PLoS ONE: kliničkopatološkim Značaj mikrornk-214 u rak želuca i njezin utjecaj na mobitel biološkoj ponašanja

Sažetak pregled

Prikupljeni dokazi ukazuju da su brojne mikroRNA uključen u nastanku tumora i progresiju raka želuca, a klinički značaj mikrornk-214 kod raka želuca se slabo razumije i točna uloga mikrornk-214 u karcinom želuca ostaje nejasna. U ovom istraživanju, razina ekspresije mikrornk-214 u 80 želučane tkiva karcinoma, 18 nontumourous želuca i tkiva, te 4 vrste želučanih staničnim linijama raka kvantificirane reverznom transkripcijom i zatim u realnom vremenu kvantitativna lančana reakcija polimeraze (RT-qPCR) i odnos između mikrornk-214 izražavanja i cliniopathological karakteristikama uključujući prognozu istraživali. Da bi istražili moguću ulogu mikrornk-214 u želučanom stanica raka biološkog ponašanja, proveli smo stanične proliferacije, apoptoze, migraciju i invaziju testovima u četiri želuca staničnim linijama karcinoma i besmrtne stanice linija želuca in vitro pregled. Naši rezultati pokazuju da mikrornk-214 je znatno regulirani u želučanim tkiva raka i rak želuca staničnim linijama, u usporedbi s nontumourous želučanog tkiva. Postupno podreguliranje mikrornk-214 izrazu zabilježen je među nontumourous želučane sluznice, nonmetastasis želučanog tkiva raka, i metastaza želučanog tkiva raka. Ekspresija mikrornk-214 je značajno obrnutoj su korelaciji s limfnih čvorova metastazama i veličini tumora, ali nije korelacija s pacijentovim prognozu. Ektopično izraz mikrornk-214 može spriječiti migraciju stanice i invaziju sposobnost u SGC7901 i MKN45 stanica raka želuca. I obaranje mikrornk-214 značajno ubrzava proliferaciju stanica, migraciju i invaziju, na način stanično specifičnom MKN28, BGC823 i GES-1 stanicama. Faktor stimulacije kolonija 1 (CSF1) je identificiran kao ciljni gen od mikrornk-214. Ukratko, naši podaci pokazuju da mikrornk-214 je obećavajući novi biomarker za limfnih čvorova metastaza u bolesnika s karcinomom želuca. I utvrdili smo da je silazni mikrornk-214 može regulirati proliferaciju, invaziju i migraciju stanica želuca raka izravno ciljanje CSF1 pregled

Izvor:. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) kliničkopatološkim Značaj mikrornk-214 u rak želuca i njezin utjecaj na staničnu biološkoj ponašanja. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10,1371 /journal.pone.0091307 pregled

Urednik: Terence Lee, Sveučilište u Hong Kongu, Hong Kong pregled

Primljeno: 25. travnja 2013; Prihvaćeno: 11. veljača 2014; Objavljeno: 10. ožujak 2014 pregled

Copyright: © 2014 Wang et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 81172351 i 81372856). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je četvrti najčešći karcinom i drugi vodeći uzrok smrtnosti od raka u svijetu [1]. Unatoč značajnim studijama o tumourigenesis i progresiju GC, patogenezi ove složene bolesti slabo razumije. Dakle, to je od vitalnog kliničku vrijednost se identificirali i opisali točan molekularni mehanizam koji su uključeni u razvoj i progresiju želučanog karcinoma. Pregled

Osim konvencionalnog genetske i epigenetičko promjene onkogena za kodiranje proteina i tumor-supresorski geni u karcinogeneze GC, nonprotein kodiranje RNA, a posebno mikroRNA (miRNAs), su se pojavili kao novi igrač rasvijetliti mehanizam razvoja GC [2]. MiRNAs endogenih 19-25 nt nekodirajuće RNA koje negativno reguliraju ekspresiju proteina promičući degradacije mRNA ili proteina potiskujući prevođenje kroz interakciju s 3'-UTR ciljnih mRNA. Sve veći broj miRNAs su izvijestili da sudjeluju u karcinogeneze i razvoj ljudskih karcinoma, uključujući GC [2] - [4]. Ovi miRNAs obično dereguliran i djeluju bilo kao tumora smetnji ili onkogena u inicijaciju i napretku humanih karcinoma. Na primjer, Tsukamoto et al. su pokazali da miR-375 je podreguliran u želučanom karcinoma i ispoljava svoje djelovanje kroz proapoptotski snižavanje PDK1, kinazu koja fosforilira Akt, a zauzvrat, potiskuje PI3K /Akt put [5]. A miR-21 nađeno je da pospješuju proliferaciju tumora i invaziji u GC negativno regulira važne tumorske uklanjanje smetnji, kao što su PTEN, PDCD4 i Reck, te daju GC stanica s povećanom invazivnost i sposobnost da se izbjegne anoikis [6] - [8 ]. Prije toga, utvrdili smo da je Mir-145 je regulirani u mnogostrukim ljudskih stanica raka i potisnut invazije-metastaza kaskadu u GC inhibirajući N-kadherina proteina prijevod [9], [10]. Pregled

