PLoS ONE: clinicopathologische Belang van MicroRNA-214 bij maagkanker en het effect daarvan op celbiologische Gedrag

Abstract

Accumulerende bewijsmateriaal wijst erop dat tal van microRNAs betrokken zijn bij het ontstaan ​​van tumoren en de progressie van maagkanker, terwijl de klinische betekenis van microRNA-214 bij maagkanker slecht wordt begrepen en de precieze rol van microRNA-214 in maagkanker blijft onduidelijk. In de onderhavige studie werden expressieniveaus van microRNA-214 in 80 maagcarcinoom weefsels 18 nontumourous gastrische weefsels en 4 vormen van maagkanker cellijnen gekwantificeerd door omgekeerde transcriptie gevolgd door real-time kwantitatieve polymerase ketenreactie (RT-qPCR), en de relatie tussen microRNA-214 expressie en cliniopathological kenmerken, zoals prognose werd onderzocht. Om de potentiële rol van microRNA-214 bij maagkanker celbiologische gedrag te onderzoeken, voerden wij celproliferatie, apoptose, migratie en invasie assays vier maagkanker cellijnen en een geïmmortaliseerde cellijn gastrische in vitro
. Onze resultaten toonden dat microRNA-214 sterk is downregulated bij maagkanker weefsels en maagkanker cellijnen tegenover nontumourous gastrische weefsels. Stapsgewijze downregulatie van microRNA-214 expressie werd waargenomen bij nontumourous maagslijmvlies, nonmetastasis maagkanker weefsels en metastase maagkanker weefsels. De expressie van microRNA-214 significant omgekeerd gecorreleerd met lymfeklier en tumorgrootte maar had geen correlatie met de prognose van de patiënt. Ectopische expressie van microRNA-214 kon cel migratie en invasie mogelijkheid te remmen in SGC7901 en MKN45 maagkanker cellen. En knockdown van microRNA-214 aanzienlijk vergemakkelijkt celproliferatie, migratie en invasie in een celspecifieke wijze MKN28, BGC823 en GES-1 cellen. Koloniestimulerende factor 1 (CSF1) werd geïdentificeerd als een doelgen van microRNA-214. Kortom, onze gegevens blijkt dat microRNA-214 is een veelbelovend biomarker voor lymfekliermetastase bij patiënten met maagkanker. En we geïdentificeerd die downregulatie van microRNA-214 kan de proliferatie, invasie en migratie van maagkanker cellen reguleren door direct gericht CSF1

Visum:. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) klinisch-pathologische Belang van MicroRNA-214 bij maagkanker en het effect daarvan op celbiologische Behaviour. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10.1371 /journal.pone.0091307

Editor: Terence Lee, Universiteit van Hong Kong, Hong Kong

Ontvangen: 25 april 2013; Aanvaard: 11 februari 2014; Gepubliceerd: 10 maart 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 81172351 en 81372856). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kankersterfte in de wereld [1]. Ondanks aanzienlijke onderzoek naar de tumorigenese en progressie van GC, wordt de pathogenese van deze complexe ziekte slecht begrepen. Het is dus van groot klinische waarde identificeren en karakteriseren van de precieze moleculaire mechanisme betrokken bij de ontwikkeling en progressie van maagcarcinoom.

Naast conventionele genetische en epigenetische verandering van eiwitcoderende oncogenen en tumorsuppressorgenen in de carcinogenese van GC, nonprotein-coderende RNA's, met name microRNAs (miRNAs), hebben zich ontwikkeld tot een nieuwe speler om licht te werpen op het mechanisme van GC ontwikkeling [2]. MiRNAs zijn endogene 19-25 nt niet-coderende RNA's die een negatieve reguleren eiwitexpressie door het bevorderen van mRNA degradatie of onderdrukken eiwit translatie, door interactie met de 3'-UTR van doelwit mRNA. Steeds miRNAs gemeld deelnemen bij carcinogenese en ontwikkeling van humane kankers, waaronder GC [2] - [4]. Deze miRNAs zijn meestal ontregeld en functioneren hetzij als tumor suppressors of oncogenen in de initiatie en progressie van de menselijke carcinomen. Zo Tsukamoto et al. hebben aangetoond dat miR-375 wordt neerwaarts gereguleerd in maagcarcinoom en oefent zijn proapoptotische effect door het neerwaarts reguleren van PDK1, een kinase dat Akt fosforyleert, en op zijn beurt, onderdrukt de PI3K /Akt pathway [5]. Terwijl miR-21 is gevonden om tumor proliferatie en invasie in GC bevorderen door negatief reguleren belangrijke tumor suppressors zoals PTEN, PDCD4 en RECK en vervolgens overleggen GC cellen met verhoogde invasiviteit en het vermogen om anoikis [6] vermijden - [8 ]. Eerder hebben wij gevonden dat miR-145 werd downgereguleerd in allerlei menselijke kankercellen en onderdrukte de invasie-metastase cascade in GC door remming van N-cadherine eiwittranslatie [9], [10].

