PLoS ONE: клинико-патологическими Значение микроРНК-214 в рака желудка и его влияние на клетки Биологическая Behaviour

Абстрактный
<р> Накопленные данные указывает на то, что многочисленные микроРНК участвуют в онкогенеза и прогрессии рака желудка, в то время как клиническое значение микроРНК-214 при раке желудка мало изучен и точная роль микроРНК-214 при раке желудка остается неясным. В настоящем исследовании, уровни экспрессии микроРНК-214 в 80-желудочных тканях карциномы, 18 nontumourous желудка тканей, а также 4-х типов желудочных линий раковых клеток количественно определяли с помощью обратной транскрипции с последующей реальном времени количественной полимеразной цепной реакции (RT-КПЦР), а также взаимосвязь между экспрессией микроРНК-214 и cliniopathological характеристик, включая прогноз был исследован. Для того, чтобы исследовать потенциальную роль микроРНК-214 в желудочном биологического поведения раковых клеток, мы провели пролиферации клеток, апоптоз, миграцию и инвазию анализы в четырех желудочных линиях раковых клеток и увековечил желудка клеточная линия в пробирке
. Наши результаты показали, что микроРНК-214 резко подавлена ​​в желудочных тканях рака желудка и линий раковых клеток, по сравнению с nontumourous желудочных тканей. наблюдалась Поэтапное понижающая регуляция экспрессии микроРНК-214 среди nontumourous слизистой оболочки желудка, nonmetastasis желудка тканей рака, и метастазирование раковых тканей желудка. Выражение микроРНК-214 был значительно в обратной зависимости от метастазов в лимфатических узлах и размер опухоли, но не имели корреляцию с прогнозом пациента. Эктопическая экспрессия микроРНК-214 может ингибировать клеточную миграцию и способность вторжения в раковых клетках желудка SGC7901 и MKN45. И нокдаун микроРНК-214 значительно облегчено клеточную пролиферацию, миграцию и инвазии в клетки-специфическим образом в MKN28, BGC823 и клеток ГЭС-1. Колониестимулирующий фактор 1 (CSF1) был идентифицирован в качестве целевого гена микроРНК-214. Таким образом, наши данные показали, что микроРНК-214 является перспективным новым биомаркером для узла метастаза лимфатический у больных раком желудка. И мы определили, что отрицательная регуляция микроРНК-214 может регулировать пролиферацию, инвазию и миграцию клеток рака желудка путем непосредственного таргетинга CSF1
<р> Образец цитирования:. Ван YW, Ши DB, Чэнь X, Гао C, Гао P (2014 ) клинико-патологическими Значение микроРНК-214 в рака желудка и его влияние на клетки биологического поведения. PLoS ONE 9 (3): e91307. DOI: 10.1371 /journal.pone.0091307
<р> Редактор: Теренс Ли, Университет Гонконга, Гонконг
<р> Поступила 25 апреля 2013 года; Принято: 11 февраля 2014 года; Опубликовано: 10 марта 2014
<р> Copyright: © 2014 Wang и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 81172351 и 81372856). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной смертности от рака во всем мире [1]. Несмотря на значительные исследования по tumourigenesis и прогрессировании ГХ, патогенез этого сложного заболевания мало изучен. Таким образом, имеет жизненно важное клиническое значение для идентификации и характеристики точный молекулярный механизм, участвующий в развитии и прогрессии рака желудка.
<Р> Помимо обычных генетических и эпигенетических изменений белок-кодирующих генов онкогенов и опухолевых супрессоров в канцерогенезе ГК, небелковых-кодирующих РНК, особенно микроРНК (миРНК), возникли в качестве нового игрока, чтобы пролить свет на механизм развития ГК [2]. МикроРНК эндогенные 19-25 нт некодирующие РНК, которые отрицательно регулируют экспрессию белка, способствуя деградации мРНК или подавляя трансляции белка, через взаимодействие с 3'-UTR целевых мРНК. Все большее число микроРНК было зарегистрировано для участия в канцерогенеза и развития раковых заболеваний человека, в том числе GC [2] - [4]. Эти микроРНК обычно дизрегуляции и функционируют либо как супрессоров опухолей или онкогенов в инициации и прогрессии человеческих карцином. Например, Цукамото и др. показали, что микроРНК-375 подавляются при раке желудка и оказывает свое действие через проапоптотического downregulating PDK1, киназы, которая фосфорилирует Akt, и, в свою очередь, подавляет PI3K /Akt пути [5]. В то время как микроРНК-21 было установлено, способствуют пролиферации опухоли и инвазии в GC путем негативной регуляции важных опухолевых супрессоров, таких как PTEN, Pdcd4 и RECK, а затем придают GC клеток с повышенной инвазивности и способности избегать anoikis [6] - [8 ]. Ранее мы обнаружили, что микроРНК-145 был подавляются в многообразии человеческих раковых клеток, подавляя вторжение-метастазирования каскад в GC путем ингибирования N-кадгерин белка перевод [9], [10].
<Р> В настоящее время, клиническая значимость микроРНК-214 (MIR-214) в прогнозе пациентов с GC плохо изучено, и точная роль микроРНК-214 в GC остается неясным. Здесь мы исследовали связь между микроРНК-214 и экспрессии cliniopathological параметров, а также оценивали влияние микроРНК-214 на биологические поведения, включая пролиферацию клеток, апоптоз, миграцию и вторжение в GC клетки.

