PLoS ONE: Smanjena Izražavanje ARID1A gena povezana s lošom prognozom u Osnovnoj želučani Cancer

Sažetak pregled

Pozadina pregled

ARID1A pregled gen kodira adenin-timin (AT ) -bogatsvo interaktivna proteina 1A domene koje sadrže, koja sudjeluje u modeliranjem kromatina. ARID1A pregled je pokazao da djeluje kao sredstvo za suzbijanje tumora u različitim vrstama raka. U trenutnoj studiji istraživali smo ekspresiju i prognozu vrijednost ARID1A Netlogu u osnovnoj raka želuca. U međuvremenu, biološka uloga ARID1A pregled je dodatno istražiti pomoću modela stanica in vitro. Pregled

Metodologija /glavne nalaze

Kako bi istražili ulogu ARID1A pregled gena u osnovnoj želučane patogenezi raka, u realnom vremenu kvantitativni PCR i western blot kako bi se ispitala ARID1A pregled izraz u uparenih kancerogenih i noncancerous tkiva. Rezultati su pokazali smanjeni ARID1A pregled mRNA ( P pregled = 0.0029) i proteina ( P pregled = 0,0015) izraz u većini tkiva imaju tumor u usporedbi s odgovarajućom susjednom nisu tumora tkiva, te u želučanom staničnim linijama raka. Kako bi se dodatno istražiti kliničkopatološka i prognostičkih uloge ARID1A pregled, izraza, proveli smo imunohistokemijski analizama 224 parafin-ugrađen raka želuca tkiva blokova. Podaci otkrila da je gubitak ARID1A pregled izražavanje bilo značajno povezano s T fazi ( P pregled = 0,001) i razreda ( P pregled = 0,006). U skladu s tim rezultatima, otkrili smo da je gubitak ARID1A pregled, izraz značajno je povezana s lošim preživljavanje u bolesnika s rakom želuca ( P pregled = 0,003). Cox regresijska analiza pokazala je da ARID1A pregled, izraz lica bio je neovisni predskazatelj ukupno preživljavanje ( P pregled = 0,029). Nadalje, funkcija ARID1A pregled u proliferaciji i kolonija oblikovanju staničnih linija želučanih su analizirani transfekcijom stanica s full-length ARID1A pregled Vektor ekspresije ili siRNA ciljanja ARID1A pregled , Vraćanje ARID1A pregled izraz u želučanim stanicama raka značajno inhibira proliferaciju stanica i formiranje kolonija. Utišavanje ARID1A pregled izraz u želučanoj epitelnih stanica linije značajno poboljšana stopa rasta stanica. Pregled

Zaključci /Značaj pregled

Naši podaci upućuju na to da ARID1A pregled može igrati važnu ulogu u raka želuca i može poslužiti kao vrijedan prognostički biljeg i potencijalna meta za gensku terapiju u liječenju raka želuca pregled

Izvor:. Wang dd, Chen Yb, Pan K, Wang W, Chen Sp, Chen Jg et al. (2012) Smanjen izraz ARID1A pregled, Gene je povezana s lošom prognozom u Osnovnoj rak želuca. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10,1371 /journal.pone.0040364 pregled

Urednik: Patrick Tan, Duke-National University Singapur Graduate Medical School, Singapur pregled

Primljeno: 19 siječanj 2012; Prihvaćeno: 6. lipnja 2012; Objavljeno: 13. srpnja 2012 pregled

Copyright: © 2012 Dandan i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (30973398) i Guangdong Natural Science Foundation (925.100.890). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je četvrti najčešći zloćudni tumor u svijetu i drugi najčešći uzrok smrti od raka povezanih svake godine (10,4% smrti od raka) [1]. Liječenje karcinoma želuca uključuje kombinaciju operacije, kemoterapije ili terapije zračenjem. Međutim, gotovo 60% pacijenata pod utjecajem podleći raka želuca, čak i nakon samo kurativne resekcije ili nakon terapije adjuvantne [2]. Odavno je poznato da je želučani smrtnost od ove kombinacije čimbenika okoliša i akumulacije općih i specifičnih genetskih promjena. Mnogi od genetski ili epigenetičkim promjena povezanih s rakom želuca, uključujući i gubitak heterozigotnosti, mikrosatelitne i kromosomske nestabilnosti i Hipermetilacija, prijavljeni su [3]. Razumijevanje tih izmjena i molekularnih mehanizama uključenih u želučanom karcinogeneze bit će kritična za unapređenje dijagnostike, terapije i prognoze predviđanja ove bolesti. Pregled