Momenteel is de klinische betekenis van microRNA-214 (miR-214) in de prognose van patiënten met GC is slecht begrepen, en de precieze rol van miR-214 in GC blijft onduidelijk. Hier hebben we de associatie tussen miR-214 expressie en cliniopathological parameters, evenals de beoordeling van het effect van miR-214 op biologische gedrag, waaronder celproliferatie, apoptose, migratie en invasie van GC cellen.

Materialen en methoden

weefselmonsters

weefselmonsters werden bereid op een vergelijkbare wijze zoals eerder beschreven [9]. In het kort, 80 monsters (van 65 mannen, 15 vrouwen; 58,3 ± 17,49 en 61,5 ± 9,162 jaar oud, respectievelijk) van GC weefsels werden verkregen van patiënten die een chirurgische resectie ondergingen bij Qi Lu ziekenhuis van Shandong University van 2004 tot 2006. Nontumourous maagslijmvlies meer dan 3 cm van tumoren werd willekeurig gekozen uit 18 van deze patiënten en gebruikt als controles. Geen van de patiënten kreeg preoperatieve behandeling, zoals radiotherapie of chemotherapie. Monsters werden histologisch getypt volgens Lauren en de World Health Organization (WHO) 's classificaties (IARC Press, Lyon, 2000), en gecategoriseerd volgens de UICC 2002 TNM classificatie.

Ethics statement

de studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de School of Medicine, University Shandong, Shandong, China (goedkeuring code: 201.101.015). We verkregen schriftelijke toestemming van alle betrokken in ons onderzoek deelnemers.

Cell cultuur

Vier types van het humaan GC cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection (MKN28 en MKN45, Manassas, VA , USA) en de Shanghai Cancer Institute (BGC823 en SGC7901, Shanghai, China). De vereeuwigd maagslijmvlies epitheliale cellijn GES-1 werd verkregen uit Beijing ComWin Biotech Co, Ltd (Beijing, China). De cellen werden in RPMI 1640 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in een bevochtigde incubator cel met een atmosfeer van 5% CO _{2 bij 37 ° C.}

miRNA extractie

met behulp van een miRNeasy FFPE Kit (Bioteke, Beijing, China), die we miRNA uit paraffine ingebedde weefsels volgens de instructies van de fabrikant. Totaal RNA cellijnen werd geëxtraheerd met behulp van Trizol reagens (TaKaRa, Dalian, China) volgens het protocol van de fabrikant. De kwaliteit en kwantiteit van de RNA-monsters werden door standaard spectrofotometrische werkwijzen (BioPhotometer plus, Eppendorf, Hamburg, Duitsland) en verdund tot 2 ng /ul voor RT-qPCR analyse

Reverse transcriptie gevolgd door real-time. kwantitatieve polymerase chain reaction (RT-qPCR)

miRNA expressie niveaus werden gekwantificeerd met behulp van een SYBR Primescript miRNA RT PCR Kit (TaKaRa, Dalian, China) volgens de instructies van de fabrikant met een Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Real -Time systeem. Kort samengevat, werden de RNA monsters omgezet naar cDNA door een éénfasige Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Dalian, China), gevolgd door real-time qPCR en genormaliseerd middels U6 klein nucleair RNA (RNU6B) van de 2 ^{-ΔCT methode. Primers voor miR-214 en U6 waren afkomstig GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Alle reacties werden in duplo uitgevoerd.}

