PLoS One: csökkent expressziója a ARID1A gén rossz prognózissal társul az elsődleges Gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

A ARID1A katalógusa gén kódolja adenin-timin (AT ) gazdag interaktív domént tartalmazó fehérje 1A, amely részt vesz a kromatin átalakítás. ARID1A
már azt mutatta, hogy működjön a tumorszuppresszor különböző rák típusok. A jelenlegi vizsgálat során azt vizsgáltuk, hogy a véleménynyilvánítás és a prognózis értéke ARID1A katalógusa elsődleges gyomorrák. Eközben a biológiai szerepe ARID1A katalógusa tovább vizsgáltuk sejt modell in vitro. Katalógusa

Módszertan /fő eredményei katalógusa

A betöltött szerepének vizsgálatára ARID1A katalógusa gén elsődleges gyomorrák patogenezise, ​​valós idejű, kvantitatív PCR és western blot arra használnak, hogy vizsgálja meg a ARID1A katalógusa kifejezést párosított rákos és nem rákos szövetekben. Eredmények azt mutatják, csökkent ARID1A katalógusa mRNS ( P katalógusa = 0,0029) és fehérje ( P katalógusa = 0,0015) kifejezés a legtöbb tumort hordozó szövetekben képest kiegyenlített szomszédos nem-tumoros szövetek, és a gyomor rákos sejtvonalakban. Ahhoz, hogy tovább vizsgálják a klinikopatológiai és prognosztikai szerepének ARID1A katalógusa kifejezés végeztünk immunhisztokémiai elemzésével 224 paraffinba ágyazott gyomorrák szövettani blokkok. Adatok azt igazolták, hogy a veszteség a ARID1A katalógusa expresszió szignifikánsan korrelált a T stádium ( P katalógusa = 0,001) és az állapot ( P katalógusa = 0,006). Ezekkel az eredményekkel egybevág, azt találtuk, hogy a veszteség ARID1A katalógusa expresszió szignifikánsan korrelált a rossz túlélést gyomorrákos betegek ( P katalógusa = 0,003). Cox regressziós elemzések azt mutatták, hogy a ARID1A katalógusa kifejezés volt független előrejelzője a teljes túlélés ( P katalógusa = 0,029). Továbbá, a funkciók ARID1A katalógusa szaporodásában és kolóniaképzést gyomor sejtvonalak elemeztük sejtek transzfektálása teljes hosszúságú ARID1A katalógusa expressziós vektor vagy siRNS célzás ARID1A katalógusa . Visszaállítása ARID1A katalógusa kifejezés a gyomorrák sejtek szignifikánsan gátolja a sejtek szaporodását és telepek kialakulása. Hangtompító ARID1A katalógusa kifejezést gyomornyálkahártya sejtvonalban jelentősen fokozott sejt növekedési üteme. Katalógusa

Következtetések /Jelentés katalógusa

Adataink arra utalnak, hogy a ARID1A katalógusa játszhatnak fontos szerepe a gyomorrák és szolgálhat értékes prognosztikai marker és potenciális célpontja génterápiás kezelésében gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Wang Dd, Chen Yb, Pan K, Wang W, Chen SP, Chen Jg , et al. (2012) csökkent expressziója a ARID1A katalógusa gén rossz prognózissal társul az elsődleges gyomorrákban. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10,1371 /journal.pone.0040364 katalógusa

Szerkesztő: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore katalógusa

Beérkezett: január 19, 2012; Elfogadva: június 6, 2012; Megjelent: július 13, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Dandan et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (30973398) és Guangdong Természettudományi Alapítvány (925100890). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganat világszerte a második leggyakoribb oka a rák összefüggő haláleset évente (10,4% a rákos halálesetek) [1]. Kezelése gyomorrák kombinációját tartalmazza műtét, kemoterápia, vagy sugárkezelés. Ugyanakkor közel 60% -a az érintett betegek ellenállni a gyomorrák után is gyógyító reszekció egyedül vagy után adjuváns terápia [2]. Régóta ismert, hogy a gyomorrák eredmények kombinációjából származó környezeti tényezők és a felhalmozási generalizált és specifikus genetikai változtatások. Sok a genetikai vagy epigenetikai változások összefüggő gyomorrák, beleértve az elmaradt heterozigótaság, mikroszatellit és a kromoszómális instabilitás és hipermetilációt számoltak [3]. Megértése ezek a változások és a szerepet játszó molekuláris mechanizmusok gyomor karcinogenezis kritikus lesz a javulás a diagnózis, terápia és prognózis előrejelzésére ez a betegség. Katalógusa