Материалы и методы

образцы тканей

образцы ткани получают подобным образом, как описано ранее [9]. Вкратце, 80 образцов (от 65 мужчин, 15 женщин; 58,3 ± 17,49 и 61,5 ± 9,162 лет, соответственно) ГЦ тканей были получены у пациентов, перенесших хирургическую резекцию на Ци Лу больницы Шаньдун университета с 2004 по 2006 Nontumourous слизистой оболочки желудка более 3 см от опухолей была случайным образом выбирается из 18 из этих пациентов, и использовали в качестве контролей. Ни один из пациентов не получал предоперационного лечения, такие как лучевая терапия или химиотерапия. Образцы были напечатаны гистологически в соответствии с Лорен и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) относится к классификации (IARC Press, Лион, 2000), а также по категориям в соответствии с UICC 2002 TNM классификации.

Заявление по этике
<р> исследование было одобрено Комитетом по этике медицинского факультета университета Шаньдун, Шаньдун, Китай (код утверждения: 201101015) путем. Мы получили письменное информированное согласие от всех участников, участвующих в нашем исследовании.

Культура клеток
<р> Четыре типа линий человека GC клеток были получены из Американской коллекции типовых культур (MKN28 и MKN45, Manassas, VA , США) и института рака Шанхай (BGC823 и SGC7901, Шанхай, Китай). Увековечены слизистой желудка эпителиальных клеток линии GES-1 была получена из Пекина ComWin Biotech Co., Ltd. (Пекин, Китай). Клетки поддерживали в среде RPMI 1640 культуральной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в увлажненной клеток инкубаторе с атмосферой 5% CO <югу> 2 при 37 ° С.

микроРНК экстракция

Использование комплекта miRNeasy FFPE (Bioteke, Пекин, Китай), мы выделили микроРНК из парафиновых срезах тканей в соответствии с инструкциями изготовителя. Общую РНК клеточных линий экстрагировали с использованием реагента тризола (Takara, Далянь, Китай) в соответствии с протоколом производителя. Качество и количество образцов РНК оценивали с помощью стандартных спектрофотометрических методов (Биофотометре плюс; Эппендорф, Гамбург, Германия) и разбавляют до 2 нг /мкл для анализа RT-КПЦР

обратной транскрипции с последующей реальном времени. количественной полимеразной цепной реакции (RT-КПЦР)
<р> уровни экспрессии микроРНК были количественному с использованием набора SYBR Primescript микроРНК RT PCR (Takara, Далянь, Китай) в соответствии с инструкциями изготовителя при Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Real -Time система. Вкратце, образцы РНК были преобразованы в кДНК с помощью одностадийного синтеза Primescript miRNAcDNA Kit (Takara, Далянь, Китай), а затем в режиме реального времени КПЦР и нормализовали с использованием U6 небольших ядерных РНК (RNU6B) на 2 ^{-ΔCT метод. Грунтовки для MIR-214 и U6 были из GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Все реакции проводились в двух экземплярах.}