Celtransfectie

Exponentieel groeiende cellen (1,5 x 10 ^{5) in 12-putjes platen werden geënt 12 uur voor transfectie en werden getransfecteerd met 30 nM miR-214 precursor (miR-214), anti-miR-214 remmer (miR-214 remmer) of de negatieve controle (Ambion, Austin, TX, USA) met behulp van de X-tremeGENE transfectiereagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Transfectie-efficiëntie werd gevolgd door RT-qPCR bij 24, 48 en 72 uur na transfectie.}

Voor stabiele expressie van miR-214, SGC7901 en MKN45 cellen werden getransfecteerd met lentivirus miR-214-expressie vector LV3-HSA -miR-214 of een negatieve controle LV3NC, die GFP als marker eiwit, volgens het protocol van de fabrikant (GenePharma, Shanghai, China). Drie dagen na transfectie, de expressie van GFP eiwit werd gevolgd onder fluorescentiemicroscoop. De getransfecteerde cellen werden onderzocht met puromycine (1,5 ug /ml) voor diegene die stabiel miR-214.

celproliferatie assay

Na transfectie werden cellen getrypsiniseerd, geteld en gezaaid op 96 -well platen bij een dichtheid van 5 x 10 ^{3 cellen /putje. En vervolgens celproliferatie werd gemeten met de EDU proliferatie assay zoals eerder beschreven [11]. Kort, 24 h na transfectie werden cellen gecultiveerd in drievoud bij 5 x 10 3 cellen per putje in 96-well platen de dag vóór incubatie EDU (Ribobio, Guangzhou, China). Na edu labeling werden de cellen behandeld met 100 ui 1 x Apollo reactiecoctail, gekleurd met 100 ul van Hoechst 33342 (5 ug /ml) en zichtbaar gemaakt onder een fluorescentiemicroscoop (Olympus, Japan). Het percentage positieve cellen EDE werd gedefinieerd als de proliferatiesnelheid. Gegevens werden verkregen uit drie onafhankelijke experimenten en weergegeven als het gemiddelde ± standaardafwijking (SD).}

Cell apoptoseassay

Drie dagen na transfectie van miR-214 precursor of inhibitor, cellen werden verzameld en gekleurd met behulp van het annexine V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit (BestBio, Shanghai, China) zoals eerder beschreven [12]. In het kort werden cellen getrypsiniseerd, verzameld en vervolgens gekleurd met de Annexine V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit volgens de instructies van de fabrikant. Na incubatie met Annexine V-FITC en PI werden de apoptotische cellen onmiddellijk geanalyseerd met stroomcytometrie. Vroege apoptotische cellen werden gedefinieerd als de populatie die was negatief PI en annexine V-FITC positief, terwijl late apoptotische cellen waren positief PI en annexine V-FITC positief. De totale apoptotische werd berekend als het begin van de apoptotische tarief plus de late apoptotische tarief. Annexine V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (Keygen, Nanjing, China) werd gebruikt voor de bepaling van apoptose lentivirus vector getransfecteerde cellen, vergelijkbaar met de bovenstaande protocollen. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd en gegevens werden gepresenteerd als gemiddelden ± SD.

Cel migratie en invasie assays

Cel migratie en invasie-assays werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [13]. Migratieanalyse werd met Transwell inzetstukken met 8,0 mm poriegrootte membraan (24-well formaat, Corning, New York, USA). Invasie vermogen van GC cellen te meten, de eerder genoemde inserts werden vooraf bekleed met Matrigel matrix (BD Science, Sparks, MD, USA). De cellen (1 x 10 ^{5) werden opnieuw gesuspendeerd in serumvrij medium en geënt aan de bovenste kamer. De onderste kamers waren gevuld met volledige kweekmedium dat 10% FBS. Na incubatie bij 37 ° C gedurende 24 uur werden de gemigreerde cellen aanwezig is op de onderzijde van het membraan gefixeerd, gekleurd en geteld. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd.}