A eukarióta konzervált SWI /SNF kromatin-átalakítás komplex játszik fontos szerepet játszanak a különböző a celluláris folyamatok, beleértve differenciálódást, proliferációt és a DNS-javítás [4]. Elvesztése SWI /SNF alegységek leírták a legtöbb tumorban, és a nagy számú kísérleti megfigyelések arra utalnak, hogy ez az összetett kritikus tumorszuppressziónak [5]. A komplexek tartalmaznak hét vagy több nem katalitikus alegységet, amely feltehetően segít modulálják célzási és aktivitását az ATP-áz [6]. Az egyik alegység ennek az összetett, hSNF5 /Ini1 /BAF47, már azonosították tumorszuppresszor [7], [8]. A másik nem katalitikus alegység, P270 /ARID1A /BAF250a (adenin-timin AT-gazdag interaktív domént tartalmazó fehérje 1A), kimutatták, hogy esszenciális a normális sejtciklus [9]. Kiütése ARID1A
egy leukémia sejtvonal rezisztenciát a Fas-közvetített apoptózisra. [10]

A közelmúltban, ARID1A
mutációk és a veszteség a BAF250a fehérje Azt találtuk, hogy nagyban függ az a petefészek világos-sejtes carcinoma és a méh alacsony fokozatú endometrioid carcinoma [11] - [13]. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy ARID1A katalógusa potenciális jelölt tumor szupresszor gén. Azonban a klinikai jelentősége az ilyen eltérés véleménynyilvánítás és a funkció a ARID1A fehérje marad meghatározatlan hiánya miatt a tanulmányok segítségével friss humán tumor mintákban. A jelen tanulmányban elemeztük a ARID1A katalógusa expressziós szintje a gyomorrák valós idejű kvantitatív RT-PCR, Western blot és immunhisztokémiai. Közben azonosították a kapcsolatát ARID1A katalógusa kifejezés klinikopatológiai jellemzők és értékelte annak prognosztikai értéke utáni eltávolítását túlélése gyomorrákos betegek. Továbbá értékeltük a funkcionális szerepe a ARID1A katalógusa tumorigenezis elsődleges gyomorrák vizsgálva in vitro proliferációs és telepképződése gyomor sejtvonalak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

ARID1A katalógusa mRNS-expresszió elemeztük valós idejű kvantitatív RT-PCR katalógusa

A mRNS szintje a ARID1A katalógusa határoztuk valós idejű kvantitatív RT-PCR-vizsgálatokhoz 66 páros rákos és kiegyenlített szomszédos normál gyomornyálkahártya szövetekben. A ARID1A katalógusa expressziós szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a 43 (65,15%), tumoros szövetekben, mint a szomszédos, nem daganatos szövetek ( P katalógusa = 0,0029, 1. ábra). Katalógusa

ARID1A Protein Expression elemeztük Western blot katalógusa

Western blot vizsgálatot 25 gyomorrák mintákat és a megfelelő szomszédos, nem rákos gyomornyálkahártya szöveteket a 66 párosított minták. Az eredmények azt mutatták, egy ARID1A sáv a várt mérete 242 kDa és az összeget a ARID1A fehérje jelen volt további mért denzitometriával. Összhangban a kvantitatív valós idejű PCR eredményeit, a csökkenés a ARID1A expresszió volt megfigyelhető az 13 (52%), a gyomor tumor szövetekben képest egyező szomszédos, nem-tumor szövetekben ( P
= 0,0015, ábra a 2A és 2B ábra). Hasonlóképpen, a ARID1A fehérje expresszióját jelentősen csökkent gyomor rákos sejtvonalban, a SGC7901, AGS, különösen MGC803, szemben a normál gyomor sejtvonal GES1 (2C ábra).