eukaryotically očuvan SWI /SNF kromatina remodeliranja kompleks ima bitne uloge u raznim od staničnih procesa, uključujući i diferencijacije, proliferacije i popravka DNA. [4] Gubitak SWI /zbrinjavanju ING podjedinica je prijavljen u većini tumora, kao i velik broj eksperimentalnih zapažanja upućuju na to da ovaj kompleks je kritična za suzbijanje tumora [5]. Kompleksi sadrže sedam ili više noncatalytic podjedinica koje vjerojatno pomažu moduliraju ciljanje i aktivnost ATPaze [6]. Jedan podjedinica ovog kompleksa, hSNF5 /Ini1 /BAF47, identificiran je kao supresor tumora [7], [8]. Drugi noncatalytic podjedinica, P270 /ARID1A /BAF250a (adenin-timin AT-bogata domena interaktivni sadržava protein 1A), je pokazano da je bitna za normalan staničnog ciklusa [9]. Obaranje ARID1A pregled u leukemije stanične linije rezistenciju na Fas-posredovane apoptoze [10]. Pregled

Nedavno ARID1A pregled mutacijama i gubitka proteina BAF250a su pronađeni korelira jako s karcinomom jajnika jasno stanice i maternice niskog stupnja endometrioid karcinoma [11] - [13]. Ta opažanja ukazuju na to da ARID1A pregled je potencijalni kandidat tumor supresor gena. Međutim, klinički značaj tog diferencijalne ekspresije i funkcija ARID1A proteina ostaje nedefiniran zbog nedostatka ispitivanjima svježih uzoraka humanog tumora. U ovoj studiji analizirali smo ARID1A pregled razina ekspresije kod raka želuca u stvarnom vremenu kvantitativni RT-PCR, Western blot-i imunohistokemijski. U međuvremenu, utvrdili smo povezanost ARID1A pregled izražavanja i kliničkopatološkim mogućnosti i ocjenjuje njegovu prognostičku vrijednost u post-resekcija preživljavanje pacijenata s rakom želuca. Osim toga, procijenili smo funkcionalnu ulogu ARID1A Netlogu u nastanku tumora od primarnog raka želuca ispitivanjem in vitro proliferaciju i kolonija formaciju u staničnim linijama želuca. Pregled

Rezultati pregled

ARID1A pregled mRNA ekspresija je analizirana u realnom vremenu kvantitativna RT-PCR Netlogu

mRNK razina ARID1A pregled je određena u realnom vremenu kvantitativni RT-PCR analiza u 66 paru kancerogeni i podudarnog susjedne normalne želučane sluznice tkiva. ARID1A pregled razina ekspresije bila je značajno niža u 43 (65,15%), koji imaju tumor tkiva u usporedbi sa susjednim ne-tumorskih tkiva ( P pregled = 0,0029, slika 1). Pregled

ARID1A Protein Expression analizirani western blot analizom

Western blot je izvedena na 25 uzoraka raka želuca i odgovarajućih susjednih nekanceroznog želučane sluznice tkiva od 66 upareni uzorcima. Rezultati su pokazali ARID1A prugu na očekivane veličine 242 kDa i količini ARID1A proteina nazočnog dalje mjereno densitometrijom. Skladu s kvantitativnim realnom vremenu PCR rezultate, smanjenje ekspresije ARID1A je kod 13 (52%) od tumorskih tkiva želuca u usporedbi s podudarnim susjednim ne-tumorskih tkiva ( P pregled = 0,0015, slika 2A i slika 2B). Isto tako, izraz ARID1A proteina značajno je smanjen u želučanim staničnim linijama karcinoma, SGC7901, AGS, posebno u MGC803, u usporedbi s normalnom staničnom linijom želučane GES1 (Slika 2C). Pregled

imunohistokemijska analiza ARID1A izražavanja u rak želuca Tissue uzorci i njegov odnos sa kliničkopatološkim parametrima pregled