Luciferase assay

Dual-luciferase assays werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [9]. De 3'-UTR-fragmenten van CSF1 gen dat de miR-214 bindingsplaats geamplificeerd met PCR uit MKN45 cel RNA met behulp van de primers in tabel S1 en ingevoegd in de plaats van Xba1 pmirGLO miRNA doelwitexpressiecassette vector (Promega, San Lius Obispo, CA, USA). De resulterende vector werd genoemd pmirGLO-CSF1. Voor de luciferase reporter assay MKN45 en BGC823 cellen werden uitgezaaid in een 12-wells plaat de dag voor transfectie. De cellen werden gecotransfecteerd met 30 nM van miR-214 en miR precursor-214 remmer, negatieve controle en 30 ng pmirGLO-CSF1 met X-tremeGENE transfectiereagens (Roche Applied Science). Na 48 uur transfectie werd luciferaseactiviteit gemeten met de duale luciferase testsysteem (Promega) en genormaliseerd tot Renilla luciferaseactiviteit. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd.

Western blot

Op 48 uur na transfectie met miR-214 precursor of remmer werden de cellen onderworpen aan Western blot analyse zoals eerder [19] beschreven. In het kort werd proteïne geëxtraheerd uit cellen of weefsels. Lysaten werden gescheiden door elektroforese, overgebracht op nitrocellulose membranen en geblot met antilichamen tegen CSF1 (1:1000, Epitomics) of β-actine (1:1000, Santa). Gegevens werden verkregen uit drie onafhankelijke experimenten.

Statistische analyse

Analyses werden uitgevoerd met het statistische pakket 5 Prism software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Verschillen werden geanalyseerd met de Student's t
-test tussen twee groepen of met one-way ANOVA tussen de drie groepen. De correlatie tussen miR-214 expressie en grootte van de tumor in het primair GC werd berekend door de correlatie Spearman. In de survival curve, werden de gegevens geanalyseerd door logranktoets. Om te bepalen in welke mate de expressie van miR-214 kon efficiënt verschillende klinische sub-instellingen, receiver operating characteristic (ROC) curve analyse werd aangelegd en het gebied onder de curve (AUC) geïsoleerde berekend om het vermogen van miR-214 expressie te differentiëren te evalueren tussen gevallen van kanker en nontumourous gevallen, en metastatische weefsels en nonmetastatic weefsels te onderscheiden. P
-waarden kleiner dan 0,05 werden beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

MiR-214 is neerwaarts gereguleerd in maagcarcinoom weefsels en vier GC cellijnen, in vergelijking met nontumourous maagslijmvlies

in vergelijking met 18 nontumourous maagslijmvlies monsters, miR-214 was significant neerwaarts gereguleerd (ongeveer zes-voudig) in 80 primaire maag weefselmonsters (Figuur 1A, P
= 0,0001). De receiver operating characteristic (ROC) krommen van miR-214 gereflecteerde sterke scheiding tussen GC nontumourous weefsels en weefsels met een gebied onder de curve (AUC) van 0,7764 (figuur S1A, 95% betrouwbaarheidsinterval (BI), 0,6466-0,9062). Consequent, downregulatie van miR-214 werd gevalideerd in vier maag cellijnen. Zoals getoond in figuur 1C, is de miR-214 expressieniveau in de GC cellijnen MKN28, BGC823, MKN45 en SGC7901 sterk verzwakt in vergelijking met 18 nontumourous maag weefselmonsters ( P
< 0,05).

Maar we gedetecteerd, zelfs lagere expressie van miR-214 in GES-1, een onsterfelijk maag epitheel cellijn, dan in vier GC cellijnen (figuur 1C, P Restaurant < 0,05). We speculeren de discordantie kan te wijten zijn ten minste gedeeltelijk aan het verschil tussen klinische monsters en cellijnen, omdat een cellijn geïsoleerd van een patiënt met een bepaalde ziekte, vertegenwoordigt de ondertekening miRNA expressie van slechts één klinisch monster en kunnen veranderingen in de cel cultuur in vitro
; met andere woorden, weefselmonsters veel meer op de humane context dan cellijnen. Zo reageren we dat miR-214 expressie in menselijke weefsels GC was representatiever en geloofwaardiger dan die gevonden in cellijnen.