Za sada, klinički značaj mikrornk-214 (Mir-214) u prognozi bolesnika s GC slabo razumije, a točan uloga Mir-214 u GC ostaje nejasno. Evo, istražili smo povezanost između Mir-214 ekspresije i cliniopathological parametara, kao i procijeniti učinak Mir-214 na biološkom ponašanju, uključujući staničnu proliferaciju, apoptoza, migracije i invazije GC stanicama. Pregled

Materijali i metode

uzorci tkiva

uzorci tkiva su bili pripravljeni na sličan način kao što je prethodno opisano [9]. Ukratko, 80 uzoraka (od 65 muškaraca, 15 žena, 58,3 ± 17,49 i 61,5 ± 9,162 godina stara, respektivno) GC tkiva dobiveni su od pacijenata koji su se podvrgnuli kirurške resekcije na Qi Lu bolnici Sveučilišta Shandong od 2004. do 2006. godine Nontumourous želučane sluznice daleko od tumora više od 3 cm slučajno izabran je iz 18. tih bolesnika i služi kao kontrola. Nijedan od pacijenata primili predoperativnu terapiju, kao što je terapija zračenjem ili kemoterapiju. Uzorci su upisali histološki prema Lauren-a i Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) 's klasifikacije (IARC Press, Lyon, 2000), a po tome kako se UICC 2002. TNM klasifikacije. Pregled

Etika izjava pregled

istraživanje je odobrilo Etičko povjerenstvo Medicinskog fakulteta Sveučilišta Shandong, Shandong, China (odobrenje broj: 201101015). dobili smo pisani pristanak od svih sudionika u našem istraživanju. pregled

Kultura stanica pregled

Četiri vrste ljudskih staničnih linija GC dobiveni su od American Type Culture Collection (MKN28 i MKN45, Manassas, VA , SAD) i Institut Šangaj Rak (BGC823 i SGC7901, Šangaj, Kina). Besmrtne želučane sluznice epitela stanične linije GES-1 dobiven iz Pekinga ComWin Biotech Co, Ltd (Peking, Kina). Stanice su održavane u RPMI 1640 mediju za kulturu uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) u stanične kulture vlažnoj s atmosferi 5% CO _{2 na 37 ° C. Pregled}

Mirni ekstrakcija

Korištenje miRNeasy FFPE Kit (Bioteke, Peking, Kina), izolirani smo Mirna iz parafinskih-ugrađen tkiva u skladu s uputama proizvođača. Ukupna RNA staničnih linija je ekstrahiran pomoću Trizol reagens (Takara, Dalian, Kina) slijedeći protokol proizvođača. Kvaliteta i količina RNA uzoraka ispitana standardnim spektrofotometrijskim metodama (BioPhotometer plus, Eppendorf, Hamburg, Njemačka), te razrijedi do 2 ng /ul RT-qPCR analize pregled

reverzne transkripcije slijedi realnom vremenu. kvantitativna lančana reakcija polimeraze (RT-qPCR) pregled

Mirna razinama su kvantificirane korištenjem SYBR Primescript Mirna RT PCR (Takara, Dalian, Kina) prema uputama proizvođača s Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 real Vremenski sustav. Ukratko, uzorci RNA su pretvoreni u cDNA po jedan korak Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit jedan (Takara, Dalian, Kina), nakon čega slijedi realnom vremenu qPCR i normalizirane pomoću U6 mali nuklearni RNA (RNU6B) od 2 ^{-ΔCT metoda. Primeri za Mir-214 i U6 su iz GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Sve reakcije su izvedene u duplikatu. Pregled}

