:250), ir anti-visos CK (1:250 ). Mėginiai buvo inkubuojami per naktį 4 ° C, skalaujami du kartus su PBS, ir inkubuojami su antriniais antikūnais 2 valandas 37 ° C temperatūroje. TBP Plius Chromogenas komplektas (Boster) buvo naudojamas aptikti visus antigenus. Skaidrės buvo counterstained hematoksilinu, dehidratuoti, ir sumontuoti su coverslips naudojant neutralų balata. Abu tyrimai buvo atskirai atlieka patologai ir gydytojai, kurie buvo aklas atrankinių grupių. Ginčai buvo sprendžiami bendru sutarimu.}

Imunofluorescentinis parsisiųsti ir confocal mikroskopija

Ląstelės buvo padengtas ant kamerinių skaidres, ir šaldytų skyriai buvo nustatytos su 4% PFA ir laidžiomis su 0,5% Triton X-100. Skaidres buvo blokuotos įprastą ožkų serumo 1 valandą 37 ° C temperatūroje, skalaujami ir inkubuojami per naktį su pirminių antikūnų, esant 4 ° C, tada perkelti ir inkubuojami su ožkos anti-pelės ir anti-triušio TIRTC antikūnų 1 valandą 37 ° C temperatūroje tamsoje. Skaidrės buvo plaunami naudojant glicerino ir sumontuoti su dangčiu lapeliai. Branduoliai buvo counterstained su DAPI. Fluorescencija buvo aptiktas naudojant confocal lazeriu skenavimo mikroskopą (Olympus). Į deparaffinized šaldomuoju mikrotomu atpjautuose buvo tamsintas su DAPI ir analizuojami naudojant imunofluorescencinių mikroskopu.

Gyvūnų Modelis

Aštuoniasdešimt keturių savaičių amžiaus Patelė BALB /c pelių buvo įsigyti iš gyvūnų tyrimų centro Šanchajaus ir prižiūrimi tuo eksperimentinės gyvūnų centre Zhejiang akademijos medicinos mokslų. Pasak už rūpestį ir naudojimo laboratorinių gyvūnų nuo mokslo ir technologijų Kinijos Tarybai gaires, visi gyvūnai buvo laikomi aseptinėmis steriliomis sąlygomis ir administruoja AUTOKLAVINIO maistą ir vandenį laikantis laboratorinių gyvūnų priežiūros Zhejiang universiteto principų. Keturiasdešimt keturi pelių buvo naudojami po oda modelį, ir buvo tolygiai paskirstyti į kontrolės ir eksperimento grupėse. Į bgc-GFPs buvo naudojami kaip kontrolės, kur TBGC-GFPs buvo naudoja kaip eksperimentą. Naviko ląstelės buvo surinktos augimo fazėje metu, ir suspenduotos FBS-neturinčioje terpėje (1 × 10 ^{6 ląstelių /ml). Ląstelės buvo pipete į vieno ląstelių suspensijos, ir kiekvienas 500 pL tirpalas buvo po oda, inokuliuojama abiejuose krūtinės pusių. Pelės buvo numarinti kas 2 savaites iki 10 savaičių, ir buvo atlikta patologiniai tyrimai. Visi pelėms buvo pasverti kas 3 dienas. Visos operacijos buvo atliekamos pagal 1% natrio pentobarbitalio ir buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų.}

trisdešimt šeši pelėms buvo naudojami venų injekcijos grupės vėžio platinimo vertinimas (18 pelių BGC-GFP kontrolinės grupės ir 18 pelių TBGC-GFP eksperimento grupėje). 500 pL ląstelių suspensija (5 × 10 ^{5 ląstelės) buvo švirkščiamas į uodegos veną nuogas pelių. Pelės buvo numarinti ne 2 ND, 5 -asis, 8 -osios ir 10 -asis savaičių patologinį tyrimą.}

Statistinė analizė

eksperimentiniai duomenys buvo renkami ir įstojo į skaičiuokles. Normalumo testai buvo atliekami prieš lyginant duomenis. Palyginimai tarp grupių buvo atliktas naudojant Stjudento T
testą. Vienpusis dispersinė analizė buvo naudojamas palyginti > 3 grupes ir Tukey metodas buvo naudojamas post-hoc
palyginimų grupių. Šiame tyrime, P
< 0,05 laikomas statistiškai reikšmingas. SPSS 20.0 for Windows (IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) buvo naudojamas atlikti visas statistines analizes. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) buvo naudojamas generuoti visas grafines pristatymus

