PLoS ONE: kliinis merkitys MicroRNA-214 mahasyövän ja sen vaikutus solujen biologista Behaviour

tiivistelmä

Kertyvät todisteet osoittavat, että lukuisat MikroRNA osallistuvat kasvainten synnyssä ja etenemisessä mahasyövän, kun taas kliininen merkitys of mikroRNA-214 mahasyövän ymmärretään huonosti ja tarkka rooli mikroRNA-214 mahalaukun syöpä on edelleen epäselvä. Esillä olevassa tutkimuksessa, ekspressiotasot mikroRNA-214 80 mahasyöpä kudoksissa, 18 nontumourous mahan kudoksissa, ja 4 eri mahalaukun syövän solulinjat kvantitoitiin käänteistranskriptio seurasi reaaliaikaisella kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR), ja suhde microRNA-214 ilmaisun ja cliniopathological ominaisuuksia, myös ennuste tutkittiin. Tutkia mahdollisuuksia roolia mikroRNA-214 mahasyövän solubiologinen käyttäytymistä, teimme solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike ja invaasio määrityksissä neljässä mahasyövässä solulinjoissa ja kuolemattomaksi mahan solulinjan in vitro
. Tuloksemme osoittivat, että microRNA-214 dramaattisesti vaimentua mahasyövän kudoksissa ja mahasyövän solulinjoissa, verrattuna nontumourous mahalaukun kudoksiin. Vaiheittainen downregulation mikroRNA-214-ekspressio havaittiin joukossa nontumourous mahalaukun limakalvo, nonmetastasis mahasyövän kudoksiin, ja etäpesäkkeiden mahasyövän kudoksiin. Ekspression mikroRNA-214 oli merkittävästi korreloi käänteisesti imusolmuke etäpesäke ja kasvaimen koko, mutta ei ollut korrelaatiota potilaan ennustetta. Kohdunulkoinen ilmentyminen mikroRNA-214 voi estää solujen vaeltamiseen ja invaasiota kyky SGC7901 ja MKN45 mahalaukun syöpäsoluja. Ja knockdovvn mikroRNA-214 merkittävästi helpottaa solujen lisääntymistä, muuttoliikkeen ja invaasio soluun-erityisellä tavalla MKN28, BGC823 ja GES-1-soluissa. Pesäkkeitä stimuloiva tekijä 1 (CSF1) tunnistettiin kohdegeeni mikroRNA-214. Yhteenvetona tietomme osoittivat, että microRNA-214 on lupaava uusi biomarkkeri imusolmuke etäpesäke potilailla mahalaukun syöpä. Ja havaitsimme, että downregulation mikroRNA-214 voi säädellä leviämistä, invaasion ja migraatio mahalaukun syöpäsolujen suoraan kohdentamalla CSF1.

Citation: Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) kliinis merkitys MicroRNA-214 mahasyövän ja sen vaikutus solujen biologista Behaviour. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10,1371 /journal.pone.0091307

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 25 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 11 helmikuu 2014; Julkaistu: 10 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81172351 ja 81372856). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa [1]. Huolimatta huomattavista tutkimuksia tuumorigeneesiä ja etenemistä GC, patogeneesin tämän monimutkaisen taudin huonosti. Näin ollen on erittäin kliinistä arvoa voidaan tunnistaa ja kuvata tarkkaa molekyylitason mekanismi mukana kehittämässä ja etenemiseen mahalaukun syöpä.

Lukuun ottamatta tavanomaisia ​​geneettisiä ja epigeneettiset muuttaminen proteiinia koodaavan onkogeenien ja kasvaimen synnyssä in karsinogeneesi GC, nonprotein-koodaavat RNA: t, erityisesti MikroRNA (miRNA) ovat uutena pelaaja valottaa mekanismi GC kehitys [2]. MiRNA ovat endogeenisia 19-25 nt ei-koodaavaa RNA: iden säätelemään negatiivisesti proteiinin ilmentymistä edistämällä mRNA: n hajoamisen tai tukahduta proteiini käännös, vuorovaikutuksessa 3'-UTR kohde- mRNA: iden. Yhä useammat miRNA on raportoitu osallistumaan karsinogeneesi ja kehittämiseen ihmisen syövissä, mukaan lukien GC [2] - [4]. Nämä miRNA ovat yleensä väärin säädellystä ja toimivat joko tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien aloittamista ja etenemistä ihmisen karsinoomia. Esimerkiksi, Tsukamoto et al. ovat osoittaneet, että miR-375 on vaimentua mahalaukun syöpä ja kykenee sen proapoptoottiset vaikutuksen kautta vähen- tämisessä PDK1, kinaasi, joka fosforyloi Akt, ja puolestaan ​​estää PI3K /Akt-reitin [5]. Vaikka miR-21 on havaittu edistävän kasvaimen leviämisen ja invaasion in GC negatiivisesti säätelemällä tärkeitä tuumorisuppressoreilla kuten PTEN, PDCD4, ja RECK, ja sitten antaa GC-solujen lisääntynyt invasiivisuus ja kyky välttää anoikis [6] - [8 ]. Aiemmin olemme havainneet, että miR 145 säädeltiin vähentävästi monenlaisessa ihmisen syöpäsoluja ja tukahdutti hyökkäys-etäpesäkkeitä kaskadin GC estämällä N-kadheriinin proteiini käännös [9], [10].