трансфекции клеток
<р> Экспоненциально растущие клетки (1,5 × 10 5) были высеяны в 12-луночные планшеты 12 ч до трансфекции и трансфицировали 30 нМ микроРНК-214-предшественник (микроРНК-214), анти-микроРНК-214 ингибитор (ингибитор микроРНК-214), или отрицательный контроль (Амбион, Остин, штат Техас, США) с помощью трансфекции реагента X-tremeGENE (Roche Applied Science, Индианаполис, IN, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Эффективность трансфекции контролировали с помощью RT-КПЦР в 24, 48 и 72 ч после трансфекции.
<р> Для стабильной экспрессии микроРНК-214, SGC7901 и MKN45 клетки трансфицировали лентивирусов микроРНК-214-выражающей вектор LV3-HSA -miR-214 или отрицательный контроль LV3NC, который имеет GFP в качестве маркерного белка, в соответствии с протоколом производителя (GenePharma, Шанхай, Китай). Через три дня после трансфекции, экспрессия белка GFP контролировали под флуоресцентным микроскопом. Эти трансфицированные клетки подвергали скринингу с пуромицин (1,5 мкг /мл) для тех, стабильно экспрессирующих микроРНК-214.

Пролиферация клеток анализ
<р> После трансфекции клетки обрабатывали трипсином, подсчитывали и высевали на 96 -Ну планшеты при плотности 5 × 10 3 клеток /лунку. А затем пролиферацию клеток измеряли с помощью анализа пролиферации ОБР, как сообщалось ранее [11]. Коротко говоря, через 24 ч после трансфекции клетки культивировали в трех экземплярах на 5 × 10 3 клеток на лунку в 96-луночные планшеты за день до Edu инкубации (Ribobio, Гуанчжоу, Китай). После того, как маркировка ОБР, клетки обрабатывали 100 мкл 1 × Apollo реакции коктейле, окрашивали 100 мкл Hoechst 33342 (5 мкг /мл) и исследовали под флуоресцентным микроскопом (Olympus, Япония). Процент ОБР положительных клеток была определена как скорость пролиферации. Данные были получены из трех независимых экспериментов и представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD).

апоптозом клеток анализ
<р> Через три дня после трансфекции микроРНК-214 предшественника или ингибитора, клетки собирали и окрашивали используя V-FITC /PI апоптоз Detection Kit аннексина (BestBio, Шанхай, Китай), как описано ранее [12]. Короче говоря, клетки трипсином, собирали и затем окрашивают с использованием аннексина V-FITC /PI Апоптоз Обнаружение комплект в соответствии с инструкциями изготовителя. После инкубации с аннексина V-FITC и PI, Апоптические клетки сразу анализировали с помощью проточной цитометрии. В начале апоптотических клеток были определены как населения, который был отрицательным ПИ и аннексина V-FITC, положительный, в то время как в конце апоптотических клеток были положительными ПИ и аннексина V-FITC положительный. Общая апоптическая ставка была рассчитана как ранний апоптотических ставка плюс позднего апоптотических скорости. Аннексина V-PE /7-ААР Апоптоз Обнаружение Комплект (Keygen, Нанкин, Китай) был использован для анализа апоптозу лентивирусом векторных трансфицированных клеток, аналогичные приведенным выше протоколам. Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах, а также были представлены данные, как средство ± SD.

Миграция клеток и вторжение анализы
<р> миграции клеток и вторжения анализы проводили, как описано ранее [13]. Анализ миграции проводили с Transwell вставками с 8,0 мм мембраны с размером пор (формат 24-луночного, Corning, Нью-Йорк, США). Для измерения вторжения способность GC клеток, ранее упомянутые вставки были предварительно покрыты матрицей Матригель (BD Science, Sparks, MD, США). Клетки (1 × 10 5) повторно суспендировали в среде без сыворотки и высевали в верхней камере. Нижние камеры были заполнены полной культуральной средой, содержащей 10% FBS. После инкубации при температуре 37 ° С в течение 24 ч, мигрировавшие клетки, присутствующие на нижней стороне мембраны, фиксировали, окрашивали и подсчитывали. Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах.