immunhisztokémiai analízist ARID1A Expression gyomorkarcinómában Tissue Minták és kapcsolata a klinikopatológiai paraméterek katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálják a klinikopatológiai és prognosztikai szerepének ARID1A kifejezés végeztünk immunhisztokémiai elemzésével 224 paraffinba ágyazott gyomorrák szövettani blokkok. Összességében 115 224 (51,3%) esetben mutatott negatív ARID1A kifejezés a rákos szövetekben (3B), míg 109 (48,7%) esetben mutatott pozitív immunhisztokémiai (3C, ábra &D). Normál gyomornyálkahártya mutatta a legerősebb ARID1A pozitív festődés (3A ábra). A korrelációt a kifejezése ARID1A és különféle klinikopatológiai paraméterek az 1. táblázatban felsorolt ​​Az adatok azt mutatták, hogy a veszteség ARID1A expresszió szignifikáns korrelációt mutatott a mélysége tumor infiltráció (t szakaszban, P
= 0,001) és a tumor évfolyam ( P katalógusa = 0,006), de nem az életkor, a nem, a daganat mérete, a távoli áttétek (M fázis) és tumor helyére, vagy helyi nyirokcsomó áttét (N stádium). katalógusa

Expression A ARID1A és a klinikai kimenetel katalógusa

Az 5 éves teljes túlélési arány betegeknél pozitív és negatív ARID1A kifejezés volt 68,8% és 52,2% volt. A betegek teljes túlélése negatív ARID1A kifejezés szignifikánsan rosszabb volt, mint a ARID1A-pozitív betegek ( P katalógusa = 0,003, log-rank teszt, 4. ábra). Az egyváltozós Cox regressziós elemzések azt mutatták, hogy mélysége tumor beszivárgás, helyi nyirokcsomó áttét, távoli áttétek, a tumor mérete és ARID1A expresszió szignifikánsan társul a teljes túlélés (2. táblázat). Továbbá, a többváltozós Cox regressziós elemzés megerősítette a mélység tumor beszivárgás, helyi nyirokcsomó áttét, távoli áttétek és ARID1A kifejezés önálló jósolja teljes túlélése gyomorrákos betegek (2. táblázat). Katalógusa

A szerepe ARID1A katalógusa sejtburjánzás és telepképződése MGC803 és GES1 sejtvonalak

hatásainak értékelésére ARID1A katalógusa a sejtburjánzást, a ARID1A katalógusa expressziós vektor és a kontroll vektort rendre transzfektáltunk MGC803 sejtekben. ARID1A
expressziója transzfektált sejteket detektáltuk Western blottal (5A ábra). A sejtnövekedési vizsgálati eljárás kimutatta, hogy a sejt növekedési arány ARID1A
-transfected gyomorrák-sejtek szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll vektor transzfektált gyomorrák-sejtek (5C). Eközben a hatékonyságát kolónia képződését szignifikánsan ( P
= 0,0379) gátolta a ARID1A
-transfected gyomorrák-sejtek, mint a kontroll vektorral transzfektált gyomorrák sejtek (5D ábra). Ahhoz, hogy tovább erősítse az elterjedése elnyomása funkció ARID1A katalógusa, mi elhallgattatta a ARID1A katalógusa kifejezést GES1 sejtvonal siRNS. A ARID1A
expressziója transzfektált sejteket detektáltuk Western blottal (5B, ábra). Azt találtuk, hogy elhallgattassa a kifejezés ARID1A
GES1 jelentősen megnövekedett sejtproliferáció képest ál siRNS kezelés (5E ábra). Katalógusa

Vita katalógusa

Annak ellenére, hogy nagy előrelépés a diagnózis és terápia, gyomorrák továbbra is az egyik leghalálosabb daganatok, a rossz prognózisú után radikális gastrectomián [14], [15]. A klinikai kimenetelét gyomorrák határozza meg egy sor tumor jellemzők, mint például a lokoregionális a tumor növekedését és invázió, differenciálódás fokozatú, angiogenezis, távoli metasztázis és a sejtciklus előrehaladását, amely szabályozza a különböző rokon gének, beleértve az onkogének és tumorszuppresszor géneket. Ezért, az azonosítás a gyomorrák-specifikus biomarkerek részt ezekben az eljárásokban nagyon fontos a diagnózis, a terápia és a prognózis predikciós klinikán.