Tällä hetkellä kliinistä merkitystä mikroRNA-214 (miR-214) on ennusteen potilaita, joilla GC ymmärretään huonosti, ja tarkkaa roolia miR-214 GC jää epäselväksi. Täällä me tutkineet yhdistyksen välillä miR-214 ilmaisun ja cliniopathological parametrit sekä arvioitu vaikutus miR-214 biologista käyttäytymistä myös solujen jakautumista, apoptoosia, muuttoliike ja invaasion GC soluja.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

kudosnäytteitä valmistettiin samalla tavalla kuin aikaisemmin on kuvattu [9]. Lyhyesti, 80 näytettä (65 urosta, 15 naarasta; 58,3 ± 17,49 ja 61,5 ± 9,162 vuotta vanha, vastaavasti) GC kudokset saatiin potilailta, joille tehtiin kirurginen resektio Qi Lu sairaalan Shandongin yliopistossa vuodesta 2004 vuoteen 2006. Nontumourous mahan limakalvoa yli 3 cm: n päässä kasvaimista valittiin satunnaisesti 18 näistä potilaista ja käytettiin kontrolleina. Kukaan potilaista ei saanut ennen leikkausta hoidon, kuten sädehoidon tai kemoterapian. Näytteet kirjoitetaan histologisesti mukaan Laurenin ja Maailman terveysjärjestö (WHO): n luokituksia (IARC Press, Lyon, 2000), ja luokitellaan sen mukaan, UICC 2002 TNM luokittelu.

Ethics selvitys

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea School of Medicine, Shandongin yliopistossa, Shandong, Kiina (hyväksyntä koodi: 201101015). Saimme kirjallinen suostumus kaikilta osallistuville tutkimuksessamme.

Soluviljely

Neljä ihmisen GC solulinjat saatiin American Type Culture Collection (MKN28 ja MKN45, Manassas, VA , USA) ja Shanghai Cancer Institute (BGC823 ja SGC7901, Shanghai, Kiina). Immortalisoidut mahalaukun limakalvon epiteelisolujen linja GES-1 saatiin Beijing ComWin Biotech Co., Ltd (Peking, Kiina). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kosteutetussa soluinkubaattorissa atmosfäärissä, 5% CO _{2 37 ° C: ssa.}

miRNA uuttamalla

Käyttämällä miRNeasy FFPE Kit (Bioteke, Peking, Kiina), me eristettiin miRNA peräisin parafinoidut kudokset mukaan valmistajan ohjeiden. Kokonais-RNA solulinjojen uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (TaKaRa, Dalian, Kiina) seuraten valmistajan protokollaa. Laatu ja määrä RNA-näytteet arvioitiin standardin spektrofotometrisillä menetelmillä (BioPhotometer plus; Eppendorf, Hampuri, Saksa) ja laimennettiin 2 ng /pl RT-qPCR analyysi.

käänteistranskriptiolle seuraa reaaliaikaisesti kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) B

miRNA ekspressiotasoja kvantifioitiin käyttäen SYBR Primescript miRNA RT-PCR Kit (TaKaRa, Dalian, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Real -Time järjestelmä. Lyhyesti, RNA-näytteet muunnettiin cDNA yksivaiheisella Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, Kiina), jota seurasi reaaliaikaisen qPCR ja normalisoitu käyttämällä U6 pieni ydin- RNA (RNU6B), jonka 2 ^{-ΔCT menetelmä. Alukkeet miR-214 ja U6 olivat GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Kaikki reaktiot suoritettiin kahtena kappaleena.}