были выполнены люциферазы
<р> Dual-люциферазы анализы, как описано ранее [9]. 3'-UTR фрагменты гена CSF1, содержащего сайт связывания микроРНК-214, амплифицировали с помощью ПЦР из РНК клеток MKN45 с использованием праймеров в таблице S1, и встраивали в сайт Xba1 целевых вектора экспрессии, pmirGLO микроРНК (Promega, Сан-Lius Обиспо, Калифорния, США). Полученный вектор был назван pmirGLO-CSF1. Для анализа люциферазы репортера, MKN45 и BGC823 клетки высевали в 12-луночный планшет, за день до трансфекции. Клетки котрансфицируют с 30 нМ микроРНК-214 предшественника или ингибитора микроРНК-214, отрицательного контроля и 30 нг pmirGLO-CSF1 с помощью X-tremeGENE трансфекции реагента (Roche Applied Science). После 48 ч трансфекции, активность люциферазы измеряли с использованием системы двойного анализа люциферазы (Promega) и нормированной на активность люциферазы Renilla. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях.

Вестерн-блот
<р> Через 48 часов после трансфекции с микроРНК-214 предшественника или ингибитора, клетки подвергали Вестерн-блот-анализом, как описано ранее [19]. Вкратце, белок экстрагируют из клеток или тканей. Лизаты были решены с помощью электрофореза, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и смыл с антителами против CSF1 (1:1000, Epitomics) или бета-актина (1:1000, Santa). Данные были получены из трех независимых экспериментов.

Статистический анализ
<р> Анализы были проведены с использованием статистического пакета Prism 5 программное обеспечение (GraphPad Software, Сан-Диего, штат Калифорния, США). Различия были проанализированы с помощью студента т
-test между двумя группами или с односторонним ANOVA среди трех групп. Корреляции между экспрессией микроРНК-214 и размера опухоли в первичном GC рассчитывали по корреляции Спирмена. В кривой выживаемости, данные анализировали с помощью логарифмического рангового теста. Для того, чтобы определить, в какой степени экспрессии микроРНК-214 может эффективно разделять различные клинические subsettings, приемник работает анализ характеристика (ROC) кривая была построена и площадь под кривой (AUC) рассчитывали для оценки способности экспрессии микроРНК-214 дифференцироваться между случаями рака и nontumourous случаев, а также различать метастатических ткани и неметастатической тканей. P
-значения менее 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

MIR-214 подавляются в желудочных тканях карциномы и четырех линий GC клеток, по сравнению с nontumourous слизистой оболочки желудка
<р> по сравнению с 18 nontumourous образцов желудочного слизистой оболочки, микроРНК-214 была значительно подавлена ​​(примерно в шесть раз) в 80 первичных образцов желудочных ткани (рис 1А, P
= 0,0001). Приемник работает характеристика (ROC) кривые MIR-214 отражается сильное разделение между ГЦ тканей и nontumourous тканей, с площадью под кривой (AUC) от 0.7764 (рис S1A, 95% доверительный интервал (ДИ), 0.6466-0.9062). Последовательно, понижающая регуляция микроРНК-214 была подтверждена в четырех клеточных линиях желудка. Как показано на рисунке 1С, уровень экспрессии микроРНК-214 в ГХ клеточных линиях MKN28, BGC823, MKN45 и SGC7901 заметно аттенуированных по сравнению с 18 nontumourous образцов желудочного тканей ( P
&л; 0,05).

Тем не менее, мы обнаружили еще более низкую экспрессию микроРНК-214 в ГЭС-1, иммортализованной желудочной эпителиальной клеточной линии, чем в четырех GC клеточных линий (рис 1C, P
&л; 0,05). Мы полагаем, Рассогласование может быть обусловлено, по крайней мере, частично к разнице между клинических образцов и клеточных линий, так как линия клеток, выделенных из одного пациента с определенным заболеванием, представляет собой выражение микроРНК подпись только одного клинического образца и, возможно, изменения в процессе клеточного культура в пробирке
; Другими словами, образцы ткани намного больше, как человеческий контекст, чем клеточные линии. Таким образом, мы поясняем, что микроРНК-214 экспрессии в тканях человека GC был более представительным и заслуживающим доверия, чем найти в клеточных линиях.

