PLoS ONE: Clinicopathological Bedeutung der MicroRNA-214 bei Magenkrebs und seine Wirkung auf zellbiologischer Behaviour

Abstrakt

thesaurierenden deutet darauf hin, dass zahlreiche microRNAs in der Tumorentstehung und Progression von Magenkrebs beteiligt sind, während die klinische Bedeutung Magenkrebs von microRNA-214 in schlecht verstanden und die genaue Rolle der microRNA-214 bei Magenkrebs bleibt unklar. In der vorliegenden Studie wurden die Expressionsniveaus von MikroRNA-214 in 80 Magenkarzinom Geweben, 18 nontumourous Magengewebe, und 4 Arten von Magenkrebs-Zellinien durch reverse Transkription quantifiziert wurden durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) gefolgt, und die Beziehung zwischen microRNA-214-Expression und cliniopathological Eigenschaften, einschließlich Prognose wurde untersucht. Um die mögliche Rolle der microRNA-214 in Magenkrebszellen biologische Verhalten zu untersuchen, führten wir die Zellproliferation, Apoptose, Migration und Invasion Assays in vier Magenkrebszelllinien und eine immortalisierte Magen-Zelllinie In-vitro-
. Unsere Ergebnisse zeigten, dass microRNA-214 dramatisch bei Magenkrebs Geweben und Magenkrebs-Zelllinien nach unten reguliert wurde, verglichen mit nontumourous Magengewebe. Stepwise Herunterregulieren der microRNA-214-Expression wurde unter nontumourous Magenschleimhaut beobachtet, nonmetastasis Magenkrebsgewebe und Metastasen Magenkrebsgewebe. Die Expression von microRNA-214 signifikant invers mit Lymphknotenmetastasen und Tumorgröße korreliert, hatte aber keine Korrelation mit der Prognose des Patienten. Die ektopische Expression von microRNA-214 konnte die Zellmigration und Invasion Fähigkeit in SGC7901 und MKN45 Magenkrebszellen hemmen. Und Zuschlag von microRNA-214 signifikant die Zellproliferation erleichtert, Migration und Invasion in einem zellspezifisch in MKN28, BGC823 und GES-1-Zellen. Kolonie-stimulierenden Faktors 1 (CSF1) wurde als Zielgen von MikroRNA-214 identifiziert. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass MikroRNA-214 ein vielversprechender neuartigen Biomarker für Lymphknotenmetastasen bei Patienten mit Magenkrebs ist. Und wir festgestellt, dass die Herunterregulierung von microRNA-214 kann die Proliferation, Invasion und Migration von Magenkrebszellen, indem direkt Targeting CSF1 regulieren

Citation:. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) Clinicopathological Bedeutung der MicroRNA-214 bei Magenkrebs und seine Wirkung auf die zellbiologische Verhalten. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10.1371 /journal.pone.0091307

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong

Received: 25. April 2013 beginnen; Akzeptiert: 11. Februar 2014; Veröffentlicht: 10. März 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr 81172351 und 81372856) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache der Krebssterblichkeit weltweit [1]. Trotz erheblicher Untersuchungen zur Tumorgenese und Progression von GC wird die Pathogenese dieser komplexen Erkrankung wenig verstanden. Somit ist es von vitaler klinischen Wert zu identifizieren und die genaue molekulare Mechanismus der Entwicklung und Progression von Magenkarzinom beteiligt charakterisieren.

Neben konventionellen genetischen und epigenetischen Veränderung der Protein-kodierenden Onkogene und Tumorsuppressorgene in die Karzinogenese von GC, nicht-Protein-kodierenden RNAs, insbesondere microRNAs (miRNAs) haben als neuer Spieler zu werfen Licht auf den Mechanismus der GC Entwicklung [2] entstanden. MiRNAs sind endogene 19-25 nt nicht-kodierenden RNAs, die sich negativ durch die Förderung der mRNA-Abbau-Protein-Expression regulieren oder Proteintranslation drücken, durch Wechselwirkung mit dem 3'-UTR von Ziel-mRNAs. Eine wachsende Zahl von miRNAs berichtet in der Karzinogenese und der Entwicklung von menschlichen Krebsarten, einschließlich GC [2] teilnehmen - [4]. Diese miRNAs sind in der Regel dysreguliert und Funktion entweder als Tumorsuppressoren oder Onkogenen in der Initiierung und Progression humaner Karzinome. Zum Beispiel Tsukamoto et al. haben gezeigt, dass miR-375 in Magenkarzinom nach unten reguliert wird und übt seine proapoptotische Wirkung durch PDK1 Herunterregulieren, eine Kinase, die Akt phosphoryliert, und wiederum unterdrückt die PI3K /Akt-Weg [5]. [8 - Während miR-21 wurde von negativ regulieren wichtige Tumorsuppressoren wie PTEN, Pdcd4 und RECK und dann verleihen GC-Zellen mit einer erhöhten Invasivität und die Fähigkeit, zu vermeiden anoikis [6] zur Förderung der Tumorproliferation und Invasion in GC gefunden ]. Bisher haben wir festgestellt, dass miR-145 in vielfältigen menschlichen Krebszellen herunter reguliert wurde und unterdrückt die Invasion-Metastasierung Kaskade in GC von N-Cadherin Proteintranslation Hemmung [9], [10].