Rezultatai
<. H3> 1. Morfologiniai pokyčiai BGC-823 ląstelių Mimick stromos ląstelėse

fibroblastų (FBS) ir BGC-823 ląstelės buvo cocultured esant 10:1 santykis už papildomą 10 dienų nuo išaugintų ląstelių pasiekė santakoje. Tada ląstelių mišinys passaged iki trypsinization su šviežių fibroblastų (1 × 10 ^{6 ląstelių /ml) (1.1 pav.) Kupolas formavimasis BGC-823 ląstelių buvo pastebėtas po pirmojo ištrauka. Per antruosius ir paskesnius ištraukas, sustabdytas apvalios formos, ląstelės atsirado kultūringas sistemos: kai sujungiami į grupes ar gumulėlių ir buvo laisvai prijungti prie fibroblastų paviršiaus. Lygiagrečių kultūringas BGC-823 ląstelių parodė tik keletą apvalių formos ląsteles bazę, kai kultūra tapo perpildytos. Mišraus sustabdytas ląstelės eksponuojami įvairūs morfologiniai požymiai ir ilgalaikis areštas po ištrauka. Šios ląstelės įrodė arba yra akmenimis išvaizda panašus į BGC-823 ląstelių arba trumpų suklio panašias savybes. Tolygiai, trumpas, verpstės, kaip ląstelės buvo gaminamas mišrių suspenduotų ląstelių ir tankus normaliomis fibroblastų ištrauka. Priešingai, ištrauka iš iš BGC-823 ląstelių nuopilo tik parodė, šiukšles po 24 valandų auginimo, kuriose nedideli kiekiai ląstelių išgyveno suformuoti grindiniu-kaip klonai, panašias į tėvų BGC-823 ląstelių (pav 1.3a-H).}

Vėlesni eksperimentai buvo atliekami siekiant nustatyti sustabdyto ląstelių šaltinis cocultured sistema. BGC-823 ląstelės ir fibroblastai buvo pernešta su GFP-puro kasetės ir RFP-puro kasetės, atitinkamai, ir pavadino bgc-GFP ir FB-RFP, atitinkamai. Po coculturing, BGC-GFP išaugo į daugiasluoksniuose ir sudarė kupolo formos struktūrą. Tuo tarpu, apvalios formos arba sferinis ląstelių, kurios buvo sustabdytos žiniasklaidoje buvo perkelti į kultūros plokštės ir ženklinami žalios fluorescencija, o tai rodo, kad ilgalaikis coculturing su fibroblastų skatina bgc transformaciją. Apvalūs ir STIPRIOJO ląstelių, kurios buvo sustabdytos vidutiniu taip pat buvo pastebėtas naudojant žalią fluorescenciją ir gali būti passaged be fibroblastų to (pav 1.2A-D). Po kelių raundus coculturing, transformuotos BGC-823 ląstelių (TBGCs) buvo gauta, kad atsirado daugiau uniformą, trumpas, ir verpstės pavidalo. tada šios ląstelės buvo passaged be fibroblastų to. Įdomu tai, kad šios ląstelės buvo labiau linkę formuoti STIPRIOJO struktūras nei ląstelių, kurios išaugo iki susiliejimo ir neįrodė, morfologinę sugrįžta į BGC-823 ląstelės iki >. 10-15 ištraukas

Ankstesnis tyrimas pranešė, kad fibroblastai slopina kitų ląstelių augimas, kai cocultured in vitro
pagal kontaktinės slopinimo mechanizmą [4]. Mūsų eksperimentų, tačiau, normaliems fibroblastams nebuvo susisiekti-slopina BGC-823 ląstelių proliferaciją. Vietoj FB-RFP palaipsniui žuvo su BGC-GFP platinimu, kai kultivavimas buvo pratęstas iki 10 dienų. Todėl iš eilės FB papildai buvo reikalaujama ištrauka ir išlaikyti stabilią gamybą TBGCs. Mes taip pat pastebėjo, kad kai mažas kiekis TBGCs buvo įtraukta į susiliejantis fibroblastų lapo, naviko ląstelių, kurios augo ne buvo nustumti pagal fibroblastų. Atsižvelgiant į naviko kolonija centre, ląstelės buvo apvalios formos, su tik birių priedus prie pagrindo (pav 1,3a-H).