убывала экспрессии микроРНК-214 в GC связан с метастазов в лимфатических узлах и размера опухоли, но не имеет корреляция с прогнозом пациента

Для того, чтобы определить потенциальные последствия клинико-измененную экспрессию микроРНК-214, мы объединили результаты КПЦР и клинические параметры. Корреляция между уровнем экспрессии микроРНК-214 и клинико-патологическими характеристик ГХ приведены в таблице 1. MIR-214 экспрессия обратно коррелирует с размером опухоли (таблица 1, т
-теста, P
= 0,0265; рис 1D, Спирмена г = -0,2673, P
= 0,0083) и метастазов в лимфатических узлах (Таблица 1, Figure1A, т
-test, P =
0,0164). Тем не менее, не было никаких существенных различий в других клинико-патологических особенностей, таких как пол, дистальной метастаз, ВОЗ гистологической классификации и гистологического типа Лорена между этими двумя группами.
<Р> Intriguingly, мы нашли ступенчатое понижающей регуляции MIR-214 среди nontumourous желудка Слизистая оболочка, ткани nonmetastasis и метастазирование ткани (рис 1А, в одну сторону ANOVA, P
= 0,0006). Для оценки экспрессии микроРНК-214 в GC как новый биомаркер для метастазов в лимфатических узлах, были созданы кривые ROC. Мы наблюдали четкое разделение между пациентами с метастазов в лимфатических узлах и те, без метастазов в лимфатических узлах, с АУК 0.5880 (рис s1b, 95% ДИ, 0.4526-0.7166). Первичные желудочные ткани были дополнительно разделены на низкой метастаз группы и высокой метастаз группы в соответствии с числом метастазов в лимфатических узлах (ММШ): низкая метастаз был определен как случаи с менее чем шестью LNM, а также случаев с более чем шестью LNM считались высокой метастаз. Как и ожидалось, экспрессия микроРНК-214 резко снизилось в группе с высокой метастазирования по сравнению с низким уровнем метастазирования группы (рис 1В, P
= 0,045).
<Р> В соответствии с образцом ткани данные, указывающие на корреляцию между экспрессией микроРНК-214 и LNM, мы обнаружили, что, по сравнению с умеренно дифференцированной клеточной линии MKN28, микроРНК-214 выражение было заметно меньше в слабо дифференцированных клеточных линий MKN45 и BGC823, и особенно метастатическим клеточная линия SGC7901 [14] ( P
&л; 0,05)
<р> Тем не менее, наши данные не выявили существенных различий экспрессии микроРНК-214 в 18 образцах первичных тканей желудка и их вторичного метастазирования локусов (рис 1В. , P
= 0,2676). Эти результаты свидетельствуют о том, что подавление экспрессии микроРНК-214 произошло в ранней стадии развития LNM и оставался стабильным без дальнейшего ослабления в поздней стадии метастазирования.
<Р> Для дальнейшего изучения влияния MIR-214 на прогноз пациентов, мы проанализировали уровни экспрессии микроРНК-214 в случаях с различным статусом рецидивов и выживаемости условий. Тем не менее, наши данные показали, что не было выраженной разницы между рецидивом и группой nonrelapse, или между группой выживания и группы смерти (рис 2А-В, т
-test, P
> 0,05). Следует отметить, что мы разделили пациентов на высокой экспрессии и низким уровнем экспрессии группы, основанные на медианного уровня экспрессии микроРНК-214, и кривые выживаемости Каплана-Мейера не показал значимой корреляции между микроРНК-214 экспрессии и безрецидивной выживаемости (рис 2C , отношение рисков (HR) 1,23, 95% доверительный интервал (ДИ) 0.6596-2.285; P
= 0,5781) или общей выживаемости (рис 2D, HR 1,20, 95% ДИ 0.6667-2.151; P
= 0,5832) у пациентов с GC.