Derzeit ist die klinische Bedeutung der microRNA-214 (miR-214) in die Prognose von Patienten mit GC ist wenig verstanden, und die genaue Rolle der miR-214 in GC bleibt unklar. Hier untersuchten wir die Assoziation zwischen miR-214 Expression und cliniopathological Parameter sowie die Wirkung von miR-214 auf die biologische Verhalten einschließlich der Zellproliferation, Apoptose, Migration und Invasion von GC-Zellen bewertet.

Materialien und Methoden

Gewebeproben

Gewebeproben wurden in ähnlicher Weise hergestellt, wie zuvor beschrieben [9]. Kurz gesagt, 80 Proben (65 Männer, 15 Frauen; 58,3 ± 17,49 und 61,5 ± 9,162 Jahre alt sind) von GC Gewebe wurden von Patienten erhalten, die von 2004 bis 2006 Nontumourous Schleimhaut chirurgische Resektion bei Qi Lu Krankenhaus von Shandong University unterzog Magen mehr als 3 cm von Tumoren entfernt wurde von 18 dieser Patienten und verwendet als Kontrollen zufällig ausgewählt. Keiner der Patienten erhielten eine präoperative Behandlung, wie Strahlentherapie oder Chemotherapie. Die Proben wurden histologisch nach Lauren und der Weltgesundheitsorganisation (WHO) 's Klassifikationen (IARC Press, Lyon, 2000) und kategorisiert getippt nach der UICC 2002 TNM-Klassifikation.

Ethik-Anweisung

die Studie wurde von der Ethikkommission der School of Medicine, Universität Shandong, Shandong, China (: 201101015 Zulassung Code) zugelassen. Wir erhielten von allen Teilnehmern in unserer Studie beteiligt informierte Zustimmung geschrieben.

Zellkultur

Vier Arten von menschlichen GC-Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (MKN28 und MKN45, Manassas, VA erhalten USA,) und der Shanghai Cancer Institute (BGC823 und SGC7901, Shanghai, China). Die verewigte Magenschleimhaut epithelialen Zelllinie GES-1 wurde von Peking ComWin Biotech Co., Ltd (Beijing, China) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Kulturmedium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in einem befeuchteten Inkubator mit Zellen einer Atmosphäre von 5% CO _{2 bei 37 ° C gehalten.}

miRNA Extraktion

ein miRNeasy FFPE Kit (Bioteke, Beijing, China) Unter Verwendung von isolierten wir aus in Paraffin eingebetteten Gewebe miRNA nach den Anweisungen des Herstellers. Gesamt-RNA von Zelllinien wurde unter Verwendung von Trizol-Reagenz (TaKaRa, Dalian, China) extrahiert folgenden Protokoll des Herstellers. Die Qualität und Quantität der RNA-Proben wurden durch Standard spektrophotometrische Verfahren (BioPhotometer plus, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bewertet und auf 2 ng verdünnt /pl für RT-qPCR-Analyse

Transkription von Echtzeit gefolgt umkehren. quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

miRNA-Expressionsniveaus wurden unter Verwendung eines SYBR Primescript miRNA RT-PCR-Kit (Takara, Dalian, China) nach den Anweisungen des Herstellers mit einem Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Echt quantifiziert -Time-System. Kurz gesagt wurden die RNA-Proben in cDNA durch eine von der qPCR und normalisiert mit U6 small nuclear RNA (RNU6B) durch die 2 ^{-ΔCT One-step Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, China), gefolgt umgewandelt Methode. Primer für miR-214 und U6 waren von GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Alle Reaktionen wurden doppelt durchgeführt.}

Zelltransfektion

Exponentiell wachsende Zellen (1,5 × 10 ^{5) wurden in 12-Well-Platten 12 h vor der Transfektion ausgesät und wurden transfiziert mit 30 nM miR-214-Vorläufer (miR-214), Anti-miR-214-Inhibitor (miR-214-Hemmer) oder die negative Kontrolle (Ambion, Austin, TX, USA) unter Verwendung der X-tremegene Transfektionsreagenz (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Transfektionseffizienz wurde bei 24 durch RT-qPCR überwacht, 48 und 72 h nach der Transfektion.}