2. Epitelio-mezenchiminių Perėjimas iš BGC-823 Cell į TBGC

Realaus laiko PGR buvo naudojamas analizuoti iRNR išraiška. Rezultatai rodo, kad e-cad išraiška buvo nepaprastai downregulated kartu su vimentin ląstelę į TBGCs. Tuo tarpu Tvist, sraigė, šliužas, ir N-cad posakiai visi buvo aktyvinama (1.5 pav). Imunofluorescenciniam ir Vakarų dėmė Patvirtinti El cad praradimas ir padidėjo išraiška vimentin, N-cad, ir beta-kateninai (1.4 paveikslas), taip patvirtindamas, kad ilgalaikis epitelio-mezenchiminių perėjimas (EMT) pasitaiko TBGCs. El cad yra įrodytas skiriamasis ženklas EMT ir palaiko ląstelių ląstelių priedą į epitelį. El cad praradimas gali sukelti naviko atsikratytą daugiau ląstelių išjungtas nuo naviko masę.

3. Platinimu, invazija ir mobilumas TBGCs

TBGC platinimu buvo analizuojami naudojant MTS tyrimą. TBGCs parodė pagreitintą platinimo norma ( P
< 0,01) (2.1 pav.) Tėkmės citometrijos (žr medžiagas ir metodus, S1), rodo, kad 13% TBGCs buvo saugomi S fazėje, priešingai nei tik 7% BGC-823 ląstelių (S1.3 pav). Braižymo tyrimas rodo, kad TBGC judrumas padidėjo, palyginti su tėvo BGC-823 ląstelių (pav 2.2-2.3A-H). TBGC Anastomoza reikia 3 dienas po to, kai įbrėžimų pradžios, o > 4 dienas buvo reikalingi BGC-823 ląstelių ( P
< 0,05) (2.2 paveikslas)

rezultatų. Matrigel invazija tyrimai rodo, kad TBGCs yra labiau agresyvūs nei BGC-823 ląstelių. Iš viso 683.67 ± 170,83 TBGCs infiltruoti Matrigel lyginant su 188.33 ± 58.62 BGC-823 ląstelių kontrolinėje grupėje ( P
< 0,01) (2.4 pav pav 2.5A B). Tačiau TBGCs parodė, kad gerokai sumažėtų migravo ląstelių: 2 kartus mažiau nei BGC-823 ląstelių pagal transwell migracijos tyrimo ( P
< 0,01) (2.4 pav 2.5C pav D). Kabinimo pobūdis TBGCs gali atsiskaityti už šio sumažinimo, laikymasis norma buvo tik 68,33 ± 10,41% visų TBGCs apie Matrigel o 99,77% ± 6,25% per bgc-823 ląstelių, parodė lėtai prisirišimą prie Matrigel paviršiaus TBGCs (lentelė S1) .

kad geriau imituoti vivo
navikas elgesys, aš tipo kolageno gelis buvo naudojamas siekiant nustatyti ryšį tarp fibroblastų ir invazinių gebėjimų BGC-823 ląstelių ir TBGCs santykius. Aš tipo kolageno gelis buvo parengta remiantis transwell intarpais su fibroblastų (žr medžiagas ir metodus, S1). Fibroblastų-pakrautas geliai buvo auginamos 7 dienas, ir tada GFP žymėto vėžio ląstelės buvo pasėjamos ant gelio ir kultivuojamos kitas 7 dienas. Apžiūra nuimtų geliai atskleidė, kad vėžinių ląstelių persunkęs į kolageno gelius. Kai geliai buvo pakrautas su fibroblastų, TBGCs eksponuojama daugiau sustiprintą invazinių pajėgumus nei BGC-823 ląstelių, kaip nurodyta ląstelių skaičius, kad infiltruoti geliai (S1.2 pav.)

4. TBGCs Sudėtis parodos cisplatinos Atsparumas

Be to, mes įvertino TBGCs standartinių skrandžio vėžio chemoterapiniai jautrumą. Gyvybingi BGC-823 ląstelių ir TBGCs buvo nustatyti po 24 valandų poveikio cisplatina (0, 20, 40, 60, 80 mikromolių) matuojant MTS įtraukimą. Rezultatai rodo, kad TBGCs eksponuojami nepaprastą atsparumą cisplatina, kadangi nedaug BGC-823 ląstelės išgyveno, kai cisplatina koncentracija buvo padidėjusi iki 40 mikrometrai ( P
< 0,001) (3.1 pav.) Gyvybingi TBGCs netgi gali būti nustatyta, kai cisplatina koncentracija buvo padidėjusi iki 200 mikrometrai (duomenys neparodyti). Mes atlikome ląstelių apoptozę analizę naudojant tėkmės citometrijos patvirtinti atsparumą cisplatiną. Rezultatai rodo, kad išgyvenamumas TBGCs buvo apie 42,40%, palyginti su 13.80% už BGC-823 ląstelių po gydymo 40 mkm cisplatina 24 valandas (3,3-3,4 paveikslą). Tačiau, kai gydomi 5-FU, nebuvo jokių reikšmingų skirtumų naviko slopinimą tarp TBGCs ir BGC-823 ląstelių Pasak MTS tyrimą (3.2 pav). Abu naviko ląstelės parodė Atsparumas cheminėms 5-FU (3,2 pav.)