Kako bi se dodatno istražiti kliničkopatološka i prognostičkih uloge ARID1A izražavanja, proveli smo imunohistokemijske analize od 224 parafin-ugrađen raka želuca tkiva blokova. Sveukupno, 115 224 (51,3%) slučajeva pokazuje negativan ekspresiju ARID1A u kanceroznim tkivima (Slika 3b), dok je 109 (48,7%) slučajeva pokazao pozitivnu imunobojanja (slika 3C &D). Normalno želučana sluznica pokazala najjači ARID1A pozitivno bojanje (Slika 3A). U korelacije između ekspresije ARID1A i raznih kliničkopatološkim parametri navedeni su u tablici 1. Podaci su pokazali da je gubitak ARID1A izražavanja je značajno korelira s dubinom od tumora infiltracije (T pozornici, P pregled = 0,001) i tumora ocjena ( P pregled = 0,006), ali ne s dobi, spolu, veličini tumora, udaljenim metastazama (M stage) i tumora lokusa ili lokalne metastaze limfnih čvorova (N fazi). pregled

Expression od ARID1A i klinički ishod

5-petogodišnje preživljavanje u bolesnika s pozitivnom i negativnom ARID1A izraza su 68,8% i 52,2%, respektivno. Ukupni preživljavanje bolesnika s negativnim izrazom ARID1A bio je znatno lošija od ARID1A-pozitivnih bolesnika ( P pregled = 0,003, log-rank test, Slika 4). Jednosmjerna Cox regresijska analiza pokazala je da je dubina tumora infiltracije, lokalna limfnih čvorova metastaza, udaljenim metastazama, veličini tumora i ARID1A izraza su značajno povezane s ukupno preživljavanje (Tablica 2). Nadalje, multivarijatna Cox regresijska analiza potvrdila dubinu tumora infiltracije, lokalna limfnih čvorova metastaza, udaljenim metastazama i ARID1A izražavanja kao nezavisni prediktori ukupnom preživljavanju bolesnika s rakom želuca (Tablica 2). Pregled

Uloga ARID1A pregled u proliferaciju stanica i Colony formacije u MGC803 i GES1 staničnim linijama

Da bi se procijenio učinak ARID1A pregled na proliferaciju stanica, ARID1A pregled vektor ekspresije i kontrolu vektor su pojedinačno transfektirani u MGC803 stanice. ARID1A pregled ekspresija u transfektirane stanice su detektirana pomoću Western blot (Slika 5A). Je test rasta stanica pokazuje da je stopa staničnog rasta u ARID1A pregled -transfected želučanih stanice raka su značajno niže nego kontrolne želuca stanica raka vektor transfektirane (Slika 5c). U međuvremenu, učinkovitost formiranja kolonija bila je značajno ( P pregled = 0,0379) inhibirana u ARID1A pregled -transfected želučane stanice raka u usporedbi s kontrolnim želučanih stanica raka vektorske transfektirane (Slika 5D). Kako bi se dodatno potvrditi proliferacija suzbijanje funkciju ARID1A Netlogu, utišao se ARID1A pregled izraz u GES1 stanične linije s siRNA. ARID1A pregled ekspresija u inficiranim stanicama su detektirani pomoću Western blot (slika 5B). Otkrili smo da utišavanje ekspresije ARID1A pregled u GES1 znatno poboljšana proliferacija stanica u usporedbi s lažnom siRNA liječenja (Slika 5E). pregled

Rasprava pregled

Unatoč velikom napretku u dijagnostici i terapije, rak želuca ostaje jedan od najsmrtonosnijih neoplazme, s lošom prognozom nakon radikalne gastrektomije [14], [15]. Klinički ishod karcinoma želuca određuje niz svojstava tumora, kao što su lokoregionalnoj anes rast tumora, invaziju diferencijaciji stupnja, angiogeneze, udaljenim metastazama i napredovanja staničnog ciklusa, koji su regulirani pomoću različitih srodnih gena, uključujući onkogena i tumor supresor gena. Stoga, identifikacija želučanih biomarkera raka specifične sudjeluju u tim postupcima je vrlo važno za dijagnozu, liječenje i prognozu predviđanja u klinici. Pregled