Cell transfektio

Eksponentiaalisesti kasvavat solut (1,5 x 10 ^{5) ympättiin 12-kuoppaisille levyille 12 tuntia ennen transfektiota ja transfektoitiin 30 nM miR-214 esiaste (miR-214), anti-miR-214-estäjän (miR-214-estäjä) tai negatiivinen kontrolli (Ambion, Austin, TX, USA) käyttäen X-tremeGENE transfektioreagenssia (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektiotehokkuuden seurattiin RT-qPCR 24, 48, ja 72 h transfektion jälkeen.}

stabiilia ekspressiota miR-214, SGC7901 ja MKN45 solut transfektoitiin lentivirus miR-214-ilmentävällä vektorilla LV3-HSA -miR-214 tai negatiivinen kontrolli LV3NC, jossa on GFP markkerina proteiinia, mukaan valmistajan protokollan (GenePharma, Shanghai, Kiina). Kolme päivää transfektion jälkeen GFP-proteiinia seurattiin alla fluoresenssimikroskoopissa. Transfektoidut solut seulottiin puromysiinin (1,5 ug /ml), niitä, jotka ilmentävät stabiilisti miR-214.

Soluproliferaatiomääritys

Kun transfektiosta solut trypsinoitiin, laskettiin ja ympättiin 96 kuoppaiset levyt tiheydellä 5 x 10 ^{3 solua /kuoppa. Ja sitten soluproliferaatiota mitattiin käyttäen edu runsaudenmäärityksessä kuten aiemmin raportoitu [11]. Lyhyesti, 24 tuntia transfektion jälkeen soluja viljeltiin kolmena rinnakkaisena 5 x 10 3 solua per kuoppa 96-kuoppaisille levyille päivää ennen edu inkuboinnin (Ribobio, Guangzhou, Kiina). Jälkeen edu merkintöjä, solut käsiteltiin 100 ui 1 x Apollo reaktio cocktail, värjättiin 100 ul: lla Hoechst 33342 (5 ug /ml) ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus, Japani). Prosenttiosuus Edu positiivisten solujen määriteltiin leviämisen korko. Tiedot saatiin kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja ne esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (SD).}

Cell apoptoosimäärityksessä

Kolme päivää transfektion jälkeen miR-214 esiaste tai inhibiittori, solut kerättiin ja värjättiin käyttämällä anneksiini V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit (BestBio, Shanghai, Kiina) kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, solut trypsinoitiin, kerättiin ja värjättiin sitten käyttämällä anneksiini V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit seuraten valmistajan ohjeita. Inkuboinnin jälkeen anneksiini V-FITC: llä ja PI, apoptoottisten solujen otettiin heti analysoitiin virtaussytometrialla. Varhainen apoptoottisia soluja määriteltiin väestöstä, joka on PI-negatiivisia ja anneksiini V-FITC: llä positiivisia, kun taas myöhäistä apoptoottiset solut olivat PI positiivisia ja anneksiini V-FITC: llä positiivinen. Kokonaismäärä apoptoottinen korko laskettiin alussa apoptoottisten korko lisättynä myöhään apoptoottiset korko. Anneksiini V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (KEYGEN, Nanjing, Kiina) käytettiin apoptoosin määritystä lentivirus vector transfektoituja soluja, samanlainen kuin edellä protokollia. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena, ja tiedot esitettiin keskiarvoja ± SD.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [13]. Migraatiokokeessa suoritettiin TranswellTM lisätään 8,0 mm huokoskoko (24-kuoppainen formaatti, Corning, New York, USA). Mitata invaasio kykyä GC solujen, aiemmin mainittu insertit esipäällystetty matrigeelin matriisi (BD Science, Sparks, MD, USA). Solut (1 x 10 ^{5) suspendoitiin uudelleen seerumittomassa elatusaineessa ja ympättiin ylempään kammioon. Alakammioissa täytettiin valmiissa elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 24 h, siirrettyjä soluja läsnä alapuolen kalvon kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.}

lusiferaasianalyysissä

Dual-lusiferaasi määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9]. 3'-UTR-fragmenttien CSF1 sisältävä geeni miR-214 sitoutumiskohdan monistettiin PCR: llä MKN45 solun RNA: sta käyttäen alukkeita taulukossa S1, ja insertoitiin Xba1 sivuston pmirGLO miRNA kohde ilmentämisvektoriin (Promega, San Lius Obispo, CA, USA). Saatu vektori nimettiin pmirGLO-CSF1. Lusiferaasin reportterimääritys, MKN45 ja BGC823 solut ympättiin 12-kuoppalevylle päivänä ennen transfektiota. Solut ko-transfektoitiin 30 nM miR-214 prekursori- tai miR-214-estäjän, negatiivinen kontrolli ja 30 ng pmirGLO-CSF1 käyttäen X-tremeGENE transfektioreagenssia (Roche Applied Science). 48 tunnin kuluttua transfektion, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Assay (Promega) ja normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot

48 h transfektion jälkeen miR-214 esiaste tai inhibiittori, solut altistettiin Western blot -analyysillä, kuten on kuvattu aiemmin [19]. Lyhyesti, proteiini uutettiin soluista tai kudoksista. Lysaatit erotettiin elektroforeesilla, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja blotattiin vasta-aineiden CSF1 (1:1000, Epitomics) tai β-aktiini (1:1000, Santa). Tiedot saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Tilastollinen

Analyysit suoritettiin käyttäen tilastollista pakettia Prism 5 ohjelmisto (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Erot analysoitiin Studentin t
-testi kahden ryhmän välillä tai yksisuuntainen ANOVA keskuudessa kolmeen ryhmään. Korrelaatio miR-214 ilmaisun ja kasvaimen koon ensisijainen GC laskettiin Spearmanin korrelaatiota. Selviytymisen käyrä, tiedot analysoitiin Log-rank testi. Voit määrittää, missä määrin ilmentymistä miR-214 voisi tehokkaasti erottaa eri kliinisen subsettings, vastaanotin toimii (ROC) käyrä analyysi rakennettiin ja alue käyrän alla (AUC) laskettiin arvioida kykyä miR-214 lauseke erottamaan välillä syöpätapausta ja nontumourous tapauksissa ja erottaa metastaattisen kudoksiin ja nonmetastatic kudoksiin. P
-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

MiR-214 on vaimentua mahalaukun karsinooma kudoksissa ja neljä GC solulinjat, verrattuna nontumourous mahalaukun

verrattuna 18 nontumourous mahalaukun limakalvon näytteitä, miR-214 oli merkittävästi vaimentua (noin kuusi-kertaisesti) 80 ensisijaisen mahalaukun kudosnäytteistä (kuvio 1A, P
= 0,0001). Vastaanotin toimii (ROC) käyriä miR-214 heijastunut vahva erottaminen GC kudosten ja nontumourous kudoksia, jonka pinta-ala käyrän alla (AUC) 0,7764 (Kuva S1A, 95%: n luottamusväli (CI), ,6466-,9062). Tasaisen, downregulation miR-214 oli validoitu neljässä mahalaukun solulinjoissa. Kuten kuviossa 1C on esitetty, MIR-214 ekspressiotaso GC solulinjoissa MKN28, BGC823, MKN45, ja SGC7901 oli merkittävästi heikennetty verrattuna 18 nontumourous mahalaukun kudosnäytteistä ( P
< 0,05).

olemme kuitenkin havainneet vielä alhaisempi ilmentymistä miR-214 GES-1, kuolemattomaksi mahalaukun epiteelisolujen linja, kuin neljässä GC solulinjoissa (kuvio 1 C, P
< 0,05). Me spekuloida ristiriita voi johtua ainakin osittain eroa kliiniset näytteet ja solulinjoista, koska solulinja, eristetty yhdeltä potilaalta, jolla on tietty sairaus, edustaa miRNA ilmaus allekirjoitus vain yhden kliinisestä näytteestä ja toukokuun aikana tapahtuneet muutokset solun kulttuuri in vitro
; Toisin sanoen, kudosnäytteet ovat paljon enemmän kuin ihmisen yhteydessä kuin solulinjat. Niinpä kommentoida että miR-214 ilmentymistä ihmisen GC kudoksissa oli edustava ja uskottava kuin todettu solulinjoissa.

Vähentynyt miR-214 ilmentyminen GC liittyy imusolmuke etäpesäke ja kasvaimen kokoa, mutta ei ole korrelaatio potilaan ennusteeseen

Voit selvittää mahdolliset kliinis vaikutuksia muuttunut miR-214 ilmaisua, yhdistimme qPCR tulosten ja kliinisten parametrit. Korrelaatiot miR-214 ekspressiotaso ja kliinis ominaisuudet GC on esitetty taulukossa 1. MiR-214-ekspressio korreloi käänteisesti kasvaimen koko (taulukko 1, t
-testi, P
= 0,0265; kuvio 1D, Spearman r = -0,2673, P
= 0,0083) ja imusolmuke etäpesäke (taulukko 1, Figure1A, t
-testi, P
= 0,0164). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa muihin kliinis ominaisuuksia, kuten sukupuoli, distaalinen etäpesäke, WHO histologinen luokitus, ja Lauren n histologinen tyyppi näiden ryhmien väliin.