Влияние микроРНК-214 на пролиферацию клеток GC клеток

Для того, чтобы контролировать эффективность трансфекции, мы определили микроРНК-214 экспрессию с помощью RT-КПЦР на 24, 48 и 72 ч после трансфекции в предшественнике микроРНК-214 или ингибитор трансфецированных клеток и непрерывно обнаруживаются микроРНК-214 экспрессию лентивирус векторов клеток, обработанных в течение 4-х недель. Как и ожидалось, трансфекция предшественника микроРНК-214 эффективно привело к значительному сверхэкспрессии MIR-214 (рис S2A-B, P
&л; 0,05) и ингибитор микроРНК-214 поразительно пониженную экспрессию микроРНК-214 в зер- 214 ингибитор трансфецированные клетки, чем отрицательных групп (рис S3E-F, рис S4 A, P
&л; 0,05). Кроме того, мы обнаружили, что клетки, трансфицированные лентивирусов вектором LV3-HSA-MIR-214 может привести к 7 до 96-кратного изменения экспрессии микроРНК-214 в SGC7901 и MKN45 клеток (рис S3A-D, P
&л; 0,05), с 80% -90% клеток, экспрессирующих GFP маркер белка (рис S3A, B)
<р> для того, чтобы определить, может ли микроРНК-214 влияет на пролиферацию клеток GC, анализ пролиферации Edu привык. обнаружить способность роста клеток. Наши данные показали, что избыточная экспрессия микроРНК-214 с lentiviurs векторами или микроРНК-214 предшественника не влияет на рост клеток SGC7901 (рис 3A-B, Рисунок S2C-D, P > 0,05) и линии MKN45 клеток (рисунок S2E-F, рис S5A-B, P > 0,05). Тем не менее, мы обнаружили, что downregualtion СИК-214 может способствовать распространению BGC823 (рис 3C-D, P
= 0,0010) и ГЭС-1 (рис S4B-C, P =
0,0474), но не MKN28 клеточная линия (рис S5C-D, P
= 0,0938), в клеточно-специфическим образом.

Роль микроРНК-214 в миграции клеток и вторжение в GC клетки
<р> Как выражение микроРНК-214 была обратно пропорциональна метастазов в лимфатических узлах, мы были особенно заинтересованы в способности микроРНК-214, чтобы влиять на клеточную миграцию и инвазию. Наши результаты показали, что SGC7901 и MKN45 клетки, трансфицированные LV3-HSA-микроРНК-214 показали значительно снизилась миграцию и способность инвазии, по сравнению с LV3NC обработанных клетках (рис 4A-B, рис S6A-В, P
≪ 0,05). И мы наблюдали, что downregualtion СИК-214 может облегчить миграцию и вторжение MKN28 (рис 4C-D, P
= 0,0491 и P
= 0,0127, соответственно). Несмотря на то, что нокдаун микроРНК-214 не влияет на миграцию ГЭС-1 клеток (рис S4D-E, P
= 0,0879), глушение микроРНК-214 привело к увеличению инвазионных свойств более чем на 40% из этих клеток ( P
= 0,0046). Тем не менее, наши данные показали, что трансфекция микроРНК-214 предшественника не имел надежного влияния на миграцию клеток и вторжения в SGC7901 (рис S2G-H, P
> 0,05) и MKN45 (рис S2i-J, P
> 0,05). клетки, по сравнению с соответствующим отрицательным контролем

влияние микроРНК-214 на апоптоза клеток ГК клеток
<р> для изучения влияния зер- 214 на апоптоза клеток, мы провели анализы апоптоза, используя /PI метод окрашивания аннексина V-FITC. Наши результаты показали, что избыточная экспрессия (микроРНК-214-предшественник и лентивирусов вектор) и нокдаун микроРНК-214 не может повлиять на апоптоз клеток, очевидно, по сравнению с отрицательным контролем в линиях четырех GC клеток (рисунок 5, Рисунок S2K-N, P <бр> > 0,05) и иммортализованные желудка клеточная линия ГЭС-1 (данные не показаны). На самом деле, мы обнаружили тенденцию к про-апоптозу способности микроРНК-214 предшественника в клеточной линии MKN45 (рис S2M-N, P
= 0,0606), однако разница не была статистически значимой.