5. TBGCs Parodų , in vivo
limfmazgio Polinkis

Norėdami nustatyti vivo
paskirstymą TBGCs, 5 × 10 ^{5 bgc-823 ląstelių arba TBGCs buvo įterpiamos į uodega veną BALB /c pelėse. Praėjus dviem savaitėms po injekcijos, dispersija pagalbiniam ir gimdos kaklelio limfmazgiuose metastazių buvo stebimas abiejose grupėse, kaip nurodyta vertinimo fluorescencinio trasuojančius (pav 4.3a-F). GFP-teigiamomis ląstelėmis, buvo nustatyta, kad pagalbinio ir kirkšnies limfmazgių abiejose grupėse (pav 4.3a, B, D, E). Tačiau GFP-teigiamas ląstelės atsirado tik iš BGC grupės pelių (4.3C pav F) plaučius.}

5-ąją savaitę, be to, didelę invaziją į limfmazgius, organų infiltracija taip pat buvo Pastebėjus. Daugiau limfmazgis invazija buvo pastebėtas TBGC grupės nei BGC kontrolinės grupės ne kiekvienu laiko momentu (4.1 pav, vaizdo S1). Šie limfmazgiai buvo nustatyta, kad visos CK teigiamas (S2.1 pav.) Mes taip pat pastebėjo kitokį TBGC ir bgc pasiskirstymą organuose. TBGCs buvo ribojamas iki Virškinimo audinių, o BGCs apsigyveno į plaučius ir žarnyną (pav 4.2a-H). 5-ąją savaitę, žarnyno metastazės buvo pirmasis pastebėjo 3/4 pelių, kurios buvo sušvirkšta TBGCs, o tik 25% pelių parodė matomų žarnyno metastazes šiuos BGC injekcijos (S2.3 pav.)

Kaip augliai sukūrė, padidėjo vidutinis skaičius žarnyno metastazių TBGC (5,6 ± 3,911, vs
3,5 ± 1,914 BGCs 8 savaitę; 6,33 ± 1,52, vs
5,6 ± 1.342, 10 savaitė) (S4.2 paveikslas) , Įdomu tai, kad 3 iš 5 pelių TBGC grupės parodė Megaskopowy navikai į gastrum po 10 savaičių, kuris nebuvo pastebėtas BGC grupei. Padidintas metastazių plaučių buvo aptikta 3 iš 4 bgc pelių 8 savaitę, tačiau jokios metastazių matomi TBGC plaučių buvo pastebėtas 10 savaitę (pav 4.2a-H). Mikroskopinis patikrinimas atskleidė TBGCs infiltracija į gimdos kaklelio ir pažasties limfmazgiuose anksčiau kaip 1 savaitei po uodega venų injekcijos, o BGCs reikėjo daugiau laiko (3 savaites), įveskite šiuos limfmazgiai (4.1 pav). Penkias savaites po ląstelių injekcijos, plaučių infiltracija buvo pastebėtas BGC grupei. Tačiau jokių TBGCs buvo aptikta organų iki 10 savaičių po injekcijos (pav 4.2b, F, S2.3 pav.)

imunohistocheminį dažymo nurodyta palaipsniui didinant E-cad į limfmazgius iš TBGC grupės , o El-cad išraiška šiek tiek sumažėjo BGC grupės ( p
< 0,01) (pav 4.4a-p),. Skirtumai buvo reikšmingi 8 ir 10 savaičių, kai El-cad išraiška buvo daug didesnis TBGC grupėje, lyginant su BGC grupėje (4,5 pav.) Iš beta-kateninai sąvoka taip pat padidėjo kartą TBGC grupės, kuri pasiekė aukščiausią tašką 8 savaites ir tada šiek tiek sumažėjo (4,5 pav.) Rezultatai taip pat rodo, padidėjo β-kateninai išraišką TBGC grupėje 5, 8, ir 10 savaičių ( P
< 0,01). (4,5 pav)

6. TBGCs nustatytas nedidelis navikų susidarymo, tačiau aukštos limfmazgio metastazių Talpa mūsų oda Tumorigenesis Modelis