ARID1A katalógusa, egy újonnan azonosított tumorszuppresszor gén, amely kódolja a tagja a SWI /SNF komplex, nagy a mutációs gyakoriság a húgyhólyagrák, a méh endometrioid karcinóma, petefészek endometrioid és világos sejtes karcinóma [11] - [13], [16], [17]. Petefészek világos sejtes carcinoma, ez azt jelentette, hogy a ARID1A katalógusa mutáció szignifikánsan összefügg ARID1A immunreakciót [18]. Nemrégiben exome szekvenálás tanulmány kimutatta, hogy a ARID1A katalógusa is gyakran mutáns gyomorrákban [19], [23]. Azonban eddig a kifejezést, klinikai jelentősége és biológiai funkcióit ARID1A katalógusa gyomorrákban nem vizsgálták meg. Ezért értékeltük a kifejezés a ARID1A
gyomorrák real-time PCR, Western-blot és immunhisztokémiai, amellett, hogy a klinikopatológiai és prognosztikai jelentősége egy nagy humán mintában. Továbbá in vitro sejt modell, megvizsgáltuk a tumor szupresszor szerepét ARID1A katalógusa a gyomor sejtek részletesen. Katalógusa

A jelenlegi vizsgálat során kimutattuk, hogy ARID1A katalógusa expresszálódott mindkét alsó mRNS és fehérje szinten gyomorrákban szövetekben, mint a megfelelő nem-rákos nyálkahártyáját. Egyetértésben A molekuláris biológiai eredmények, immunhisztokémiai egy anti-ARID1A antitest mutatta, hogy ARID1A katalógusa teljesen elhallgattatta 115, a 224 beteg gyomorrák minta pozitív kifejezés egy másik 109 beteg. A megfigyelés összhangban van azzal egy sor tanulmány felfedi, hogy A ARID1A
expresszió gyakran elvesznek vagy csökkentett számos rákos szövetekben és sejtvonalakban, mint például a mellrák, méh-endometrioid karcinóma, petefészek világos sejtes és endometrioid karcinóma [13,18,20 és 21]. katalógusa

a mai napig az okai ARID1A katalógusa hangtompító még nem teljesen tisztázott. A jelenlegi tanulmányok középpontjában a mutációk ARID1A katalógusa, különösen a nőgyógyászati ​​rák. Úgy tűnik, hogy egy értelmetlen vagy indel mutációja ARID1A katalógusa korrelált elvesztése vagy csökkenése protein expresszió méh endometrioid karcinóma, petefészek-karcinóma endometrioid és világos sejtes carcinoma [11] - [13], [18]. Egy integrált genom vizsgálat Mamo és munkatársai katalógusa. csak talált egy csonka mutációja ARID1A
a T47D emlőrák sejtvonal, anélkül, hogy bármilyen mutáció a 11 emlőrák mintákat, amely azt mutatta DNS kópiaszámát veszteség a 1p36.11 lókusz szomszédos ARID1A
[22]. Nyolc, kilenc minták DNS kópiaszám veszteség 1p36.11 szintén alacsony ARID1A fehérje expresszió, felvetve konkordancia kópiaszám veszteség és ARID1A katalógusa inaktiválása. A exome szekvenálás tanulmánya Wang és munkatársai katalógusa., Összesen 46 mutációt találtak 32 109-ből (29%) gyomorrák mintákat, 39 (85%) csonka mutációk [19]. Huszonnégy (75%) a 32 gyomorrák minták ARID1A katalógusa mutációk egyikben elvesztése vagy lényegesen csökkent fehérje expressziós összehasonlítva a nem ARID1A katalógusa mutációt. Ezzel szemben, már csak 6 gyomorrák mutató minták vagy hiányzik, vagy gyenge fehérje expresszió mutatható ARID1A
mutáció, ami azt sugallja, hogy más mechanizmusok hozzájárulhatnak a ARID1A
inaktiválását. Nemrég egy másik exome szekvenálás kutatás Zang és munkatársai katalógusa. az is kiderült, ARID1A katalógusa mutációk 8% gyomor minták, amelynek 75% elveszett vagy csökkent a fehérje kifejezés [23]. Még érdekesebb, hogy mindkét vizsgálatban igazolták a magasabb ARID1A katalógusa elváltozások gyomorrák minták mikroszatellit instabilitás (MSI), mint a mikroszatellit stabilitás (MSS). Sőt, a mutáció spektrumát ARID1A katalógusa különbözik a két genetikai típusú gyomorrák, a legtöbb indels az MSI típusú és több egyszeri neucliotide eltérések a MSS típus. MSI definiáljuk indel mutációk belül nukleotid ismétlődő (más néven mikroszatellita régiók) eredményezett DNS mismatch repair gén inaktiválása indukált replikációs hibák [24]. Javasolt, mint a kezdeményező genomi események gyomorrák, az MSI gyakran vezet felhalmozódása további rákkal kapcsolatos genetikai instabilitást, mint például allélikus veszteségek és frameshift mutációk részt vevő gének a sejtproliferációban szabályozás, az apoptózis és a DNS javító. Leírták, hogy az MSI fordul elő 25% és 50% -a sporadikus gyomorrák, meghatározva egy egyedi genetikai típusú betegség különböző klinikopatológiai jellemzői [24]. Abban a vizsgálatban, Wang és munkatársai katalógusa., A indel mutációs ráta (78%) ARID1A katalógusa MSI gyomorrák összehasonlítható a TGFBR2 katalógusa MSI vastagbél rák, a jól megalapozott és funkcionálisan validált vezető gént inaktiválja MSI [25]. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a mutáció a ARID1A
együtt MSI lehet fontos szerepet játszanak a gyomor karcinogenezis. Ezért a kapcsolat ARID1A katalógusa változtatások és MSI állapotát gyomorrák, valamint a klinikopatológiai jelentőségét, további vizsgálatot igényel a jövőben a kutatás. Katalógusa