Für stabile Expression von miR-214, SGC7901 und MKN45-Zellen wurden transfiziert mit Lentivirus miR-214-exprimierende Vektor LV3-HSA -miR-214 oder eine negative Kontrolle LV3NC, die GFP als Marker-Protein hat, gemäß dem Protokoll des Herstellers (Genepharma, Shanghai, China). Drei Tage nach der Transfektion die Expression von GFP-Protein wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop überwacht. Die transfizierten Zellen wurden mit Puromycin (1,5 ug /ml) für die, die stabil exprimieren miR-214 untersucht.

Zellproliferationsassays

Nach der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert, gezählt und ausgesät auf 96 -Wanne Platten bei einer Dichte von 5 × 10 ^{3 Zellen /Vertiefung. Und dann wurde die Zellproliferation gemessen die EDU-Proliferationsassays unter Verwendung von wie zuvor berichtet [11]. Kurz gesagt, 24 h nach der Transfektion bei 5 × 10 in dreifacher Ausfertigung Zellen kultiviert wurden, 3 Zellen pro Well in 96-Well-Platten am Tag vor EdU Inkubation (Ribobio, Guangzhou, China). Nach EdU Markierung wurden die Zellen mit 100 &mgr; l von 1 × Apollo Reaktionscocktail, gefärbt mit 100 &mgr; l Hoechst 33342 (5 ug /ml) und sichtbar gemacht unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan) behandelt. Der Anteil der EdU positiven Zellen wurde als Proliferationsrate definiert. Die Daten wurden aus drei unabhängigen Experimenten erhalten und präsentiert als Mittelwert ± Standardabweichung (SD).}

Zell-Apoptose-Assay

Drei Tage nach der Transfektion von miR-214-Vorläufer oder Inhibitor wurden die Zellen gesammelt und gefärbt Verwendung des Annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit (BestBio, Shanghai, China), wie zuvor beschrieben [12]. Kurz gesagt, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt, gesammelt und dann folgenden Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des Annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit gefärbt. Nach Inkubation mit Annexin V-FITC und PI wurden die apoptotischen Zellen sofort mittels Durchflusscytometrie analysiert. Frühe wurden apoptotische Zellen als die Bevölkerung definiert, die PI-negativ und Annexin V-FITC positiv war, während spät apoptotischen Zellen waren PI positiv und Annexin V-FITC positiv. Die Gesamtapoptoserate wurde als die frühen Apoptoserate plus der späten Apoptoserate berechnet. Annexin V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (Keygen, Nanjing, China) wurde für die Apoptose-Assay von Lentivirus-Vektor transfizierten Zellen, ähnlich wie die oben genannten Protokolle verwendet. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt, und die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt.

Die Zellmigration und Invasion Assays

Die Zellmigration und Invasion Assays durchgeführt wurden, wie zuvor beschrieben [13]. Migration Assay mit Transwell durchgeführt wurde, fügt mit 8,0 mm Porengröße Membran (24-Well-Format, Corning, New York, USA). Um Invasion Fähigkeit von GC-Zellen zu messen, die zuvor erwähnt wurden Einsätze vorbeschichtet mit Matrigel Matrix (BD Wissenschaft, Sparks, MD, USA). Die Zellen (1 × 10 ^{5) wurden in serumfreiem Medium resuspendiert und beimpft mit der oberen Kammer. Die unteren Kammern wurden gefüllt mit komplettem Kulturmedium 10% FBS enthielt. Nach Inkubation bei 37 ° C für 24 h wurden die gewanderten Zellen, die auf der unteren Seite der Membran fixiert, gefärbt und gezählt. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.}

Luciferaseassay

Doppel-Luciferase-Assays wurden durchgeführt wie zuvor beschrieben [9]. Die 3'-UTR-Fragmente von CSF1 Gens, das die miR-214-Bindungsstelle enthält, wurde mittels PCR aus MKN45 Zell-RNA der Primer in Tabelle S1 verwendet und in die Xba1-Stelle des Vektors pmirGLO miRNA Zielausdruck eingefügt (Promega, San Lius Obispo, CA, USA). Der resultierende Vektor wurde pmirGLO-CSF1 genannt. Für die Luciferase-Reporterassay, MKN45 und BGC823 Zellen wurden in einer 12-Well-Platte ausgesät am Tag vor der Transfektion. Die Zellen wurden mit 30 nM von miR-214-Vorläufer oder miR-214-Inhibitor, negative Kontrolle und 30 ng pmirGLO-CSF1 mit X-tremegene Transfektionsreagenz (Roche Applied Science) cotransfiziert. unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assaysystems (Promega) und normalisiert auf Renilla-Luciferase-Aktivität nach 48 h der Transfektion wurde die Luciferase-Aktivität gemessen. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Western-Blot