Verminderde miR-214 expressie in GC wordt geassocieerd met lymfeklier metastase en grootte van de tumor, maar heeft geen correlatie met de prognose voor de patiënt

Om het potentieel klinisch-pathologische gevolgen van de veranderde miR-214 expressie te bepalen, combineerden we de qPCR resultaten en klinische parameters. Correlaties tussen de miR-214 expressie niveau en de klinisch-pathologische kenmerken van GC zijn samengevat in tabel 1. MiR-214 expressie werd omgekeerd gecorreleerd met de grootte van de tumor (tabel 1, t
-test, P
= 0,0265; figuur 1D, Spearman r = -0,2673, P
= 0,0083) en lymfeklier metastase (tabel 1, Figure1A, t
-test, P
= 0,0164). Er was echter geen significant verschil in andere clinicopathologische functies, zoals geslacht, distale metastase, WHO histologische classificatie, en histologische soort Lauren's tussen deze twee groepen.

Intrigerend, vonden we stapsgewijs downregulatie van miR-214 onder nontumourous maag slijmvlies, nonmetastasis weefsels en metastase weefsels (figuur 1A, one-way ANOVA, P
= 0,0006). Om miR-214 expressie in GC te evalueren als een nieuwe biomarker voor lymfeklier metastase, werden ROC curves vastgesteld. We zagen duidelijke scheiding tussen de patiënten met lymfeklier metastase en die zonder lymfklier metastase, met een AUC van 0,5880 (figuur S1B, 95% CI, ,4526-,7166). De primaire gastrische weefsels werden verder verdeeld in een lage-metastase groep en een high-metastase groep naar het aantal lymfekliermetastase (LNM): laag metastase werd gedefinieerd als gevallen minder dan zes LNM en gevallen meer dan zes LNM werden als hoog metastase. Zoals verwacht, werd miR-214 expressie drastisch afgenomen in de hoge-metastase vergeleken met de lage-metastase groep (Figuur 1B, P
= 0,045).

Overeenkomstig het weefselmonster gegevens die erop wijzen de correlatie tussen miR-214 expressie en LNM, vonden we dat, in vergelijking met de matig goed gedifferentieerd cellijn MKN28, miR-214 expressie was duidelijk minder in de slecht gedifferentieerde cellijnen MKN45 en BGC823, en vooral de metastatische cellijn SGC7901 [14] ( P Restaurant < 0,05)

echter, onze data toonden geen significant verschil van miR-214 expressie in 18 primaire maag weefselmonsters en hun secundaire metastase loci (Figuur 1B. P
= 0,2676). Deze resultaten suggereren dat neerwaartse regulatie van miR-214 expressie opgetreden in de vroege fase van ontwikkeling LNM en bleef stabiel zonder verdere verzwakking in het late stadium van metastase.

Om het effect van miR-214 verder te onderzoeken op de prognose patiënten, analyseerden we de expressie van miR-214 in verschillende gevallen recidief status en overlevingskansen. Echter, onze gegevens bleek dat er geen uitgesproken verschil tussen de groep en de terugval nonrelapse groep of tussen de overlevingsgroep en de dood groep (Figuur 2A-B,
t-test, P
> 0,05). Van belang we patiënten verdeeld in high-expressie en lage expressie groepen gebaseerd op de mediaan van miR-214 expressie en Kaplan-Meier curves toonde geen significante correlatie tussen miR-214 expressie en recidief-vrije overleving (figuur 2C , hazard ratio (HR) 1,23, 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) ,6596-2,285; P
= 0,5781), of de totale overleving (figuur 2D, HR 1,20, 95% CI ,6667-2,151; P
= 0,5832) bij patiënten met GC.

Effect van miR-214 op mobiele proliferatie van GC cellen

Om transfectie-efficiëntie te controleren, hebben we vastgesteld miR-214 expressie door RT-qPCR bij 24, 48 en 72 uur na transfectie in de miR-214 precursor of remmer getransfecteerde cellen en continu gedetecteerd miR-214 expressie van lentivirus vectoren behandelde cellen gedurende 4 weken. Zoals verwacht, transfectie van de miR-214 voorloper efficiënt geleid tot aanzienlijke overexpressie van miR-214 (figuur S2A-B, P Restaurant < 0,05) en miR-214-remmer opvallend verminderd miR-214 expressie in buitenspiegels 214-remmer getransfecteerde cellen dan de negatieve groepen (figuur S3E-F, figuur S4 A, P Restaurant < 0,05). Ook vonden we dat cellen die met lentivirus vector LV3-HSA-miR-214 kan leiden tot een 7-96-voudige verandering van miR-214 expressie in SGC7901 en MKN45 cellen (Figuur S3A-D, P
< 0,05), met 80% -90% cellen die het GFP-marker eiwit (Figuur S3A, B)