ARID1A pregled, novootkrivena supresorski gen tumor koji kodira član od SWI /SNF kompleksa, ima visoku učestalost mutacije za rak mokraćnog mjehura, maternice endometrioid karcinom, endometrioid jajnika i karcinoma jasno stanica [11] - [13], [16], [17]. U karcinoma jajnika jasan stanica, to je izvijestio da je ARID1A pregled mutacijom značajno je povezana s ARID1A imunoreaktivnost [18]. Nedavno, exome sekvencioniranje studija otkrila je da ARID1A pregled je također često mutirani u rakom želuca [19], [23]. Međutim, do sada izrazu, klinički značaj i bioloških funkcija ARID1A pregled kod raka želuca nisu istraženi. Dakle, procijenili smo ekspresiju ARID1A Netlogu karcinoma želuca u realnom vremenu PCR, zapadnoj upijajući i imunohistokemijski, pored svoje kliničkopatološkim i prognostičkog značenja u velikom ljudskom uzorku. Nadalje, korištenjem u modelu vitro staničnoj, također istraživali tumor supresorski ulogu ARID1A pregled u želučanim stanicama u detaljima. Pregled

U trenutnoj studiji, pokazali smo da ARID1A pregled izražena na razini nižoj mRNA i proteina razini želučanih tkiva raka nego odgovarajuće ne-kancerogen sluznicu. U dogovoru s tih molekularnih bioloških otkrića, immunohisto- kemije s anti-ARID1A antitijela pokazao da ARID1A pregled bio potpuno utihnuli u 115 od ukupno 224 pacijenata uzoraka s rakom želuca, s pozitivnim izražavanja u još 109 pacijenata. Naše opažanje je u skladu s nizom studije koje pokazuju da je ARID1A pregled izraz često se izgubljena ili smanjena u brojnim tkivima oboljelih od raka i stanične linije, kao što su rak dojke, maternice endometrioid karcinom, jajnika jasan stanice i endometrioid karcinoma [13,18,20, i 21]. pregled

Do sada, uzroci ARID1A pregled utišavanje nisu u potpunosti razjašnjeni. Postojeće studije usredotočiti na mutacije u ARID1A Netlogu, posebno u ginekoloških karcinoma. To je izvijestio da je glupost ili indel mutacija ARID1A Netlogu povezana sa gubitkom ili smanjenjem ekspresije proteina u maternice endometrioid karcinom, jajnika endometrioid karcinoma i karcinoma jasno stanica [11] - [13], [18]. U integriranom genomske istrage, Mamo i sur pregled. samo pronašao jedan skraćeni mutaciju ARID1A pregled u stanice raka linije T47D dojke, bez mutacije u uzorcima karcinoma dojke 11 koji su pokazali DNA kopiju gubitak broj na 1p36.11 lokusa u susjedstvu ARID1A
[22]. Osam od devet uzoraka s DNK kopija gubitak broj na 1p36.11 također imaju nisku ekspresiju ARID1A proteina, što ukazuje na podudarnost između DNK kopija gubitak broja i ARID1A pregled inaktivacije. U exome sekvenciranja studiji Wang i sur pregled., Pronađen je ukupno 46 mutacija u 32 od 109 (29%) uzoraka s rakom želuca, s 39 (85%) okrnjenog mutacija [19]. Dvadeset i četiri (75%) od 32 uzoraka s rakom želuca s ARID1A pregled mutacije pokazuju ni gubitak ili bitno smanjene ekspresije proteina u odnosu na one bez ARID1A
mutacije. S druge strane, postoje samo šest želučani uzoraka raka koje pokazuju odsutan ili slab ekspresije proteina u odsutnosti može detektirati ARID1A
mutacije, što sugerira da drugi mehanizmi mogu doprinijeti ARID1A pregled inaktivacije. Nedavno je još jedan exome sekvenciranje istraživanje Zang i sur pregled. Također je pokazao ARID1A pregled mutacije u 8% uzoraka želuca, od kojih je 75% izgubljenih ili smanjene ekspresije proteina [23]. Što je još zanimljivije, oba istraživanja pokazala veći ARID1A pregled promjene u uzorcima s mikrosatelitne nestabilnosti (MSI) od onih sa stabilnošću mikrosatelitne (MSS) želučanog karcinoma. Osim toga, mutacija spektar ARID1A Netlogu se razlikuje između dviju genetskih tipova karcinoma želuca, kod većine indels u vrsti MSI i više varijacija jednog neucliotide u vrsti MSS. MSI je definiran kao indel mutacija unutar nukleotidnih ponavljanja (poznat kao mikrosatelitni regijama) je rezultat sparenih baza za popravak genske inaktivacije izazvanog replikacije pogrešaka [24]. Predložen kao inicirajuĘih genomske događajima karcinoma želuca, MSI često dovodi do nakupljanja dodatnih rakom genetskih nestabilnosti, kao što su alelne gubitke i frameshift mutacijom gena koji su uključeni u regulaciji stanične proliferacije, apoptozu i popravak DNA. To je izvijestio da je MSI javlja u 25% do 50% sporadičnih karcinoma želuca, definiranje jedinstvenog genetskog tipa bolest s različitim kliničkopatološkim značajkama [24]. U studiji Wang i sur pregled., Stopa indel mutacija (78%) ARID1A pregled u MSI raka želuca je usporediva s onom TGFBR2 pregled u MSI debelog crijeva rak, dobro uspostavljen i funkcionalno potvrđene gen vozač inaktivira MSI [25]. Ovi podaci ukazuju na to da je mutacija ARID1A pregled zajedno s MSI može igrati važnu ulogu u želučanom karcinogeneze. Dakle, odnos između ARID1A pregled izmjena i MSI status kod raka želuca, kao i njegove kliničkopatološkim značaja, potrebno dodatno istražiti u budućim istraživanjima. Pregled