A tanulmány szerint Wang et al. katalógusa, a kifejezés a ARID1A katalógusa csak érzékelhető egy kis méretű mintát (32 eset), és nem volt további feltárását a klinikai jelentősége [19]. Itt egy nagyobb gyomorrák népesség (224 eset), azt találtuk, hogy a veszteség a ARID1A katalógusa expresszió szignifikánsan korrelált a nagyobb T szakaszában gyomorrák, utalva arra, hogy távollétében ARID1A katalógusa expresszió elősegítheti a tumor növekedését és inváziót. Ezen kívül, mi észlelt alacsonyabb ARID1A immunreaktivitás rosszul differenciált gyomorrákban szövetekben, mint a jól differenciált is, ami arra utal, hogy a csökkent ARID1A
expresszió szerepet játszhatnak a tumor de-differenciálódást. Összhangban a megállapítások, más kutatók is megállapították, hogy a csökkent ARID1A katalógusa expresszió szignifikánsan összefügg a magasabb fokozatú emlőrák [22], valamint a magasabb FIGO szakaszában petefészekrák világos sejtes carcinoma [21]. ARID1A képződését segíti elő BRG1 vagy BRM-zárt SWI /SNF kromatin átalakítás komplexek, melyek nélkülözhetetlenek a normális sejtciklus leállást [9], [26]. Katalógusa

A Kaplan-Meier túlélési analízis szignifikáns korrelációt a veszteség ARID1A katalógusa kifejezés és a szegényebb klinikai kimenetelét gyomorrákos betegek után radikális működését. Cox hazárd regressziós elemzések továbbá kimutatta, hogy a ARID1A katalógusa expressziós szint független kockázati tényező a túlélésért, ami arra utal, hogy ez szolgálhat értékes prognosztikai biomarker gyomorrákos betegek a műtét után, és egy potenciális célpontja génterápia kezelésére gyomorrák. Petefészek világos sejtes carcinoma, azt is jelentette, hogy pozitív betegek ARID1A katalógusa kifejezés hosszabb volt a progresszió-mentes túlélés, mint a negatív ARID1A katalógusa kifejezés [21]. Ezen túlmenően, a veszteség ARID1A
expresszió szignifikáns korrelációt mutat az kemorezisztencia petefészek világos sejtes karcinóma, amely szintén társítva rossz prognózist a rák. Ezek az adatok arra utalnak, hogy ARID1A katalógusa kifejezés és mutációs vizsgálat hasznos lehet az irányadó klinikai kezelése. Mindent összevetve, megfigyeléseink hogy a veszteség a ARID1A katalógusa kifejezést gyomorrák társul több rosszindulatú fenotípus és rosszabb prognózisú jelenti azt, hogy játszhat tumorszuppresszor szerepet gyomor kialakulásában. Katalógusa