om te bepalen of miR-214 kan invloed hebben op de verspreiding van GC cellen, edu proliferatie-assay werd gebruikt om. detecteren celgroei vermogen. Onze gegevens toonden aan dat overexpressie van miR-214 met lentiviurs vectoren of miR-214 voorloper niet celgroei van SGC7901 invloed heeft gehad (figuur 3A-B, Figuur S2C-D, P > 0,05) en MKN45 cellijnen (figuur S2E-F, figuur S5A-B, P > 0,05). Echter, we vonden dat downregualtion van miR-214 kon de verspreiding van BGC823 te bevorderen (zie figuur 3C-D, P
= 0,0010) en GES-1 (figuur S4B-C, P
= 0,0474), maar niet MKN28 cellijn (Figuur S5C-D, P
= 0,0938), in een cel-specifieke manier.

De rol van miR-214 in cel migratie en invasie van GC cellen

Als miR-214 expressie omgekeerd werd geassocieerd met lymfeklieren metastase, waren we vooral geïnteresseerd in de mogelijkheid miR-214 tot cel migratie en invasie van invloed zijn. Onze resultaten gaven aan dat SGC7901 en MKN45 cellen die met LV3-HSA-miR-214 een significant verminderde migratie en invasie vermogen ten opzichte van de LV3NC behandelde cellen (Figuur 4A-B, Figuur S6A-B, P
< 0,05). En we hebben geconstateerd dat downregualtion van miR-214 kon de migratie en invasie van MKN28 vergemakkelijken (Figuur 4C-D, P
= 0,0491 en P
= 0,0127, respectievelijk). Hoewel de knock-down van miR-214 had geen invloed op de migratie van GES-1-cellen (figuur S4D-E, P
= 0,0879), silencing van miR-214 heeft geleid tot een stijging van meer dan 40% van de invasieve eigenschappen van deze cellen ( P
= 0,0046). Echter, onze gegevens bleek dat transfectie van miR-214 voorloper van een robuust effect op celmigratie en invasie in SGC7901 niet had (figuur S2G-H, P Restaurant > 0,05) en MKN45 (figuur S2I-J, P
>. 0,05) cellen, in vergelijking met de respectieve negatieve controles

invloed van miR-214 op apoptose van cellen GC

om het effect van buitenspiegels onderzocht 214 op apoptose, voerden we testen op apoptose met het annexine V-FITC /PI-kleuring. Onze resultaten toonden aan dat overexpressie (miR-214 voorloper en lentivirus vector) en knock-down van miR-214 niet duidelijk van invloed kunnen zijn cel apoptose in vergelijking met negatieve controles in vier GC cellijnen (Figuur 5, Figuur S2K-N, P
> 0,05) en maag geïmmortaliseerde cellijn GES-1 (gegevens niet getoond). In feite vonden we een neiging van pro-apoptose vermogen van miR-214 in MKN45 precursor cellijn (Figuur S2M-N, P
= 0,0606), maar het verschil was niet statistisch significant.

miR-214 richt zich direct en down-reguleert CSF1 bij maagkanker cellen

om targets te identificeren van miR-214, gebruikten we TargetScan algoritme om miR-214 targets te voorspellen in menselijke maagkanker. Onder de vele mogelijke kandidaten, we kozen degenen overexpressie in kanker en proliferatie- en metastase-geassocieerde genen, waaronder NOTCH2, FGFR1, CSF1 (figuur 6A), AGAP2, CREB1, voor verdere analyse. Onze resultaten lieten zien dat miR-214 precursor transfectie significant de activiteit van een luciferase reportergen gefuseerd aan het 3'-UTR CSF1, met 29,60% en 30,61% vermindering in vergelijking met de negatieve controlegroepen (Figuur 6B P
= 0,0227 en 0,0093, respectievelijk voor en MKN45 BGC823 cellijnen). Terwijl wanneer miR-214 remmer werd getransfecteerd, luciferaseactiviteit werd verhoogd met 34,49% en 42,25% in MKN45 en BGC823 cellen vergeleken met controles (Figuur 6C, P
= 0,0115 en 0,0085, respectievelijk).