MIR-214 непосредственно нацелен и вниз регулирует CSF1 в раковых клетках желудка
<р> для того, чтобы определить цели из MIR-214, мы использовали алгоритм TargetScan для прогнозирования микроРНК-214 цели при раке желудка человека. Среди многочисленных возможных кандидатов, мы выбрали из тех, избыточно экспрессируется в раковых образований и proliferation- и метастазирование генов, ассоциированных с, в том числе Notch2, FGFR1, CSF1 (рисунок 6, а), AGAP2, CREB1, для дальнейшего анализа. Наши результаты показали, что микроРНК-214 предшественник трансфекция значительно снизило активность люциферазы гена-репортера, слитого с CSF1 3'-UTR, с 29.60% и 30,61% снижения, по сравнению с отрицательными контрольными группами (рис 6В, P <бр> = 0,0227 и 0,0093, соответственно, для клеточных линий MKN45 и BGC823). Принимая во внимание, когда ингибитор микроРНК-214 трансфицировали, активность люциферазы была увеличена на 34,49% и 42,25% в MKN45 и BGC823 клеток по сравнению с контрольной группой (фиг.6С, P
= 0,0115 и 0,0085, соответственно).
<р> Кроме того, мы определили экспрессию белка CSF1 Вестерн-блот в GC клетках, трансфицированных микроРНК-214 предшественника или ингибитора. В соответствии с люциферазы результатами, экспрессия белка CSF1 было значительно снижено в SGC7901 и MKN45 клеток (рис 6D-E, P
= 0,0037 и 0,0066 соответственно), трансфицированные микроРНК-214 предшественника и увеличилась в MKN28 и BGC823 клетки (рис S7A-в, P
= 0,0049 и 0,0416 соответственно), трансфицированные с ингибитором микроРНК-214, по сравнению с соответствующим контролем. Эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК-214 ингибирует CSF1 переводов клеток рака желудка.