Kadangi naviko ląstelės yra labiau linkę formuoti navikai, kai implantuojama po oda, (GFP +) TBGCs ir BGCs buvo implantuotas įpurškiant 5 × 10 ^{5 gyvybingi auglio ląstelės į poodinį audiniuose abiejuose krūtinės pusėse. Besiformuojanti navikai BGC grupės buvo aptikta anksčiau kaip prieš 3 dienas po implantacijos ir visos pelės į BGC grupė parengė navikai implantacijos vietų po 1 savaitės inkubacinis (5.1A pav.) Stebina tai, kad implantuojami TBGCs nedavė jokių nenustatomi auglius iki 8 savaičių (5,1 pav, vaizdo s2). Eskalavimo TBGC dozę 5-10 × 10 6 implantuoti ląsteles tik atvedė prie mažų auglių gumulėlių susidarymo ir vangus papildymui naviko tūrio kartu su inkubacijos metu. Be to, pelės į BGC grupės tapo gaištančių, matyt dėl ​​padidėjusio naviko (nerodomas duomenys).}

viso kūno skrodimas kiekvienu laiko intervalas rodo, kad TBGCs, o matomų pirminių navikų, infiltruoti greta ir distalinės limfmazgiai, kadangi BGC generuojamus naviko masių buvo tik sveikoms fibrozinių kapsulių injekcijos vietų (video S2). Regioninis pasaulinė limfmazgių metastazių į TBGC grupės buvo rasta anksčiau kaip 2 savaitėms po implantacijos, o metastazių sritiniuose limfmazgiuose buvo rasta per 4 savaites į BGC grupės (5.2 pav.) Kaplan-Meier analizė rodo, kad TBGCs parodė didesnę riziką susirgti į limfmazgių metastazių nei BGCs (5.2 pav.)

Platus žarnyno metastazių taip pat buvo akivaizdu, visų pelių TBGC grupės 8 savaičių, o po to (paveikslas S4.1 pav S4.4). Vidutinis skaičius žarnyno mazgelių buvo 5,50 ± 1,73 8 savaitę ir 10 savaitę 7,33 ± 1,79, priešingai, tik 1 pelė į BGC grupės parodė 3 žarnyno infiltracija, 9 savaitę (S4.1 pav.)

GFP sekimo rodo vietinį naviko susidarymą BGC grupės injekcijos vietoje, be regioninių limfmazgių infiltracija. Priešingai, TBGCs pasirodė pažasties limfinių mazgų, bet žalios fluorescencija nebuvo aptikta į audinius injekcijos vietoje (5,3 pav). Tuo savaitę 6, TBGCs-GFP sukaupta tiesiosios žarnos ir žarnų pasaito limfmazgių. Tačiau tik 1 pelė su teigiamu pasaito limfmazgių metastazių buvo aptikta BGC grupei. visos CK imunohistocheminį dažymo rodo, kad TBGCs Metastazė regionų (pradžioje) ir distalinių limfmazgių (vėlai), o BGCs Metastazė tik regioninių limfmazgių (vėlai) per visą bandymo laikotarpį (S4.5 pav.) TBGCs pat Metastazė į bent savaitę žarnyne, kai ji buvo nerastas BGC grupei.

JE dažymo rodo, kad nenormalių ląstelių atsirado regioninių limfmazgių pirmaisiais etapais TBGC grupės ir pabaigoje etapai BGC grupė (S4.6 pav.) Imunohistocheminis baltymų ekspresijos analizė ne 2 savaites rodo E-cad ir beta-kateninai ir glaudesnio vimentin raiškos TGBC-LNS downregulation, palyginti su BGC-navikų. Šie rezultatai dar buvo patvirtinta Vakarų blot analize audinių pavyzdžių, kurie neaptiko El cad į TGBC-LNS; Tuo tarpu, N-cad taip pat buvo smarkiai downregulated į TGBC-LNS (S3.3-3.4 pav.)

imunohistocheminį dažymo rodo laipsnišką E-cad į limfmazgius iš TBGC grupės Laikui bėgant, o E-cad išraiška šiek tiek sumažėjo BGC grupės ( p
< 0,01) (5.4 pav.)

• PLoS ONE: Prohibitin išraiška dereguliavimo skrandžio vėžys yra susijęs su 3 "neišverstų regione 1630 C > T polimorfizmo ir kopijų skaičiaus kitimas
• PLoS ONE: aktyvavimas mezenchiminių kamieninių ląstelių makrofagų paragina Žmogaus skrandžio vėžio augimo per NF-κB būdas