Bei 48 Stunden nach der Transfektion mit miR-214-Vorläufer oder Inhibitor wurden die Zellen in Western-Blot-Analyse unterzogen, wie zuvor beschrieben [19]. Kurz gesagt wurde, Protein aus Zellen oder Geweben extrahiert. Die Lysate wurden durch Elektrophorese aufgelöst, auf Nitrocellulose-Membranen und getupft mit Antikörpern gegen CSF1 (1:1000, Epitomics) oder β-Aktin (1:1000, Santa). Die Daten wurden aus drei unabhängigen Experimenten erhalten.

Die statistische Analyse

Die Analysen wurden durchgeführt, um die statistische Paket Prism 5-Software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Die Unterschiede wurden mit dem Student analysiert t
-test zwischen zwei Gruppen oder mit Einweg-ANOVA unter drei Gruppen. Die Korrelation zwischen miR-214 Expression und Tumorgröße in der primären GC wurde von Spearman-Korrelation berechnet. In der Überlebenskurve wurden die Daten von Log-Rank-Test analysiert. Um festzustellen, in welchem ​​Ausmaß die Expression von miR-214 effizient verschiedene klinische Subsettings, receiver operating characteristic (ROC) Kurvenanalyse wurde konstruiert trennen konnte und die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde berechnet, um die Fähigkeit von miR-214 Expression zu beurteilen, zu unterscheiden zwischen Krebserkrankungen und nontumourous Fällen und metastatischen Geweben und nonmetastatic Gewebe zu unterscheiden. P
-Werten von weniger als 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wurden.

Ergebnisse |

miR-214 in Magenkarzinom Gewebe und vier GC-Zelllinien, verglichen mit nontumourous Magenschleimhaut nach unten reguliert wird

im Vergleich mit 18 nontumourous Magenschleimhaut Proben, miR-214 wurde deutlich nach unten reguliert (etwa das sechs~~POS=TRUNC fache~~POS=HEADCOMP) in 80 primären Magen-Gewebeproben (1A, P
= 0,0001). Der Empfänger-Charakteristik (ROC) Kurven von miR-214 Betriebs reflektiert starke Trennung zwischen GC Geweben und nontumourous Geweben, mit einer Fläche unter der Kurve (AUC) von 0,7764 (Abbildung S1A, 95% Konfidenzintervall (CI), 0,6466 bis 0,9062). Konsequent, Herabregulation von miR-214 wurde in vier Magen-Zelllinien validiert. Wie in 1C gezeigt, die miR-214-Expressionsniveau in den GC-Zelllinien MKN28, BGC823, MKN45 und SGC7901 deutlich mit 18 nontumourous Magen-Gewebeproben verglichen abgeschwächt wurde ( P
< 0,05).

Allerdings haben wir festgestellt noch niedriger Expression von miR-214 in GES-1, Zeile einer immortalisierten Magenepithelzellen Zelle, als in vier GC-Zelllinien (1C, P
< 0,05). Wir spekulieren, die Diskordanz mindestens zurückzuführen sein kann auf die Differenz zwischen klinischen Proben und Zelllinien teilweise, weil eine Zelllinie, isoliert von einem Patienten mit einer bestimmten Krankheit, die Expression miRNA darstellt Signatur nur eine klinische Probe und können Änderungen während der Zell Kultur in-vitro-
; in anderen Worten, Gewebeproben viel wie das menschliche Kontext als Zelllinien. So kommentieren wir, dass miR-214 Expression in menschlichen Geweben GC war repräsentativer und glaubwürdig als die in Zelllinien gefunden.

Verminderte miR-214 Expression in GC ist mit Lymphknotenmetastasen und Tumorgröße zugeordnet ist, hat aber keine Korrelation mit der Prognose der Patienten

Um die potentiellen klinisch-pathologischen Auswirkungen der veränderten miR-214 Expression bestimmen, kombiniert wir die qPCR Ergebnisse und klinischen Parametern. Die Korrelationen zwischen dem miR-214-Expressionsniveau und klinisch-pathologischen Eigenschaften von GC sind in Tabelle 1 zusammengefasst MiR-214-Expression wurde invers mit der Größe des Tumors (Tabelle 1, korreliert t
-test, P
= 0,0265; 1D, Spearman r = -0,2673, P
= 0,0083) und Lymphknotenmetastasen (Tabelle 1, Abbildung1A, t
-test, P
= 0,0164). Allerdings gab es keinen signifikanten Unterschied in anderen klinisch-pathologischen Eigenschaften wie Geschlecht, distalen Metastasierung, WHO histologischen Klassifikation und histologischen Typ des Lauren zwischen diesen beiden Gruppen.