Обсуждение
<р> Новые доказательства подчеркнул решающее влияние микроРНК дизрегуляцией на tumourigenesis карцином человека [3], [4] , МикроРНК дисрегуляция способствует пролиферации клеток, придает устойчивость к апоптозу, и усиливает инвазивность и метастазирование, через подавляя вниз по течению опухолевых супрессоров или индуцировать накопление целевых онкогенов, и, таким образом, участвует в инициации, прогрессировании и метастазирование опухолей человека.
<р> Среди множества микроРНК, дисрегуляции микроРНК-214 был обнаружен в большом количестве злокачественных опухолей человека, [15] - [22]. Подавление микроРНК-214 в рак шейки матки было сообщено несколькими группами, и микроРНК-214 было показано, ингибируют рост, миграцию и инвазию рака шейки матки клеток, ориентированных онкогенов MEK3, JNK1, плексин-B1 и GALNT7 [15 ] - [17]. MIR-214 также было установлено уменьшить, рака молочной железы и рака молочной способствуют tumourigenesis, позволяя аберрантно повышенным онкогена Ezh2 накопление и последующее распространение непроверенной клеток и инвазии [18]. Тем не менее, Пенна и др. показали, что микроРНК-214 сильно выражена в человеческих меланом и способствует прогрессии опухоли меланомы через подавление TFAP2C, гомолог хорошо налаженной супрессоров опухоли меланомы [19]. Эти результаты указывают на то, что роль микроРНК-214 в раке является ткане или сотового специфичны.
<Р> Недавнее исследование, проведенное Ueda и соавт. показал, что дерегуляция MIR-214 коррелировала с клинической стадией, перитонеального распространения и выживаемости пациентов [20]. Однако точная роль микроРНК-214 в прогрессии рака желудка и лежащих в его основе молекулярного механизма остается неуловимым. Здесь мы покажем, что микроРНК-214 был существенно сокращен в GC, особенно в метастатических тканях, что указывает на потенциальную роль микроРНК-214 в прогнозировании метастазов в лимфатических узлах, который далее при поддержке нашего анализа кривой ROC. Кроме того, мы обнаружили, что низкий уровень экспрессии микроРНК-214 имел склонность к большему размеру опухоли. Для решения несет ли дисрегуляция MIR-214 биологическое значение, мы использовали последующие исследования и функционального анализа микроРНК-214 в пробирке
. Тем не менее, наши данные свидетельствуют о том, что микроРНК-214 не оказывает никакого влияния на исход пациента, включая состояние рецидива и выживаемости. Наши данные показали, что избыточная экспрессия микроРНК-214 с лентивирусов микроРНК-214-экспрессирующим вектором резко сократить миграцию и инвазии ГХ клеточных линий и нокдаун микроРНК-214 может способствовать пролиферации клеток, апоптоз, миграцию и инвазию в клетке-специфическим образом, с никакого влияния на апоптоз клеток.
<р> CSF1 (колониестимулирующий фактор 1 (макрофагов)) является одним из важнейших факторов роста гемопоэтических с участием макрофагов клеточной дифференцировки, пролиферации и активации, и он также присутствует в не кроветворных клеток [21] , КСФ-1 влияет на клеточную пролиферацию и выживание посредством связывания с его рецептором, кодируемого геном C-FMS [22]. Предыдущие исследования показали, что CSF1 оказали важную роль в развитии ангиогенеза опухоли в Лейомиосаркома [23] и Льюиса клетки карциномы легких с помощью индукции VEGF [24]. Aligeti S и др. Предполагается, что CSF1 оказывает положительное влияние на привязанности к плевральной мезотелиальной клеток, инвазию и пролиферацию эндометрия эпителиальных клеток [25]. И повышенные концентрации в сыворотке крови коррелирует со стадией заболевания, метастазов в лимфатических узлах и плохим прогнозом при больных колоректальным раком [26]. Здесь мы определили CSF1 был прямой мишенью MIR-214 при раке желудка с помощью люциферазы анализов и дополнительно подтверждено с помощью Вестерн-блот-анализа. Наши данные свидетельствуют о том, что понижающая регуляция микроРНК-214 может способствовать пролиферации, миграции и инвазии способность желудка раковой клетки через CSF1-опосредованного сигнального пути.
<Р> В предыдущем исследовании, Ueda и др. показал, что относительно более высокая экспрессия микроРНК-214 в GC было связано с неблагоприятной общей выживаемости у 101 пациентов (полученного из Токийского университета и Университета Хиросимы) [20], однако, наши данные свидетельствуют о том, что микроРНК-214 не было достоверно коррелирует с пациентом результат. Мы предполагаем, что это расхождение может быть связано с различными методами обнаружения экспрессии микроРНК, размеров образцов, и последующий раз между их исследований и нашим. Уэда и др. разделить образцы на два класса (высокое и низкое выражение), используя среднее уровней экспрессии микроРНК, измеренного на микроРНК микрочипов в качестве порогового значения, в то время как наше разделение высоких и низких групп экспрессии основывалась на срединный уровень экспрессии, полученной из результатов КПЦР , Интересно, что и в предыдущих исследованиях, микроРНК-214 выражение было показано, усиливает свою активность при раке яичников по сравнению с нормальными клетками яичников Янгом и др. [27], в то время как противоположные результаты были сообщены Nam и др. [28]. Оба эти две группы использовали микроРНК микрочипов для изучения экспрессии микроРНК. Таким образом, мы не можем исключить возможность того, что анализ микрочипов может быть не столь чувствительны и точны в анализе профили экспрессии конкретного микроРНК. Что же касается влияния MIR-214 на прогноз больных с ГК, частично в соответствии с результатами Ueda и др., Мы также обнаружили тенденцию, что высокая экспрессия микроРНК-214 был неблагоприятным для выживания, когда последующий раз был более чем через 40 месяцев (отношение рисков (HR) = 1.19 для общей выживаемости, HR = 1,23 для безрецидивной выживаемости), как показано на рисунке 2, хотя эта тенденция не была статистически значимой. В любом случае, дальнейшее исследование с большей когорты и различных экспериментальных установок, необходимых для решения этой проблемы.
<Р> Что касается несовпадения микроРНК-214 Лентивирус векторов и трансфекцию анализов предшественников, мы предполагаем, что является специфическим следствием биологическая активность микроРНК-214. Умеренное и стабильное выражение, а не десятки тысяч, не физиопатологических overexpresion может помочь микроРНК-214 функции хорошо.
<Р> Взятые вместе, мы показали, что микроРНК-214 был существенно сокращен в GC, особенно в метастатических тканях, указывая потенциальная роль микроРНК-214 в прогнозировании метастазов в лимфатических узлах. Наш анализ кривой ROC показал относительно высокую специфичность и чувствительность MIR-214 для различения случаев GC из nontumourous управления, и отделение пациентов с и без узла метастаза лимфатический, тем самым побуждая его потенциальную полезность в качестве нового биомаркера для GC и метастазов в лимфатических узлах, который будет полезно для облегчения клинического лечения GC. Тем не менее, наши данные свидетельствуют о том, что микроРНК-214 не оказывает никакого влияния на прогноз пациентов, что свидетельствует о том, что в одиночку микроРНК-214 не достаточно, чтобы повлиять на выживаемость пациентов.

• PLoS ONE: Повышенные Плазменный D-димера коррелируют с Долгосрочной выживания больных раком желудка
• PLoS ONE: HIF-1 альфа Гиперэкспрессия Корреляты с плохим общей выживаемости и безрецидивной выживаемости у рака же…