Kiehtovaa, löysimme vaiheittaista downregulation miR-214 keskuudessa nontumourous maha- limakalvon, nonmetastasis kudoksia, ja etäpesäkkeiden kudoksissa (kuvio 1A, yksisuuntainen ANOVA, P
= 0,0006). Arvioidaan miR-214 ilmaisun GC uutena biomarkkeri imusolmuke etäpesäke, ROC käyrät perustettiin. Havaitsimme selkeitä erottamiset potilaiden imusolmuke etäpesäke ja ilman imusolmuke etäpesäke, ja AUC 0,5880 (kuva S1B, 95% CI, 0,4526-0,7166). Ensisijainen mahalaukun kudokset jaettiin edelleen matalan etäpesäkkeiden ryhmä ja korkean etäpesäke mukaisessa ryhmässä lukumäärän imusolmuke etäpesäke (LNM): alhainen etäpesäkkeiden määriteltiin tapaukset, joissa on alle kuusi LNM, ja tapaukset, joissa on enemmän kuin kuusi LNM pidettiin korkealla etäpesäke. Kuten odotettua, miR-214 ilmentyminen laski rajusti vuonna korkean etäpesäke ryhmässä verrattuna matalan etäpesäkkeiden ryhmä (kuvio 1 B, P
= 0,045).

mukaisesti kudosnäyte data osoittaa korrelaatio miR-214 ilmaisun ja LNM, huomasimme, että verrattuna melko hyvin erilaistuneet solulinjan MKN28, miR-214 ilmentyminen oli selvästi vähemmän huonosti eriytetty solulinjat MKN45 ja BGC823, ja erityisesti metastaattisen solulinja SGC7901 [14] ( P
< 0,05).

kuitenkin meidän tiedot osoittivat merkittävää eroa miR-214 ilmentymisen 18 ensisijainen mahalaukun kudosnäytteitä ja niiden toissijainen etäpesäkkeiden loci (kuvio 1 B P
= 0,2676). Nämä tulokset viittaavat siihen, että downregulation miR-214 ilmentyminen tapahtui alkuvaiheessa LNM kehityksen ja pysyi vakaana ilman vaimennus myöhäisessä vaiheessa etäpesäke.

edelleen tutkia vaikutusta miR-214 ennusteeseen potilaat, olemme analysoineet ekspressiotasot miR-214 tapauksissa eri uusiutumisen tila ja selviytymistä olosuhteissa. Kuitenkin meidän tiedot osoittivat, että ei ollut selvemmin eroa uusiutuminen ryhmän ja nonrelapse ryhmä, tai välillä selviytymisen ryhmän ja kuoleman ryhmä (kuva 2A-B, t
-testi, P
> 0,05). Huomattavaa on, että jaoimme potilaita korkean ilmentymisen ja alhaisen ilmentymisen ryhmien perusteella mediaani tason miR-214 ilmaisua, ja Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrien ei todettu merkitsevää korrelaatiota miR-214 ilmaisun ja uusiutumisen elinaika (kuvio 2C , riskisuhde (HR) 1,23, 95%: n luottamusväli (CI) +0,6596-+2,285; P
= 0,5781) tai yleiseen eloonjäämiseen (kuvio 2D, HR 1,20, 95% CI +0,6667-2,151; P
= 0,5832) potilailla, joilla GC.

vaikutus miR-214 soluproliferaatioon GC solujen

seurataan transfektion tehokkuuden, päätimme miR-214 ilmentymisen RT-qPCR at 24, 48, ja 72 h transfektion jälkeen MIR-214 prekursori- tai inhibiittori, joka on transfektoitujen solujen ja ilmaistaan ​​jatkuvasti miR-214 ilmentyminen lentivirusvektoreita käsiteltyjen solujen 4 viikkoa. Kuten odotettua, transfektio miR-214 esiaste tehokkaasti johtanut merkittävään yli-ilmentymiseen miR-214 (Kuva S2A-B, P
< 0,05) ja miR-214 estäjän silmiinpistävän vähensi miR-214 ilmentyminen asennuspalveli- 214 estäjä-transfektoiduissa soluissa kuin negatiivinen ryhmät (kuva S3E-F, kuva S4 A, P
< 0,05). Lisäksi olemme havainneet, että transfektoitujen solujen lentivirus vector LV3-HSA-miR-214 voisi johtaa 7-96-kertainen muutos miR-214 ilmentymistä SGC7901 ja MKN45 soluja (kuvio S3A-D, P
< 0,05), jossa on 80% -90% soluja, jotka ekspressoivat GFP markkeriproteiinia (kuvio S3A, B).