tovább vizsgálták a funkcionális szerepe a ARID1A katalógusa a gyomor sejtvonalak. Visszaállítása ARID1A katalógusa kifejezés a gyomorrák sejtek szignifikánsan gátolja a sejtek szaporodását és telepek kialakulása. Hangtompító kifejezése ARID1A katalógusa a gyomor hámsejtek számottevően növeli a sejt növekedési ütem. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a ARID1A katalógusa játszhat import szerepet gátolja a tumor sejtek növekedését. Nemrégiben funkcionális próbák a ARID1A katalógusa gyomorrákban sejtvonalakon Zang és munkatársai katalógusa. azt javasolta, hogy ARID1A
fejtenek tumor-szuppresszor aktivitás [23]. Guan és munkatársai katalógusa. kimutatták, hogy a helyreállítása a kifejezés a vad típusú ARID1A
elegendő ahhoz, hogy elnyomják a proliferáció és tumorigenecity az xenograftok humán petefészek rákos sejtvonalak hordozó ARID1A
mutációkat, míg RNS-interferencia-mediált ARID1A
hangtompító javítja sejtproliferáció és tumorgenézisre két nem-transzformált humán petefészek epitheliális sejtvonalak, IOSE-80PC és OSE4 [27]. Ezek az adatok, valamint a miénk, azt sugallják, hogy a veszteség ARID1A katalógusa is fontos szerepet játszanak a folyamatban kialakulásában. Katalógusa

Összefoglalva bemutattuk, a veszteség a ARID1A
expresszió gyomorrák és annak összefüggést egy rosszindulatú fenotípus és rosszabb prognózist egy nagy számú klinikai mintákban. Ezen túlmenően, bebizonyítottuk, hogy ARID1A
képes gátolni a tumorsejtek növekedését és kolónia képződését in vitro. A legjobb tudásunk szerint, az előállított adatok a jelenlegi vizsgálatban jelentik az első jelentés korreláló jelenlétében ARID1A katalógusa klinikopatológiai jellemzők és a teljes túlélés a gyomorrákos betegek. Együtt az eredmények Wang et al. Katalógusa és Zang és munkatársai katalógusa. [19], [23], azt is megerősítette, hogy a ARID1A katalógusa lehetne a jelölt tumorszuppresszornak prognosztikai biomarker a gyomor kialakulásában. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai nyilatkozat

a kutatás hagyta jóvá az etikai bizottság a Szun Jat-szen Egyetemen Cancer Center, és írásos beleegyezését adta minden beteg vett részt a tanulmányban. katalógusa

sejtvonalak és tenyésztési körülmények

a gyomorrák-sejtvonalak, SGC7901, AGS, MGC803, és a gyomornyálkahártya nyálkahártya sejtvonal GES1 kaptuk Bizottsága Type Culture Collection of kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína). A sejtvonalakat RPMI 1640 táptalajban mellékelt 10% hővel inaktív magzati borjúszérummal (FBS). A sejteket 37 ° C hőmérsékleten nedvesített kamrában, amely 5% CO _2.

Humán szövetmintát S Matton

összesen 66 párosított rákos és illeszkedik a szomszédos jóindulatú gyomornyálkahártya szöveteket gyűjtöttünk gyomorrákos betegek gastrectomián a Szun Jat-szen Egyetemen Cancer Center 2009 és 2011 között, és a diagnózist patológiai vizsgálat. A 25 párosított rákos és nem rákos megfelelő szomszédos gyomornyálkahártya szövetek kimutatására használják a ARID1A fehérje expresszió Western blot választottak a 66 párosított minták. Műtéti eltávolítása után, a friss szöveteket azonnal bemerült a RNAlater (Ambion, Inc., USA), hogy elkerülje az RNS lebomlását, tároljuk 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át, hogy lehetővé tegye alapos behatolását RNAlater a szövetbe, majd -80 ° C-on, amíg az RNS és fehérje extrakciót végzünk. Egy másik 224 paraffinba ágyazott primer gyomor carcinoma minták gyűlt össze 2003 és 2005 között, kaptuk a Szun Jat-szen Egyetemen Cancer Center. Ezen betegek egyike sem kapott sugárterápia vagy kemoterápia a műtét előtt. A követési adatok a gyomor rákos betegek ebben a vizsgálatban állnak rendelkezésre, és teljes. A követési idő történt a járóbeteg és tartalmazza a klinikai és laboratóriumi vizsgálatokat 3 havonta az első 2 évben, minden 6 hónap alatt a harmadik, negyedik és ötödik évben, évente további 5 évig, vagy addig, amíg a beteg halálát, amelyik történt először. A kórszövettani típusától és stádiumától gyomorrák szerint határoztuk meg a kritériumoknak a World Health Organization osztályozására és a TNM által meghatározott, az Unió nemzetközi Rákellenes. Katalógusa