Cell transfekcija pregled

Eksponencijalno rastuće stanice (1.5 x 10 ^{5) su zasijane u 12 jažica, 12 sati prije transfekcije te su transfektirane s 30 nM mir-214 prekursor (mir-214), anti-mir-214 inhibitor (mir-214 inhibitor) ili negativna kontrola (Ambion, Austin, TX, USA) pomoću X-tremeGENE reagensa za transfekciju (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) prema uputama proizvođača. Učinkovitost transfekcije je praćena pomoću RT-qPCR na 24, 48 i 72 sata nakon transfekcije. pregled}

stabilnu ekspresiju Mir-214, SGC7901 i MKN45 stanice su transfektirane s lentivirus miR-214-eksprimira vektor LV3-HSA -miR-214 ili negativna kontrola LV3NC, koja ima GFP kao marker proteina, prema uputama proizvođača (GenePharma, Shanghai, Kina). Tri dana nakon transfekcije, ekspresija GFP proteina je praćena pod fluorescentnim mikroskopom. Transfektirane stanice su testirane s puromicinom (1.5 ug /ml) za one koje stabilno eksprimiraju Mir-214. Pregled

Stanična proliferacija Test pregled

Nakon transfekcije, stanice su tripsinizirane, broje i zasije na 96 Pa pločice, sa gustoćom od 5 x 10 ^{3 'stanica /jažici. A zatim proliferacija stanica je mjerena korištenjem testa proliferacije edu kako je ranije opisano [11]. Ukratko, 24 h nakon transfekcije, stanice su uzgojene u tri primjerka na 5 × 10 3 stanica po izvoru u 96 jažica dan prije nego EDU inkubacije (Ribobio, Guangzhou, Kina). Nakon edu obilježavanja, stanice su tretirane s 100 ul 1 x Apollo reakcije koktel, obojeni s 100 uL Hoechst 33342 (5 ug /ml) i vizualizirati pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus, Japan). Postotak edu pozitivnih stanica je definiran kao stopa rasta. Podaci su dobiveni iz tri nezavisna pokusa i predstavljeni kao prosjek ± standardna devijacija (SD). Pregled}

staničnoj apoptozi Test pregled

Tri dana nakon transfekcije miR-214 prekursora ili inhibitora, stanice su sakupljene i bojane pomoću Aneksin V-FITC /PI Detection Kit apoptoze (BestBio, Šangaj, Kina) kao što je prethodno opisano [12]. Ukratko, stanice su tripsinizirane, sakupljene, a zatim obojeni pomoću Annexin V-FITC /PI Apoptoza Detection Kit prema uputama proizvođača. Nakon inkubacije s Annexin V-FITC i PI, apoptoze Stanice su odmah analizirane protočnom citometrijom. Rano apoptične stanice su definirane kao populaciji koja je bila JU negativne i Aneksin V-FITC pozitivno, dok u kasno apoptotične stanice PI pozitivne i Aneksin V-FITC pozitivan. Ukupna apoptoze stopa izračunata je kao rane apoptoze stopi plus kasno apoptoze stopa. Aneksin V-PE /7-AAD Apoptoza Detection Kit (Keygen, Nanjing, Kina) korišten je za ispitivanje apoptoze lentivirusnih vektora transfektiranih stanica, slično kao i gornji protokoli. Svaki eksperiment je izveden u tri puta, a podaci su prikazani kao prosjek ± SD. Pregled

migraciju stanice i invaziju testovi pregled

su provedena Cell migraciju i invaziju testovi kao što je prethodno opisano [13]. Migracijski test je proveden sa bunara umeće s membranom veličine pora 8,0 mm (24-i formatu, Corning, New York, SAD). Za mjerenje invazije sposobnost GC stanicama, prethodno spomenuti umetci su prethodno obloženu Matrigel matrice (BD znanosti, Sparks, MD, USA). Stanice (1 × 10 ^{5) su ponovno suspendirane u mediju bez seruma i posađene u gornju komoru. Donje komore napunjene su sa potpunom mediju kulture koji sadrži 10% FBS. Nakon inkubacije na 37 ° C tijekom 24 sati, stanice su migrirale se nalaze na donjoj strani membrane su fiksirane, obojene i broje. Svaki pokus je proveden u tri primjerka. Pregled}