sen määrittämiseksi, onko miR-214 voi vaikuttaa leviämisen GC-solujen, edu lisääntymisen määrityksessä käytettiin havaitsemaan solujen kykyä kasvaa. Tuloksemme osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-214 lentiviurs vektoreita tai miR-214 esiaste ei vaikuttanut solujen kasvuun SGC7901 (kuva 3A-B, Kuva S2C-D, P > 0,05) ja MKN45 solulinjoissa (kuvio S2E-F, kuva S5a-B, P > 0,05). Olemme kuitenkin havainneet, että downregualtion Mir-214 voisi edistää leviämisen BGC823 (kuva 3C-D, P
= 0,0010) ja GES-1 (Kuva S4b-C, P
= 0,0474), mutta ei MKN28 solulinjassa (kuvio S5c-D, P
= 0,0938), solussa-spesifisellä tavalla.

Role of miR-214 solumigraation ja hyökkäys GC solut

Koska miR-214 ilmentyminen oli käänteisesti yhteydessä imusolmuke etäpesäke, olimme erityisen kiinnostuneita kyky miR-214 vaikuttaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Tuloksemme osoittivat, että SGC7901 ja MKN45 transfektoitujen solujen LV3-HSA-miR-214, oli huomattavasti vähentynyt muuttoliikkeen ja invaasio ominaisuus verrattuna LV3NC käsiteltyjen solujen (kuvio 4A-B, kuvio S6A-B, P
< 0,05). Ja havaitsimme, että downregualtion Mir-214 voisi helpottaa siirtymistä ja hyökkäys MKN28 (kuva 4C-D, P
= 0,0491 ja P
= 0,0127, vastaavasti). Vaikka knockdovvn miR-214 ei vaikuttanut muuttoa GES-1-soluissa (kuvio S4d-E, P
= 0,0879), vaimentaminen miR-214 johtivat yli 40% lisäys invasiivisia ominaisuuksia näiden solujen ( P
= 0,0046). Kuitenkin meidän tiedot osoittivat, että transfektointi miR-214 edeltäjä ei ollut vankka vaikutus solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen SGC7901 (kuva S2G-H, P
> 0,05) ja MKN45 (kuvio S2I-J, P
> 0,05) soluja, verrattuna vastaaviin negatiivisiin kontrolleihin.

vaikutus miR-214-solujen apoptoosin GC solujen

vaikutuksen tutkimiseksi asennuspalveli- 214-solujen apoptoosin, suoritimme apoptoosin määrityksiä käyttämällä anneksiini V-FITC /PI värjäystä menetelmällä. Tuloksemme osoittivat, että yli-ilmentyminen (miR-214 edeltäjän ja lentivirus vektori) ja pudotus on miR-214 ei voi vaikuttaa apoptoosia ilmeisesti verrattuna negatiivisiin kontrolleihin neljässä GC solulinjoissa (kuvio 5, kuvio S2K-N, P
> 0,05) ja kuolemattomaksi mahalaukun solulinja GES-1 (tietoja ei esitetty). Itse asiassa huomasimme, taipumus pro-apoptoosi kyky miR-214 esiasteen MKN45 solulinjassa (kuvio S2M-N, P
= 0,0606), mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä.

MiR-214 suoraan suunnattu ja down-regulation CSF1 mahalaukun syöpäsoluissa

tunnistaa tavoitteiden miR-214, käytimme TargetScan algoritmia ennustamaan miR-214 tavoitteet ihmisen mahasyövän. Joukossa lukuisia mahdollisia ehdokkaita, keräsimme niitä yli-ilmennetään syöpien ja proliferation- ja etäpesäkkeiden liittyvien geenien, kuten NOTCH2, FGFR1, CSF1 (kuvio 6A), AGAP2, CREB1, tarkempaa analysointia. Tuloksemme osoittivat, että miR-214 esiaste transfektio vähensi aktiivisuutta lusiferaasireportterigeeniin fuusioitu CSF1 3'-UTR: n, jossa on 29,60% ja 30,61%: n vähennys, verrattuna negatiiviseen kontrolliin ryhmät (kuvio 6B, P
= 0,0227 ja 0,0093, vastaavasti, MKN45 ja BGC823 solulinjoilla). Kun taas kun miR-214 estäjä transfektoitiin, lusiferaasiaktiivisuus lisääntyi 34,49% ja 42,25% vuonna MKN45 ja BGC823 solujen kontrolleihin verrattuna (kuvio 6C, P
= 0,0115 ja 0,0085 vastaavasti).