Erstaunlicherweise fanden wir schrittweise Herabregulation von miR-214 unter nontumourous Magen Schleimhaut, nonmetastasis Gewebe und Metastasierung Gewebe (1A, one-way ANOVA, P
= 0,0006). Zur Auswertung wurden miR-214 Expression in GC als neuer Biomarker für Lymphknotenmetastasen, ROC-Kurven etabliert. Wir beobachteten klare Trennungen zwischen den Patienten mit Lymphknotenmetastasen und ohne Lymphknotenmetastasen mit einer AUC von 0,5880 (Abbildung S1B, 95% CI, 0,4526-0,7166). Die primären Magengewebe wurden weiter unterteilt in eine Nieder Metastasierung Gruppe und einer Hoch Metastasierung Gruppe entsprechend der Anzahl von Lymphknotenmetastasen (LNM): niedrige Metastasierung als Fälle mit weniger als sechs LNM und Fälle mit mehr als sechs LNM definiert wurde wurden als hohe Metastasierung angesehen. Wie erwartet, wurde miR-214 Expression verringerte sich dramatisch in der Gruppe mit hoher Metastasierung im Vergleich zum Niedrig Metastasierung Gruppe (1B, P
= 0,045).

In Übereinstimmung mit der Gewebeprobe Daten, die die Korrelation zwischen miR-214 Expression und LNM, fanden wir, dass die mäßig gut differenzierten Zelllinie im Vergleich zu MKN28, miR-214-Expression in den schlecht differenzierten Zelllinien MKN45 und BGC823, und vor allem die metastatischen Zelllinie deutlich geringer war SGC7901 [14] ( P
< 0,05)

aber unsere Daten zeigten keinen signifikanten Unterschied von miR-214 Expression in 18 primären Magen-Gewebeproben und deren Sekundärmetastasen Loci (Abbildung 1B. P
= 0,2676). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Herunterregulierung von miR-214 Expression in der frühen Phase der LNM Entwicklung aufgetreten und blieb stabil ohne weitere Abschwächung in der späten Phase der Metastasierung.

Um die Wirkung von miR-214 erkunden auf die Prognose von Patienten, analysierten wir die Expression von miR-214 in Fällen mit verschiedenen Rezidivstatus und Überlebensbedingungen. Aber unsere Daten zeigten, dass es keine ausgeprägte Differenz zwischen dem Rückfall-Gruppe war und der nonrelapse Gruppe oder zwischen dem Überleben Gruppe und dem Tod Gruppe (2A-B, t
-test, P
> 0,05). Bemerkenswert ist, teilten wir die Patienten in hoher Expression und Low-Ausdruck Gruppen basierend auf dem Mittelwert an miR-214-Expression und Kaplan-Meier-Überlebenskurven zeigten keine signifikante Korrelation zwischen der miR-214 Expression und das rezidivfreie Überleben (2C , Hazard Ratio (HR) 1,23, 95% Konfidenzintervall (CI) 0,6596 bis 2,285; P
= 0,5781) oder das Gesamtüberleben (2D, HR 1,20, 95% CI ,6667-2,151; P
= 0,5832) bei Patienten mit GC.

Wirkung von miR-214 auf die Zellproliferation von GC-Zellen

Transfektionseffizienz zu überwachen, wir miR-214-Expression durch RT-qPCR bestimmt an 24, 48 und 72 h nach der Transfektion in der miR-214-Vorläufer-Zellen oder Inhibitor transfiziert und kontinuierlich erfaßt miR-214 Expression von Lentivirus-Vektoren für 4 Wochen behandelten Zellen. Wie erwartet, Transfektion des Vorläufers miR-214 effizient in signifikanten Überexpression von miR-214 (Abbildung S2A-B, P
< 0,05) führte und miR-214-Inhibitor auffallend miR-214 Expression in Mir- reduziert 214-Inhibitor-transfizierten Zellen als die negativen Gruppen (Abbildung S3E-F, Abbildung S4 A, P
< 0,05). Auch fanden wir, dass mit Lentivirusvektor LV3-hsa-miR-214 transfizierten Zellen auf eine 7-96-fache Änderung von miR-214 Expression in SGC7901 und MKN45-Zellen (S3A-D führen könnte, P
< 0,05), mit 80% -90% Zellen, die das GFP-Marker-Protein (Abbildung S3A, B)