provedena su luciferaza analitički pregled

Dual-luciferaza testovi kao što je ranije [9] opisano. 3'-UTR fragmenti CSF1 gena koje sadrži miR-214 vezno mjesto je amplificiran PCR-om iz MKN45 stanične RNK upotrebljavajući primere u Tablici S1 i umetnut u Xba1 mjestu pmirGLO Mirni meta ekspresijskog vektora (Promega, San llius Obispo, CA, USA). Dobiveni vektor je nazvan pmirGLO-CSF1. Za reporterskog ispitivanju MKN45 i BGC823 stanice su posađene u pločice s 12 jamica dan prije transfekcije. Stanice su ko-transficirane s 30 nM Mir-214 preteče, ili Mir-214 inhibitor, negativna kontrola i 30 ng pmirGLO-CSF1 pomoću X-tremeGENE reagensa za transfekciju (Roche Applied Science). Nakon 48 sati transfekcije, aktivnost luciferaze mjerena je pomoću sustava s dvostrukom Luciferaze (Promega), te normalizirana na Renilla aktivnost luciferaze. Svaki eksperiment izveden trostruko. Pregled

Western blot pregled

48 sati nakon transfekcije s miR-214 prekursora ili inhibitora, stanice su podvrgnute Western blot analizom kao što je prethodno opisano [19]. Ukratko, protein je ekstrahirana iz stanica ili tkiva. Lizati su razdvojeni elektroforezom prenesu na nitrocelulozne membrane i mrlja s antitijelima protiv CSF1 (1:1000, Epitomics) ili beta-aktin (1:1000, Santa). Podaci su dobiveni iz tri neovisna pokusa. Pregled

Statistička analiza pregled

Analiza je izvršena pomoću statističkog paketa Prism 5 softvera (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Razlike su analizirani Student-a t pregled -test između dvije skupine ili jednosmjernom ANOVA među tri skupine. Korelacija između Mir-214 izražavanja i veličine tumora u osnovnoj GC je izračunata Spearmanov korelacije. Krivulje preživljenja, podaci su analizirani pomoću log-rank testa. Da bi se odredilo u kojoj mjeri izraz Mir-214 učinkovito mogao odvojiti različite kliničke subsettings, prijemnik analiza karakteristika (ROC) krivulja je konstruirana i područje ispod krivulje (AUC) izračunata je procijeniti sposobnost Mir-214 izražavanja razlikovanja između slučajeva raka i nontumourous slučajeva, te razlikovati metastatskih tkiva i nonmetastatic tkiva. P pregled -values ​​manje od 0,05 smatrane su statistički značajne. Pregled

Rezultati

Mir-214 je regulirani u želučanim tkiva karcinoma i četiri stanične linije GC, u usporedbi s nontumourous želučane sluznice pregled

u usporedbi s 18 nontumourous uzoraka želučane sluznice, mir-214 je znatno regulirani (oko šest puta) u 80 primarnih uzoraka želučane tkiva (Slika 1A, p pregled = 0,0001). Prijamnik operativni karakteristične krivulje (ROC) od Mir-214 očituje snažnu razdvajanja između GC tkiva i nontumourous tkiva, s površinom ispod krivulje (AUC) 0.7764 (Slika S1A, 95% interval pouzdanosti (CI), 0,6466 - 0,9062). Dosljedno, regulacija od Mir-214 je potvrđen u četiri stanične linije želuca. Kao što je prikazano na Slici 1C, Mir-214 razina ekspresije u GC stanicama MKN28, BGC823, MKN45 i SGC7901 značajno je prigušen usporedbi sa 18 nontumourous uzoraka želučane tkiva ( P pregled i 0.05).

Međutim, otkrili smo još niži izraz Mir-214 u GES-1, besmrtnom želuca epitelnih stanica linije, nego u četiri GC staničnim linijama (slika 1C, p izvoznici < 0,05). Mi nagađati o nesklad može biti zbog barem u dijelu na razlici između kliničkih uzoraka i staničnim linijama, jer se stanična linija, izoliran od jednog pacijenta s određenom bolesti, predstavlja Mirna izraz potpis samo jednog kliničkog uzorka i svibanj promjene tijekom stanici kultura In vitro pregled; drugim riječima, uzorci tkiva su mnogo kao ljudsko kontekstu od staničnih linija. Dakle, mi komentar da Mir-214 ekspresija u ljudskim GC tkiva bio je zastupnik i vjerodostojan nego da se nalazi u staničnim linijama. Pregled

Smanjena Mir-214 ekspresija u GC je povezana s limfni čvor metastazama i veličine tumora, ali nema korelacija s prognozom za pacijenta Netlogu