lisäksi määrittää ilmaisun CSF1 proteiinin western blot GC transfektoiduissa soluissa miR-214 esiaste tai estäjä. Yhdenmukainen lusiferaasin tuloksia, ekspressio CSF1 proteiinin väheni merkitsevästi SGC7901 ja MKN45 soluja (kuvio 6D-E, P
= 0,0037 ja 0,0066, vastaavasti), jotka oli transfektoitu miR-214 edeltäjän ja kasvoi MKN28 ja BGC823 soluja (kuvio S7A-B, P
= 0,0049 ja 0,0416, vastaavasti), jotka oli transfektoitu miR-214-estäjän, verrattuna verrokkeihin nähden. Nämä tiedot osoittivat, että miR-214 estää CSF1 käännös mahalaukun syöpäsoluja.

Keskustelu

Kehittyvät näyttöä on korostanut ratkaiseva vaikutus miRNA dysregulation on tuumorigeneesiä ihmisen karsinoomien [3], [4] . MiRNA säätelyhäiriötä edistää solujen lisääntymistä, antaa resistenssin apoptoosia ja parantaa invasiivisuus ja etäpesäkkeiden kautta tukahduttaa alavirran tuumorisuppressoreilla tai indusoimalla kertyminen kohde onkogeenien, ja näin on mukana aloittamisen, eteneminen, ja etäpesäkkeiden ihmisen kasvaimista.

joukossa lukuisia miRNA, häiriöstä miR-214 löytyi runsaasti ihmisen syövissä [15] - [22]. Downregulation miR-214 kohdunkaulan syövän on raportoitu useita ryhmiä, ja miR-214 on osoitettu estävän kasvua, muuttoliike, ja hyökkäys kohdunkaulan syöpäsolujen kohdistamalla onkogeenien MEK3, JNK1, Plexin-B1, ja GALNT7 [15 ] - [17]. MiR-214 on myös todettu olevan vähentynyt rintasyöpä ja edistää rintojen tuumorigeneesiä sallimalla poikkeavasti kohonnut onkogeeni Ezh2 keskittymisen ja myöhemmät valitsematta soluproliferaation ja invaasiota [18]. Kuitenkin Penna et ai. ovat osoittaneet, että miR-214 ilmentyy voimakkaasti ihmisen melanoomat ja edistää melanooma kasvaimen etenemistä kautta tukahduttaminen TFAP2C, homologin vakiintunut melanooma tuumorisuppressorigeenin [19]. Nämä tulokset osoittavat, että rooli miR-214 syöpä on kudos- tai solu- spesifisiä.

Tuore tutkimus Ueda et al. osoittivat, että häiriöstä miR-214 korreloi kliiniseen vaiheeseen, vatsakalvon levittäminen ja potilaiden selviytymiseen [20]. Kuitenkin tarkka rooli miR-214 etenemisessä mahalaukun syöpä ja sen taustalla molekyylitason mekanismi on edelleen heikko. Tässä osoitamme, että miR-214 väheni huomattavasti GC, etenkin metastaattisen kudoksissa, mikä viittaa mahdolliseen rooliin miR-214 ennustettaessa imusolmuke etäpesäke, jota tukee lisäksi meidän ROC käyrä analyysi. Lisäksi olemme havainneet, että alhainen ilmentyminen miR-214 oli taipumusta suurempaan kasvaimen kokoa. Puuttumaan onko dysregulaatio miR-214 kantaa biologista merkitystä, me hyödynsi seurantatutkimuksen ja funktionaalinen analyysi miR-214 in vitro
. Siitä huolimatta meidän tiedot viittaavat siihen miR-214 ei ole vaikutusta potilaiden hoitotuloksiin, mukaan lukien uusiutumisen tila ja selviytymistä. Tuloksemme osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-214 lentivirus miR-214 ilmentävä vektori vähentynyt voimakkaasti muuttoliike ja hyökkäys GC solulinjojen ja knockdovvn miR-214 voisi helpottaa solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike ja invaasio soluun sopivalla tavalla, jossa mitään vaikutusta solujen apoptoosiin.