kitermelése Teljes RNS és a valós idejű kvantitatív PCR

Teljes RNS-t extraháltunk TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. A teljes RNS-koncentráció mérésével abszorbancia 260 nm-en egy nano DROP spektrofotométerrel (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Reverz transzkripció (RT) szintetizálására az első cDNS szál végeztük 2 ug össz-RNS-kezelt M-MLV reverz transzkriptáz (Promega, USA) a gyártó ajánlásai szerint. Az így kapott cDNS-t ezután vetjük alá a valós idejű kvantitatív PCR-értékeléséhez a relatív mRNS szintjeit ARID1A
és a GAPDH katalógusa (gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, mint belső kontroll) a alábbi primerek alkalmazásával: ARID1A
forward: 5'-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ', és reverz: 5'-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3'; GAPDH
Forward: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', és reverz: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. Gén-specifikus amplifikációt végeztünk ABI 7900HT valós idejű PCR-rendszer (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA) egy 15 ul PCR-keverék, amely 0,5 ul cDNS, 7,5 ul 2 x SYBR Green Master Mix (Invitrogen, Carlsbad , Kalifornia, amerikai Egyesült Államok), és 200 nM a megfelelő oligonukleotid primerek alkalmazásával. A keveréket előmelegített 95 ° C (10 perc), majd a felerősített 95 ° C (30 másodperc), és 60 ° C (1 perc) 45 cikluson keresztül. A felbontás görbe mértük 95 ° C-on 15 másodpercig, 60 ° C-on 15 másodpercig és 95 ° C-on 15 mp. A Ct (küszöb ciklus) értékét minden minta esetében kiszámítjuk a küszöb ciklus a műszer szoftvere (SDS 2.3), és a relatív expresszióját ARID1A katalógusa mRNS normalizált GAPDH katalógusa érték . Az adatokat elemeztük az összehasonlító küszöb ciklus (2 ^{-ΔCT) módszerrel.}

Western-blot-analízis

A homogenizált gyomorrák mintákat, beleértve a tumor és a nem-tumoros szövetekben, valamint sejtvonalak , lizáltuk RIPA lízispufferben, és a lizátumot centrifugálással (12000 rpm), 4 ° C-on 30 percig. Körülbelül 50 ug fehérje mintákat ezután elektroforézissel választottuk el egy 12% -os nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélen és átvisszük egy polivinilidén-fluorid membrán. Blokkolás után a nem specifikus kötőhelyeket 60 percig, 5% zsírmentes tej, a membránokat inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on egy egér monoklonális antitest ellen ARID1A (Abgent primer antitest Company, USA, egy 1:1000 hígítás) . Ezután a membránokat háromszor mossuk TBST-vel (Tris-pufferolt sóoldattal Tween-20) 10 percig, és próbaként a torma-peroxidáz (HRP) konjugált nyúl anti-egér IgG antitest (Immunology Consultants Laboratory, USA, egy 1: 2000 hígításban) 37 ° C-on 1 órán át. Három mosás után a membránokat által kifejlesztett egy továbbfejlesztett kemilumineszcenciás rendszert (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). A sáv intenzitása mértük denzitometriás segítségével Quantity One szoftver (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). A fehérje szintje normalizáltuk, hogy a GAPDH alkalmazásával detektáltuk egér anti-humán GAPDH monoklonális antitest (Shanghai Kangchen, Kína, egy 1:10000 hígítás).

Immunhisztokémia Elemzés

A szöveti metszeteket paraffint a dimetilbenzol és rehidratált keresztül 100%, 95%, 90%, 80% és 70% etanolt tartalmaz. Három mosás után PBS-ben (foszfáttal pufferolt sóoldat), a lemezeket forraljuk antigén visszakeresés tartalmazó pufferben 0,01 M nátrium-citrát-sósav (pH = = 6,0) 15 percig egy mikrohullámú sütőben. Öblítés után PBS-sel, a szöveti metszeteket primer antitesttel inkubáltuk, és a lemezeket ezután leöblítettük 3% peroxidáz kioltás oldatot (Invitrogen), hogy blokkolja az endogén peroxidáz. A metszeteket ezután inkubáltuk egy egér monoklonális antitest ellen ARID1A (Abgent primer antitest Company, USA, egy 1:300 hígítás), 4 ° C-on egy éjszakán át, majd inkubáljuk torma-peroxidázzal (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) szobahőmérsékleten hőmérsékleten 30 percig. Mosás után PBS-ben, a megjelenítő jelet fejlesztették 3, 3'-diamino-benzidin (DAB) oldattal, és az összes a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük. Negatív kontrollként a szomszédos metszeteket a fent ismertetett eljárással, kivéve, hogy egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-blokkoló oldatban anélkül, hogy a primer antitesttel.