Da bi se odredile potencijalne kliničkopatološka implikacije promijenjen mir-214 izražavanja, u kombinaciji smo rezultate qPCR i klinički parametri. Korelacije između Mir-214 razine ekspresije i kliničkopatološkim karakteristikama GC prikazani su u tablici 1. Mir-214 ekspresija je obrnuto povezana s veličinom tumora (tablica 1, t pregled -test, P Netlogu = 0,0265; Slika 1D, Spearman r = -0,2673, P pregled = 0,0083) i limfnih čvorova metastaza (Tablica 1, Figure1A, t pregled -test, P pregled = 0,0164). Međutim, nije bilo značajne razlike u drugim kliničkopatološkim značajkama kao što su spol, distalni metastaza, WHO histološka klasifikacija i histološkom tipu Laurenov između ove dvije skupine. Pregled

Zanimljivo, našli smo stupnjeviti downregulation Mir-214 među nontumourous želuca sluznica, nonmetastasis tkiva i metastaza tkivima (Slika 1A, jednosmjerna ANOVA, P pregled = 0.0006). Za procjenu Mir-214 izražavanje u GC kao novi biomarker za limfnih čvorova metastaze, osnovane su ROC krivulje. Uočili smo jasne podjele između bolesnika s limfnih čvorova metastaze i oni bez limfnih čvorova metastaze, s AUC 0.5880 (Slika S1B, 95% CI, 0,4526 do 0,7166). Primarni želučani Tkiva su dalje podijeljene u low-metastaza skupinu i velike metastaze grupe prema broju limfnih čvorova metastaze (LNM): niska metastaze je definirana kao predmeta s manje od šest LNM, a slučajevi s više od šest LNM su smatrane visokim metastaza. Kao što se očekivalo, Mir-214 ekspresija dramatično je smanjena u high-metastaza skupine u odnosu na niske metastaza skupine (Slika 1B, P pregled = 0,045). Pregled

U skladu s uzorkom tkiva podaci ukazuju na povezanost između mir-214 izražavanja i LNM, otkrili smo da su, u usporedbi s umjereno dobro diferenciranih stanica linije MKN28, mir-214 je izraz lica bio izrazito manje u slabo diferenciranim stanicama MKN45 i BGC823, a posebno stanična linija metastatskog SGC7901 [14] ( p izvoznici < 0,05) pregled

Međutim, naši podaci pokazuju da nema značajne razlike Mir-214 izražavanja u 18 uzoraka primarnih želučanog tkiva i srednju metastaza lokusa (Slika 1B. P pregled = 0,2676). Ovi rezultati pokazuju da regulacija Mir-214 izražavanja dogodila u ranoj fazi LNM razvoja i ostao stabilan, bez daljnjeg gušenja u kasnom stadiju metastaza. Pregled

Kako bi se dodatno istražiti učinak Mir-214 na prognozu pacijenata, analizirali smo razine ekspresije Mir-214 u slučajevima s različitim povratak statusa i preživljavanja uvjetima. Međutim, naši podaci su pokazali da ne postoji izrazita razlika između relapsa skupine i nonrelapse grupe, ili između grupe za preživljavanje i skupini smrti (slika 2a-B, t pregled -test, P
> 0,05). Treba spomenuti, podijelili smo bolesnike u visoke ekspresije i niske ekspresije skupine na temelju medijana razine Mir-214 izražavanja, a Kaplan-Meier krivulje preživljavanja nije pokazala značajnu korelaciju između Mir-214 izražavanja i povratak slobodnog opstanka (Slika 2C , omjer rizika (HR) 1,23, 95% interval pouzdanosti (CI) ,6596-2,285; P pregled = 0,5781) ili ukupno preživljenje (Slika 2D, HR 1,20; 95% CI ,6667-2,151; P pregled = 0,5832) u bolesnika s GC. pregled

Učinak Mir-214 na proliferaciju GC stanicama pregled

za praćenje učinkovitosti transfekcije, utvrdili smo Mir-214 izraza pomoću RT-qPCR na 24, 48 i 72 sata nakon transfekcije u miR-214 prekursora ili inhibitora transfektirane stanice i neprekidno detektira miR-214 ekspresiju lentivirusnih vektora tretiranih stanica tijekom 4 tjedna. Kao što se očekivalo, transfekcija Mir-214 prekursora učinkovito rezultiralo značajnim prekomjerne ekspresije Mir-214 (Slika S2A-B, P izvoznici < 0,05) i Mir-214 Inhibitor upadljivo smanjen Mir-214 izričaj u miR- 214 stanice transfektirane inhibitor naspram negativnih skupina (Slika S3E-F Slika S4 A P pregled i 0.05). Također, utvrdili smo da stanice transfecirane lentivirus vektora LV3-HSA-Mir-214 mogla bi dovesti do 7 do 96 puta promjeni Mir-214 izražavanja u SGC7901 i MKN45 stanica (Slika S3A-D, P
< 0,05), uz 80% -90% stanica koje eksprimiraju marker GFP proteina (slika S3A, B) pregled