verder bepaald de expressie van CSF1 eiwit door Western blot met GC cellen getransfecteerd met miR-214 precursor of remmer. Consistent met de resultaten luciferase, werd de expressie van CSF1 eiwit significant afgenomen SGC7901 en MKN45 cellen (Figuur 6D-E, P
= 0,0037 en 0,0066, respectievelijk) getransfecteerd met miR-214 precursor en verhoogd en MKN28 BGC823 cellen (Figuur S7a-B, P
= 0,0049 en 0,0416, respectievelijk) getransfecteerd met miR-214 remmer, vergeleken met de respectievelijke controles. Deze gegevens suggereerden dat miR-214 remt CSF1 vertaling bij maagkanker cellen.

Discussie

Opkomende bewijs heeft de cruciale invloed van miRNA ontregeling op tumorgenese van menselijke carcinomen [3], benadrukt [4] . MiRNA ontregeling stimuleert celproliferatie, resistentie tegen apoptose en verbetert invasiviteit en metastase via de stroomafwaartse onderdrukken tumor suppressors of induceren de accumulatie van target oncogenen, en dus is betrokken bij de initiatie, progressie en metastase van menselijke tumoren.

Onder de overvloed aan miRNAs, ontregeling van miR-214 werd gevonden in veel menselijke kankers [15] - [22]. Downregulatie van miR-214 in baarmoederhalskanker is beschreven door verscheidene groepen en miR-214 is aangetoond dat de groei, migratie en invasie van cervicale kankercellen remmen door targeting oncogenen MEK3, JNK1, plexine-B1 en GALNT7 [15 ] - [17]. MiR-214 is ook gevonden te worden verminderd bij borstkanker en dragen bij aan de borst tumorgenese doordat afwijkende verhoogde oncogen Ezh2 accumulatie en daaropvolgende ongecontroleerde celproliferatie en invasie [18]. Echter, Penna et al. hebben aangetoond dat miR-214 hoog tot expressie in menselijke melanomen en draagt ​​bij tot melanoom tumor ontwikkeling door onderdrukking van TFAP2C, een homoloog van een gevestigde melanoom tumor suppressor [19]. Deze resultaten geven aan dat de rol van miR-214 in kanker weefsel-specifieke of cel-.

Een recente studie door Ueda et al. bleek dat ontregeling van miR-214 werd gecorreleerd met klinische, peritoneale verspreiding en overleving van patiënten [20]. Echter, de precieze rol van miR-214 in de progressie van maagcarcinoom en de onderliggende moleculaire mechanisme blijft ongrijpbaar. Hier laten we zien dat miR-214 werd aanzienlijk verminderd GC, vooral in metastatische weefsels, suggereert een mogelijke rol van miR-214 in het voorspellen lymfekliermetastase, die verder is ondersteund door ons ROC curve analyse. Bovendien vonden we dat lage expressie van miR-214 had een neiging tot een grotere tumorgrootte. Aan te pakken of de ontregeling van miR-214 draagt ​​een biologische betekenis, we gebruik gemaakt van een follow-up studie en functionele analyse van miR-214 In vitro
. Niettemin, onze gegevens suggereren dat miR-214 heeft geen effect op de gezondheid van de patiënt, zoals statusinformatie recidief en overleving. Onze gegevens toonden aan dat overexpressie van miR-214 met lentivirus miR-214-expressie vector drastisch verminderd migratie en invasie van GC cellijnen en knockdown van miR-214 kon celproliferatie, apoptose, migratie en invasie in een celspecifieke wijze vergemakkelijken met geen invloed op apoptose.