um festzustellen, ob miR-214, die Proliferation von GC-Zellen, EDU-Proliferations-Assay verwendet wurde, beeinflussen könnte. Zellwachstumsfähigkeit erkennen. Unsere Daten zeigten, dass die Überexpression von miR-214 mit lentiviurs Vektoren oder miR-214-Vorläufer nicht das Zellwachstum von SGC7901 nicht beeinflusste (3A-B, Abbildung S2C-D, P > 0,05) und MKN45 Zelllinien (Abbildung S2E-F, Fig S5A-B, P > 0,05). Allerdings fanden wir, dass downregualtion von miR-214 konnte die Proliferation von BGC823 (3C-D, P
= 0,0010) und GES-1 (Abbildung S4B-C, P
= fördern GC 0,0474), aber nicht MKN28 Zelllinie (Abbildung S5C-D, P
= 0,0938), in einem zellspezifisch.

Die Rolle der miR-214 in der Zellmigration und Invasion Zellen

Als miR-214 Expression invers mit Lymphknotenmetastasen assoziiert war, waren wir besonders daran interessiert, in der Fähigkeit, miR-214 Zellmigration und Invasion zu beeinflussen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass SGC7901 und MKN45 transfizierten Zellen mit LV3-HSA-miR-214 zeigten eine signifikant verringerte Migration und Invasion Fähigkeit, verglichen mit dem LV3NC behandelten Zellen (4A-B, Figur S6A-B, P
< 0,05). Und wir stellten fest, dass downregualtion von miR-214 konnte die Migration und Invasion von MKN28 (4C-D, P
= 0,0491 und P
= 0,0127, respectively) erleichtern. Obwohl Zuschlag von miR-214 hatte keine Auswirkungen auf die Migration von GES-1-Zellen (Abbildung S4D-E, P
= 0,0879), Silencing von miR-214 führte zu einer mehr als 40% ige Erhöhung der invasiven Eigenschaften dieser Zellen ( P
= 0,0046). Aber unsere Daten zeigten, dass die Transfektion von miR-214-Vorläufer nicht eine robuste Wirkung auf die Zellmigration und Invasion in SGC7901 (Abbildung S2G-H, P
> 0,05) hatte und MKN45 (Abbildung S2I-J, P
>. 0,05) Zellen, im Vergleich zu den jeweiligen Negativkontrollen

Einfluss von miR-214 auf Zell-Apoptose von Zellen GC

die Wirkung von mir- um zu untersuchen, 214 auf Zell-Apoptose, führten wir Apoptose Assays, die die Annexin V-FITC /PI-Färbung verwendet. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Überexpression (miR-214-Vorläufer und Lentivirus-Vektor) und Zuschlags von miR-214 nicht-Zell-Apoptose offensichtlich im Vergleich zu negativen Kontrollen in vier GC-Zelllinien (Abbildung 5, Abbildung S2K-N, P
> 0,05) und Magen-Zelllinie GES-1 verewigt (Daten nicht gezeigt). In der Tat haben wir eine Tendenz der pro-apoptotische Fähigkeit von miR-214 Vorstufe in MKN45 Zelllinie (Abbildung S2M-N, P
= 0,0606), aber der Unterschied war statistisch nicht signifikant.

miR-214 richtet sich direkt und herunterreguliert CSF1 in Magenkrebszellen

um Ziele von miR-214 identifizieren, wir TargetScan Algorithmus verwendet, miR-214 Ziele in menschlichen Magenkrebs vorherzusagen. Unter den zahlreichen möglichen Kandidaten, nahmen wir die, die bei Krebserkrankungen und proliferations und Metastase-assoziierten Gene, einschließlich NOTCH2, FGFR1, CSF1 (6A), AGAP2, CREB-1, für die weitere Analyse überexprimiert wird. Unsere Ergebnisse zeigten, dass miR-214-Vorläufer-Transfektion signifikant die Aktivität eines Luciferase-Reportergens reduziert auf die CSF1 verschmolzenen 3'-UTR, mit 29,60% und 30,61% ige Reduktion im Vergleich zu den negativen Kontrollgruppen (6B, P
= 0,0227 und 0,0093, jeweils für MKN45 und BGC823 Zelllinien). Während bei der miR-214-Inhibitor transfiziert wurde, wurde von 34,49% und 42,25% in MKN45 und BGC823 Zellen Luciferase-Aktivität erhöhte sich im Vergleich zu den Kontrollen (6C, P
= 0,0115 und 0,0085, respectively).