kako bi se utvrdilo je li mir-214 može utjecati na proliferaciju GC stanicama, edu proliferacija test je navikao. detektirati sposobnost rasta stanica. Naši podaci su pokazali da je prekomjerna ekspresija Mir-214 s lentiviurs vektorima ili miR-214 prekursora nije utjecalo rast stanica SGC7901 (Slika 3A-B Slika S2C-D, P &0.05) i stanične linije MKN45 (Slika S2E-F, slika S5-B, P 0,05). No, otkrili smo da downregualtion Mir-214 može pospješiti proliferaciju BGC823 (Slika 3C-D, P pregled = 0,0010) i GES-1 (slika S4B-C, P pregled = 0,0474), ali ne MKN28 stanične linije (Slika S5C-D, P pregled = 0,0938), na način stanično specifičan. pregled

Uloga Mir-214 u stanične migracije i invazije GC stanice pregled

Kao mir-214 ekspresija bila je obrnuto proporcionalno povezana s limfnih čvorova metastaza, bili smo posebno zainteresirani za mogućnost mir-214 da utječe na staničnu migraciju i invaziju. Naši rezultati pokazuju da SGC7901 i MKN45 stanice transfektirane s LV3-HSA-miR-214 pokazao je značajno smanjio migraciju i invaziju mogućnosti, u odnosu na LV3NC obrađena stanica (Slika 4A-B, slika S6A-B P
< 0,05). I mi smo opazili da downregualtion Mir-214 mogla olakšati migraciju i invaziju MKN28 (slika 4c-D, P pregled = 0,0491 i P pregled = 0,0127, respektivno). Iako je obaranje Mir-214 nije utjecao na migraciju GES-1 stanica (Slika S4D-E, P pregled = 0,0879), odsutnost Mir-214 je dovelo do povećanja više od 40% u invazivna svojstva tih stanica ( P pregled = 0,0046). Međutim, naši podaci su pokazali da unos Mir-214 prethodnik nije imao snažan utjecaj na migracije stanice i invaziju u SGC7901 (Slika S2G-H, P izvoznici > 0,05) i MKN45 (Slika S2I-J, p izvoznici >. 0,05) stanice, u usporedbi s odgovarajućim negativnih kontrola pregled

utjecaj Mir-214 na staničnu apoptozu GC stanicama pregled

da bi ispitali učinak miR- 214 na staničnu apoptozu, izveli smo pokusima apoptoze putem /PI metoda bojanja s Annexin V-FITC. Naši rezultati pokazuju da prekomjerna ekspresija (Mir-214 prethodnik i lentivirus vektor) i obaranje Mir-214 nije mogao utjecati na staničnoj apoptozi očito u usporedbi s negativnim kontrolama u staničnim linijama četiri GC (slike 5, Slika S2K-N, P
> 0,05) i imortalizirane stanične linije želučane GES-1 (podaci nisu prikazani). U stvari, otkrili smo tendenciju pro-apoptoze sposobnosti Mir-214 prekursor u MKN45 staničnoj liniji (slika S2M-N, P pregled = 0,0606), ali razlika nije bila statistički značajna. Pregled

Mir-214 izravno cilja i dolje-regulira CSF1 u želučanim stanicama raka pregled

kako prepoznati ciljeve od Mir-214, koje smo upotrijebili TargetScan algoritam za predviđanje Mir-214 ciljeva u ljudskom raka želuca. Među brojnim potencijalnim kandidatima, pokupili smo iz one izraženo u raka i proliferation- i geni metastaza povezane, uključujući NOTCH2, FGFR1, CSF1 (Slika 6a), AGAP2, CREB1, za daljnju analizu. Naši rezultati pokazuju da miR-214 prekursor transfekcija značajno smanjuje aktivnost luciferaze reporter gena fuzioniranog s CSF1 3'-UTR sa 29.60% i 30.61% smanjenje u odnosu na negativne kontrole (skupina slici 6B, P
= 0,0227 i 0,0093, odnosno, za MKN45 i BGC823 staničnih linija). Dok kad bilo je ubačeno Mir-214 Inhibitor, luciferaza aktivnost je povećana za 34,49% i 42,25% u MKN45 i BGC823 stanica u usporedbi s kontrolom (Slika 6C, P pregled = 0,0115 i 0,0085, respektivno). Pregled