CSF1 (stimuloiva tekijä 1 (makrofagi)) on kriittinen hematopoieettisen kasvutekijän mukana makrofagisolulinjassa erilaistumista, lisääntymistä ja aktivointia ja se on myös läsnä ei-hematopoieettisten solujen [21] . CSF-1 vaikuttaa solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota sitoutumalla sen koodaama reseptori c-fms-geenin [22]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CSF1 kohdistama tärkeä rooli edistää kasvaimen angiogeneesin leiomyosarkooma [23] ja Lewisin keuhkokarsinooma soluihin VEGF induktion [24]. Aligeti S et ai. ehdotti, että CSF1 on positiivinen vaikutus kiinnittymiseen keuhkopussin mesoteelisolujen, invaasio ja lisääntyminen kohdun limakalvon epiteelisolujen [25]. Ja kohonneet pitoisuudet seerumissa on korreloivat sairauden vaiheessa, imusolmuke etäpesäke ja huonon ennusteen peräsuolen syöpäpotilailla [26]. Täällä tunnistimme CSF1 oli välittömänä kohteena miR-214 mahasyövän kautta Lusiferaasimäärityksiä ja vahvistettiin edelleen western blot-analyysi. Meidän tiedot osoittivat, että downregulation miR-214 voi helpottaa solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion kapasiteetti mahasyövän solun kautta CSF1 välittämä signaalireitin.

Aiemmassa tutkimuksessa, Ueda et al. osoittivat, että suhteellisesti suurempi ilmentyminen miR-214 GC liittyi epäedullinen eloonjäämisaste 101 potilasta (saatu Tokion yliopisto ja Hiroshiman yliopisto) [20], mutta meidän tulokset osoittivat, että miR-214 ei merkittävästi korreloi potilaan tulokset. Oletamme, että tämä ristiriita saattaa johtua siitä, että eri miRNA ilmaisua havaitsemismenetelmiä, otoskoot, ja seuranta kertaa välillä tutkimus- ja meidän. Ueda et ai. jaettu näytteet kahteen luokkaan (korkea ja matala ilme) käyttämällä keskimääräistä tasoa miRNA ilmaisun mitattiin microRNA microarray kuin kynnys, kun taas meidän jako korkean ja matalan ilmaisun ryhmien perustui mediaani ekspressiotaso saatujen qPCR tuloksista . Kiehtovan, aiemmissa tutkimuksissa, miR-214 ilmentymisen on osoitettu olevan yliaktiivista munasarjasyöpää verrattuna normaaliin munasarjan soluihin Yang et al. [27], kun taas vastakkainen tuloksista raportoivat myös Nam et al. [28]. Molemmat nämä kaksi ryhmää käytetään miRNA mikrosiruja tutkia miRNA ilmaisua. Siten emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että mikrosiruanalyysi ei ehkä ole yhtä herkkä ja tarkka analysoinnissa ilmentymisen profiilit tietyn miRNA. Mitä vaikutusta miR-214 ennusteeseen potilaiden GC, osittain yhdenmukainen tulosten Ueda et al., Löysimme myös taipumus, että korkea ilmentyminen miR-214 oli epäsuotuisa hengissä, kun seuranta-aika oli pidempi kuin 40 kuukautta (riskisuhde (HR) = 1,19 ja kokonaiselinaika, HR = 1,23 uusiutumisen-elinaika), kuten kuvassa 2, vaikka suuntaus ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Joka tapauksessa lisätutkimuksia suuremmalla kohortti ja erilaisia ​​kokeellisia asetuksia tarvitaan ongelman ratkaisemiseksi.

Mitä diskordanssi- Mir-214 lentivirusvektoreita ja esiaste transfektiokokeissa, me arvelevat se on erityinen seurausta biologiset aktiivisuudet miR-214. Kohtalainen ja vakaa ilmaisun sijasta kymmeniä tuhansia kuin fysiopatologisten overexpresion voi auttaa miR-214 toimi hyvin.

Yhdessä olemme osoittaneet, että miR-214 väheni huomattavasti GC, etenkin metastaattisen kudoksissa, mikä viittaa siihen, potentiaalinen rooli miR-214 ennustettaessa imusolmuke etäpesäke. Meidän ROC-käyrä analyysi osoitti, että suhteellisen korkea spesifisyys ja herkkyys miR-214 erotteleva GC tapausten nontumourous valvontaa, ja erottamalla potilaiden kanssa ja ilman imusolmuke etäpesäke, siten pakottaen sen mahdollisen käyttökelpoisuuden uutena biomarkkeri GC ja imusolmukkeen etäpesäke, joka on hyödyllistä helpottaa kliinisessä hoidossa GC. Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että miR-214 ei ole vaikutusta potilaan ennusteeseen, mikä osoittaa, että miR-214 ei yksin riitä vaikuttavan potilaan selviytymistä.

• PLoS ONE: plasman D-dimeeri Levels korreloi Long Term Survival of mahasyöpäpotilaista
• PLoS ONE: HIF-1 yli-ilmentyminen korreloi Poor Overall Survival ja tautivapaan elinajan in mahasyöpäpotilaista Post-gastrectomy