Wir bestimmt weiter die Expression von CSF1 Protein durch Western-Blot in GC mit miR-214-Vorläufer oder Inhibitor transfizierten Zellen. In Übereinstimmung mit den Luciferase-Ergebnissen wurde die Expression von CSF1 Protein signifikant verringert in SGC7901 und MKN45-Zellen (6D-E, P
= 0,0037 und 0,0066, respectively), transfiziert mit miR-214-Vorläufer und erhöht in MKN28 und BGC823 Zellen (S7A-B, P
= 0,0049 und 0,0416, respectively), transfiziert mit miR-214-Inhibitor, im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen. Diese Daten legen nahe, dass miR-214 CSF1 Übersetzung in Magenkrebszellen hemmt.

Diskussion

Beweise Schwellen hat die entscheidende Auswirkungen der miRNA Dysregulation auf Tumorigenese von humanen Karzinomen hervorgehoben [3], [4] . MiRNA Dysregulation fördert die Zellproliferation, verleiht Resistenz gegenüber Apoptose und verbessert Invasivität und Metastasierung, durch die stromabwärtige Tumorsuppressoren Unterdrückung oder die Ansammlung von Ziel Onkogene induzieren und somit in der Initiation, Progression beteiligt ist, und die Metastasierung von menschlichen Tumoren.

Unter der Fülle von miRNAs, Dysregulation von miR-214 wurde in zahlreichen menschlichen Krebserkrankungen gefunden [15] - [22]. Das Herunterregulieren von miR-214 in Gebärmutterhalskrebs wurde von mehreren Gruppen berichtet worden, und miR-214 das Wachstum, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen, indem sie auf Onkogene MEK3, JNK1, Plexin-B1 und GALNT7 wurde [15 hemmen gezeigt ] - [17]. MiR-214 wurde auch, indem sie anomal erhöhte Onkogen Ezh2 Akkumulation und anschließenden unkontrollierte Zellproliferation und Invasion [18] verringert werden bei Brustkrebs und tragen zur Brust Tumorigenese gefunden. Jedoch Penna et al. haben gezeigt, dass miR-214 ist hoch in menschlichen Melanomen exprimiert und trägt zur Melanom-Tumorprogression durch Unterdrückung der TFAP2C, einem Homolog von einer etablierten Melanomen Tumorsuppressor [19]. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Rolle der miR-214 in der Krebstherapie ist Gewebe- oder zell- spezifisch.

Eine aktuelle Studie von Ueda et al. zeigten, dass mit klinischen Stadium, Peritonealdialyse Verbreitung und das Überleben von Patienten [20] Dysregulation von miR-214 korreliert. Allerdings bleibt die genaue Rolle von miR-214 in dem Fortschreiten des Magenkarzinoms und die ihr zugrunde liegenden molekularen Mechanismen schwer fassbar. Hier zeigen wir, dass miR-214 im Wesentlichen in GC reduziert wurde, vor allem in metastatischen Geweben, eine mögliche Rolle von miR-214 was darauf hindeutet, in Lymphknoten-Metastasen der Vorhersage, die sich bei unserer ROC-Kurve Analyse unterstützt wurde. Darüber hinaus fanden wir, dass niedrige Expression von miR-214 eine Neigung zu einer größeren Größe des Tumors hatte. Um Adresse, ob die Fehlregulation von miR-214 eine biologische Bedeutung trägt, verwendeten wir eine Follow-up-Studie und funktionelle Analyse von miR-214 In-vitro-
. Dennoch deuten darauf hin, unsere Daten, dass miR-214 keinen Einfluss auf das Outcome der Patienten hat, einschließlich Rückfall Status und Überleben. Unsere Daten zeigten, dass die Überexpression von miR-214 mit Lentiviren miR-214-exprimierenden Vektor drastisch reduziert Migration und Invasion von GC-Zelllinien und Zuschlags von miR-214 konnte die Zellproliferation, Apoptose, Migration und Invasion in einer zellspezifischen Weise zu erleichtern, mit keinen Einfluss auf die Zellapoptose.

CSF1 (Kolonie-stimulierender Faktor 1 (Makrophagen)) ist ein kritischer Faktor, hämatopoetischer Wachstums Makrophagen-Zelldifferenzierung, Proliferation und Aktivierung Einbeziehung in und es ist auch in nicht-hämatopoetischen Zellen [21] . CSF-1 wirkt zelluläre Überleben und die Proliferation über die Bindung an seinen Rezeptor durch die c-fms-Gen kodiert [22]. Frühere Studien zeigten, dass CSF1 eine wichtige Rolle bei der Förderung des Tumorangiogenese in Leiomyosarkom [23] und Lewis-Lungenkarzinom-Zellen durch VEGF Induktions ausgeübt [24]. Aligeti S et al. schlug vor, dass CSF1 positive Wirkung auf die Bindung an pleuralen Mesothelzellen, Invasion und Proliferation von Endometrium-Epithelzellen [25] hat. Und erhöhte Serumkonzentrationen von hat mit dem Krankheitsstadium, Lymphknotenmetastasen und schlechter Prognose bei Patienten mit Darmkrebs korreliert [26]. Hier haben wir festgestellt CSF1 ein direktes Ziel von miR-214 war bei Magenkrebs durch Luciferasetests und weiter durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Unsere Daten legen nahe, dass die Herunterregulierung von miR-214 kann die Proliferation, Migration und Invasion Kapazität von Magenkrebszellen durch das CSF1-vermittelten Signalweges erleichtern.