nadalje određuje ekspresiju CSF1 proteina pomoću western blot u GC stanicama transfektiranim s miR-214 prekursora ili inhibitora. Skladu s luciferazom rezultata ekspresija CSF1 proteina značajno smanjena u SGC7901 i MKN45 stanica (Slika 6D-E, P pregled = 0.0037 i 0.0066, redom), transficiranih miR-214 prekursora i povećan MKN28 i BGC823 stanice (Slika S7A-B P pregled = 0,0049 i 0,0416, odnosno), transficiranih miR-214 inhibitora, u usporedbi s odgovarajućim kontrolama. Ovi podaci predložio da Mir-214 inhibira CSF1 prijevod u želučanim stanicama raka. Pregled

Rasprava pregled

Sve je više dokaza istaknuo je ključni utjecaj Mirna poremećajem na tumourigenesis ljudskih karcinoma [3], [4] , Mirni deregulacija potiče proliferaciju stanica, otpornost na apoptozu, te poboljšava invazivnost i metastaziranje kroz potiskujući nizvodne tumorske uklanjanje smetnji ili izazivanje akumulaciju ciljnih onkogena, čime je uključena u inicijaciji, napredovanja, i u metastazu ljudskih tumora. Pregled

Među mnoštvom miRNAs, deregulacija Mir-214 je pronađen u dosta humanih karcinoma [15] - [22]. Podreguliranje Mir-214 kod karcinoma cerviksa je prijavljen nekoliko skupina, a miR-214 pokazano je da inhibira rast, migraciju i invaziju stanica raka vrata maternice onkogenezom ciljaju MEK3, JNK1, Plexin-B1 i GALNT7 [15 ] - [17]. Mir-214 također je utvrđeno da je smanjena kod raka dojke i doprinijeti tumourigenesis dojke tako što abnormalno povišene onkogcni Ezh2 akumulacije i naknadne proliferacije nepredanu stanica i invaziju [18]. Međutim, Penna et al. su pokazali da Mir-214 vrlo izražena u ljudskim melanoma i doprinosi melanoma progresije tumora kroz suzbijanje TFAP2C, homolog dobro uspostavljena melanoma supresor [19]. Ovi rezultati pokazuju da je uloga Mir-214 kod raka je tkivno ili staničnoj specifičan. Pregled

U nedavnom istraživanju Ueda et al. pokazala je da deregulacija Mir-214 je u korelaciji s kliničkim fazi, peritonejsku širenje i opstanak bolesnika [20]. Međutim, točna uloga Mir-214 u progresiji želučanog karcinoma i njegove temeljne molekularni mehanizam ostaje upitan. Ovdje ćemo pokazati da Mir-214 znatno je smanjen u GC, posebno u metastatskih tkiva, što upućuje na moguću ulogu Mir-214 u predviđanju limfnog čvora metastaza, što je dodatno podržan od strane naše analize ROC krivulje. Osim toga, otkrili smo da je niska ekspresija Mir-214 je imao sklonosti prema većoj veličini tumora. Da bi se riješila da li je deregulacija Mir-214 nosi biološki značaj, koristi se follow-up studija i funkcionalnu analizu Mir-214 in vitro
. Ipak, naši rezultati pokazuju da Mir-214 nema utjecaja na ishod bolesnika, uključujući i status relapsa i opstanak. Naši podaci su pokazali da je prekomjerna ekspresija Mir-214 sa lentivirus Mir-214-izražava vektora dramatično smanjuje migraciju i invaziju GC staničnih linija i obaranje Mir-214 mogla bi olakšati proliferaciju stanica, apoptoza, migraciju i invaziju na način stanično specifičan, s nema utjecaj na staničnu apoptozu. pregled