CSF1 (kolonie-stimulerende factor 1 (macrofaag)) is een kritische hemopoëtische groeifactor waarbij in macrofaag celdifferentiatie, proliferatie en activering en het is ook aanwezig in niet-hematopoëtische cellen [21] . CSF-1 beïnvloedt cellulaire overleving en proliferatie via binding aan de receptor wordt gecodeerd door het c-fms-gen [22]. Eerdere studies toonden aan dat CSF1 uitgeoefend belangrijke rol bij het bevorderen van tumor angiogenese bij leiomyosarcoma [23] en Lewis longcarcinoom cellen via inductie van VEGF [24]. Aligeti S et al. stelde CSF1 positieve effect op de hechting aan pleurale mesotheelcellen, invasie en proliferatie van het endometrium epitheelcellen [25]. En verhoogde serumconcentraties van gecorreleerd met ziektestadium, lymfeknoop metastase en slechte prognose bij patiënten met colorectaalkanker [26]. Hier identificeerden we CSF1 was een direct doelwit van miR-214 bij maagkanker door middel van luciferase assays en verder bevestigd door western blot analyse. Onze data suggereerde dat downregulatie van miR-214 van de proliferatie, migratie en invasie capaciteit van maagkanker cel door het-CSF1 bemiddelde signaalroute kan vergemakkelijken.

In de vorige studie, Ueda et al. gebleken dat relatief hogere expressie van miR-214 in GC werd geassocieerd met ongunstige overleving bij 101 patiënten (verkregen van de Universiteit van Tokyo en Hiroshima University) [20], maar onze gegevens aan dat miR-214 niet significant gecorreleerd met de patiënt resultaat. We veronderstellen dat deze discrepantie te wijten aan de verschillende miRNA expressie detectiemethoden, steekproefomvang kan zijn, en de follow-up tijden tussen hun onderzoek en de onze. Ueda et al. verdeelde de samples in twee klassen (hoge en lage expressie) met behulp van de gemiddelde niveaus van miRNA expressie gemeten op een microRNA microarray als een drempel, terwijl onze divisie van hoge en lage expressie groepen was gebaseerd op het mediaan niveau van expressie is opgedaan met de qPCR resultaten . Intrigerend in eerdere studies, miR-214 expressie is aangetoond opgereguleerd bij eierstokkanker in vergelijking met normale eierstokcellen door Yang et al. [27], terwijl het tegenovergestelde resultaten werden gemeld door Nam et al. [28]. Voor beide groepen gebruikt miRNA microarrays het miRNA expressie onderzoeken. Zo kunnen we de mogelijkheid dat microarray analyse minder gevoelig en nauwkeurig analyseren van de expressieprofielen van een bepaalde miRNA kan niet uitsluiten. Wat betreft het effect van miR-214 op de prognose van patiënten met GC, ten dele aan de resultaten van Ueda et al., Vonden we ook een tendens dat hoge expressie van miR-214 was ongunstig voor overleving in de follow-up bedroeg langer dan 40 maanden (HR (HR) = 1,19 voor overleving, HR = 1,23 voor recidief-vrije overleving), zoals weergegeven in figuur 2, hoewel de trend was niet statistisch significant. In ieder geval nader onderzoek met een groter cohort en verschillende experimentele instellingen zijn nodig om dit probleem op te lossen.

Wat de discordantie van miR-214 lentivirus vectoren en voorloper transfectie assays, vermoeden we dat het een specifieke gevolgen zijn van de biologische activiteiten van miR-214. Een matige en stabiele expressie plaats tienduizenden niet- fysiopathologische overexpresion kan helpen miR-214 goed functioneren.

Samengevat, hebben we aangetoond dat miR-214 werd aanzienlijk verminderd GC, vooral in metastatische weefsels, suggereert een mogelijke rol van miR-214 in het voorspellen lymfeklier. De ROC-curve analyse toonde de relatief hoge specificiteit en gevoeligheid van miR-214 voor het onderscheiden GC gevallen van nontumourous controles en scheiden patiënten met en zonder lymfeknoop metastasen, dus kwam de potentiële bruikbaarheid als nieuwe biomarker voor GC en lymfeknoop metastasen, die zullen helpen bij de klinische behandeling van GC vergemakkelijken. Echter, onze gegevens blijkt dat miR-214 heeft geen effect op de prognose voor de patiënt, wat aangeeft dat miR-214 alleen is niet genoeg om te overleven de patiënt beïnvloeden.

• PLoS ONE: Elevated Plasma D-dimeer concentraties zijn gecorreleerd met de lange termijn overleving van maagkanker Patients
• PLoS ONE: HIF-1 Alpha overexpressie correleert met Poor overall overleving en ziektevrije overleving bij maagkankerpatiënten Post-Gastrectomy