In der früheren Studie, Ueda et al. zeigten, dass bei ungünstigen Gesamtüberleben in 101 Patienten assoziiert war relativ höhere Expression von miR-214 in GC (erhalten von der Universität von Tokyo und Hiroshima University) [20], jedoch angegeben unsere Daten, dass miR-214 nicht signifikant mit Patienten korrelierte Ergebnis. Wir gehen davon aus, dass diese Diskrepanz zu den verschiedenen miRNA-Expressionsnachweismethoden zurückzuführen sein kann, Stichprobengrößen und Nachlaufzeiten zwischen ihren Forschungs- und unsere. Ueda et al. geteilt wurde, um die Proben in zwei Klassen (hohe und niedrige Expression) mit den mittleren Ebenen der miRNA-Expression gemessen an einer microRNA Microarray als Schwelle, während unsere Abteilung mit hoher und niedriger Expression Gruppen basierend auf dem mittleren Niveau der Expression von den qPCR Ergebnisse gewonnen . Interessanterweise in früheren Studien wurde miR-214-Expression wurde in Eierstockkrebs im Vergleich mit normalen Eierstockzellen von Yang et al werden aufreguliert gezeigt. [27], während die entgegengesetzte Ergebnisse wurden von Nam et al. [28]. Beide dieser beiden Gruppen verwendet miRNA-Microarrays der miRNA-Expression zu untersuchen. So können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass Microarray-Analyse nicht so empfindlich und genau sein kann, die Expressionsprofile eines bestimmten miRNA bei der Analyse. Als für die Wirkung von miR-214 auf die Prognose von Patienten mit GC, teilweise im Einklang mit den Ergebnissen von Ueda et al., Fanden wir auch eine Tendenz, dass eine hohe Expression von miR-214 für das Überleben ungünstig war, als die Nachlaufzeit war länger als 40 Monate (Hazard-Ratio (HR) = 1,19 für das Gesamtüberleben, HR = 1,23 für das rezidivfreie Überleben), wie in Abbildung 2 gezeigt, obwohl der Trend nicht statistisch signifikant war. Auf jeden Fall weitere Untersuchungen mit einer größeren Kohorte und verschiedenen experimentellen Einstellungen nötig sind, um dieses Problem zu lösen.

Wie bei der Diskordanz von miR-214 Lentivirusvektoren und Vorläufer der Transfektion Assays, wir vermuten, es ist eine bestimmte Folge von die biologischen Aktivitäten von miR-214. Eine moderate und stabile Expression eher als Zehntausende von Nicht-pathophysiologischen overexpresion kann gut miR-214-Funktion helfen.

Insgesamt wir gezeigt, dass miR-214 im Wesentlichen in GC reduziert wurde, vor allem in metastatischen Geweben, was darauf hindeutet, eine mögliche Rolle der miR-214 in Lymphknoten-Metastasen vorherzusagen. Unsere ROC-Kurve Analyse zeigte die relativ hohe Spezifität und Sensitivität von miR-214 für die GC-Fälle aus nontumourous Kontrollen Unterscheiden und Trennen Patienten mit und ohne Knoten Metastasen Lymphe und damit ihre potentielle Nützlichkeit als neuartige Biomarker für die GC und Lymphknotenmetastasen auffordert, die wird hilfreich sein, die klinische Behandlung von GC zu erleichtern. Aber unsere Daten zeigten, dass miR-214 keine Auswirkungen auf die Prognose eines Patienten hat, was darauf hinweist, dass miR-214 allein nicht genug ist, das Überleben des Patienten zu beeinflussen.

• PLoS ONE: Erhöhte Plasma-D-Dimer Spiegel korrelieren mit langfristige Überleben von Patienten mit Magenkrebs
• PLoS ONE: HIF-1 Alpha-Überexpression korreliert mit schlechten Gesamtüberleben und krankheitsfreie Überleben bei Patienten mit Magenkrebs Post-Gastrektomie