CSF1 (faktor stimulacije kolonije 1 (makrofaga)) je kritična hematopoetski čimbenik rasta uključuje u makrofaga staničnu diferencijaciju, proliferaciju i aktivaciju, a to je također prisutan u nehematopoetskih stanica [21] , CSF-1 utječe na staničnu proliferaciju i opstanak, putem vezivanja na njegov receptor kodiran genom c-fms [22]. Prethodne studije su pokazale da CSF1 vrši važnu ulogu u promicanju tumorske angiogeneze u leiomyosarcoma [23] i Lewis stanicama karcinoma pluća putem VEGF indukciju [24]. Aligeti S et al. predložio da CSF1 ima pozitivan učinak na privrženosti pleuralnog mesothelial stanica, invaziju i proliferaciju endometrija epitelnih stanica [25]. I povišene serumske koncentracije je u korelaciji s stadiju bolesti, limfni čvor metastazama i lošom prognozom u bolesnika s kolorektalnim karcinomom [26]. Ovdje smo identificirali CSF1 bio izravan cilj Mir-214 kod raka želuca kroz analize luciferaze i dalje potvrđeno Western blot analizi. Naši podaci sugerirao da podreguliranje Mir-214 može olakšati proliferaciju, migraciju i invaziju kapacitet želuca stanice raka putem signalnog puta CSF1 posredovane. Pregled

U prethodnom istraživanju, Ueda et al. pokazala je da relativno veći izraz Mir-214 u GC je bio povezan s nepovoljnim ukupnog preživljavanja u 101 bolesnika (dobiven sa Sveučilišta u Tokiju i Sveučilišta Hiroshima) [20] Međutim, naši podaci pokazuju da Mir-214 nije bila značajno korelira s pacijentom ishod. Pretpostavljamo da je ta razlika mogla biti s obzirom na različite metode Mirna izraz za detekciju, veličina uzorka, te praćenje puta između njihovih istraživanja i naše. Ueda et al. podijeliti uzorke u dvije klase (visoke i niske ekspresije) pomoću srednje razine Mirna izražavanja mjereno na mikrornk microarray kao prag, dok je naša podjela visoke i niske ekspresije skupine temelji se na srednju razinu ekspresije dobivenim iz rezultata qPCR , Zanimljivo, u ranijim istraživanjima, miR-214 ekspresija Pokazano je da su doregulirane u raka jajnika u usporedbi s normalnim stanicama ovarija Yang et al. [27], dok su suprotni rezultati izvijestila Nam et al. [28]. Obje od tih dviju skupina korišten Mirna Microarrays ispitati ekspresiju Mirne. Dakle, ne možemo isključiti mogućnost da microarray analiza ne može biti tako osjetljiv i precizan u analizi profile ekspresije određenog Mirne. Što se tiče učinka Mir-214 na prognozu bolesnika s GC, djelomično je u skladu s rezultatima Ueda et al., Također smo našli tendenciju da visoka ekspresija Mir-214 bila nepovoljna za opstanak kada follow-up vrijeme bilo duže od 40 mjeseci (omjer rizika (HR) = 1,19 za ukupno preživljavanje, HR = 1,23 za opstanak recidiva-free), kao što je prikazano na slici 2, iako je trend nije bila statistički značajna. U svakom slučaju, daljnje istraživanje s većim skupine i mnoge eksperimentalne postavke su potrebne za rješavanje ovog problema. Pregled

Što se tiče razilaženja Mir-214 lentivirusnih vektora i pokusu transfekcije prekursora, pretpostavljamo da je specifičan posljedica biološke aktivnosti Mir-214. Umjerena i stabilan izraz umjesto nekoliko desetaka tisuća ne-fiziopatološka prekomjerne ekspresije može pomoći Mir-214 dobro funkcionira. Pregled

Sve u svemu, pokazali smo da Mir-214 znatno je smanjen u GC, posebno u metastatskih tkivima, što ukazuje na moguću ulogu Mir-214 u predviđanju limfnog čvora metastaza. Naša analiza ROC krivulja pokazala relativno visoku specifičnost i osjetljivost Mir-214 zbog diskriminacije GC slučajeva iz nontumourous kontrole i odvajanje bolesnika sa i bez limfnih čvorova metastaza, što je izazvalo njegovu potencijalnu korisnost kao novi biomarker za GC i limfnih čvorova metastaza, što će biti od pomoći kako bi se olakšalo kliničko upravljanje GC. Međutim, naši podaci pokazuju da Mir-214 nema utjecaja na prognozu bolesnika, što znači da na miru Mir-214 nije dovoljno da utječe na preživljavanje pacijenata.

• PLoS ONE: povišene razine D-dimera u korelaciji s dugotrajno preživljavanje rak želuca Patients
• PLoS ONE: HIF-1 Alpha Prekomjerna ekspresija korelira s Poor ukupno preživljenje i bez znakova bolesti opstanak u rak želuca pacijenata Post-Gastrectomy