A teljes ARID1A immunfestés pontszám számítottuk az összege százalékban pozitívan festődő tumorsejtek és a festődés intenzitását. Röviden, a százalékos pozitív festődést pontoztuk 0 (0-9%, a negatív), 1 (10% -25%, sporadikus), 2 (26% -50%, fokális) vagy 3 (51% -100%, diffúz), és az intenzitás, mint 0 (nincs festés), 1 (gyenge festődés), 2 (közepes festés) és a 3. (sötét festés). A teljes immunfestést pontszám számoltuk értékének százalékos pozitivitás pontszám × festés intenzitása pontszámot, ami mozgott 0 és 9 közötti expressziós szintjének ARID1A definiáltuk következő: "-" (negatív, 0 pont), "+" (gyengén pozitív, pontszám 1-3), "++" (pozitív, pontszám 4-6), "+++" (erősen pozitív, pontszám: 7-9). Alapuló ARID1A expressziós szint, a gyomor rákos betegek két csoportra oszthatók: a negatív ARID1A kifejezés csoport (ARID1A-) és pozitív ARID1A kifejezés csoport (ARID1A +, ARID1A ++ vagy ARID1A +++). Katalógusa

expressziós plazmid és tranziens

a eukarióta expressziós plazmid pCMV6-Entry tartalmazó teljes hosszúságú humán ARID1A katalógusa cDNS nyert Asbio Technology Company (Guangzhou, Kína). Üres vektort használtuk negatív kontrollként. MGC803 sejteket tenyésztettünk 6 mérőhelyes lemezeken, amíg elérték 85-90% összefolyás, majd átmeneti transzfekció végeztük Lipofectamine 2000 (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Negyvennyolc órával a transzfekció után, a génexpressziót vizsgáltuk Western-blot-analízis. És akkor, sejtburjánzás és telepek kialakulása végeztünk. Katalógusa

RNS oligonukleotidok és sejtek transzíekciójával katalógusa

kiütése ARID1A katalógusa kifejezés, az siRNS állítottam elő GenePharma Company (Shanghai, Kína). A siRNS-szekvenciák a következők voltak: siRNA- ARID1A
, értelme: 5'GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 ', antiszensz: 5'AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3'. A negatív kontroll (NC), értelme: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 "antiszensz: 5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3". 400 pmol siRNA- ARID1A katalógusa vagy NC-t transzfektáltunk 2 × 10 ^{5 GES1 sejteket Lipofectamine RNSi MAX reagenssel (Invitrogen, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja. Ezt követően, a sejtproliferációt végeztünk azután.}

Proliferation Assay

Cell növekedési üteme MGC803 vagy GES1 sejtek detektáltuk MTS sejt proliferációs vizsgálati eljárásban. Sejteket szélesztettünk egy 96 mélyedéses lemezen sűrűségben 5 × 10 ^{2 sejt per lyuk. A sejt növekedés üteme detektáltuk sejtproliferáció MTS szerinti készlet a gyártó utasításai szerint (Promega, USA). Mindegyik kísérletet három párhuzamosban végeztük.}

telepképző assay

A telepképző assay, ARID1A
expresszáló MGC803 sejtek vagy kontroll MGC803 sejtet szélesztünk egy 6 mérőhelyes lemez sűrűségben 5 × 10 ^{2 sejt per lyuk. 10 nap után a kultúra, túlélő telepek (> 50 sejtet kolónia) megszámoltuk a kristály ibolya (0,5%) festés. Colony-képző hatékonyság (CFE%) úgy definiáljuk, mint az arány a telepek számát képződött kultúra a sejtek száma oltjuk be.}

• PLoS One: eltérő tendenciákat a Recent Lakosság-alapú túlélési arány nyelőcső és a gyomorrák
• PLoS One: azonosítása HSA-miR-335 prognosztikus Signature gyomorrákban