U studiji Wang et dr. pregled, izraz ARID1A pregled otkrivena je samo u uzorku malog presjeka (32 slučajeva), i nije bilo daljnjeg istraživanja njegovog kliničkog značaja [19]. Ovdje, u većem želuca stanovništva protiv raka (224 slučajeva), otkrili smo da je gubitak ARID1A pregled, izraz značajno je povezana s višim T stadij raka želuca, što znači da je odsutnost ARID1A pregled ekspresija može promicati rast tumora i invaziju. Osim toga, otkrili smo nižu ARID1A imunoreaktivnost u slabo diferenciranim želučanog tkiva raka nego u dobro diferenciranim one, što sugerira da je smanjen ARID1A pregled izraz može igrati ulogu u tumora de-diferencijacije. U skladu s našim saznanjima, druge Istraživači su također otkrili da je smanjen ARID1A pregled, izraz značajno je povezana s višim stupnjem raka dojke [22], kao i viši FIGO stadiju u karcinoma jajnika jasan stanica [21]. ARID1A potiče stvaranje BRG1 ili BRM-sadržane SWI /zbrinjavanju ING modeliranjem kromatina kompleksa, koji su neophodni za uhićenje normalnog staničnog ciklusa [9], [26]. Pregled

A Kaplan-Meier analiza preživljavanja pokazala značajnu korelaciju između gubitak ARID1A pregled izražavanja i lošiji klinički ishod pacijenata s rakom želuca nakon radikalne operacije. Cox omjer rizika regresijske analize nadalje pokazala da je ARID1A pregled razina ekspresije je neovisan čimbenik rizika za opstanak, što ukazuje da se može poslužiti kao vrijedan prognostičkim biomarkera za pacijente s rakom želuca nakon operacije i potencijalna meta za gensku terapiju u liječenje raka želuca. U karcinoma jajnika jasan stanica, također je izvijestio da pacijenti s pozitivnim ARID1A pregled izražavanja imali su bolje preživljavanje bez progresije bolesti od onih s negativnim ARID1A pregled izraz [21]. Štoviše, gubitak ARID1A pregled izraza je povezan s kemijska otpornost na karcinoma jajnika jasan stanica, koja je također povezana s lošom prognozom raka. Ovi podaci ukazuju na to da ARID1A pregled izraz i mutacija pregled može biti korisna za vođenje kliničkog upravljanja. Uzeti zajedno, naša zapažanja da je gubitak ARID1A pregled izraz u raka želuca je povezana s više malignih fenotipova i lošije prognoze upućuju na to da on može igrati tumor supresorski ulogu u želučanom karcinogeneze. Pregled

dodatno istražiti funkcionalnu ulogu ARID1A Netlogu u staničnim linijama želuca. Vraćanje ARID1A pregled izraz u želučanim stanicama raka značajno inhibira proliferaciju stanica i formiranje kolonija. Utišavanje ekspresije ARID1A pregled u želučanim epitelnim stanicama znatno poboljšane stope rasta stanica. Ovi rezultati pokazuju da ARID1A pregled može igrati uvoz ulogu u inhibiciji rasta tumorskih stanica. Nedavno, funkcionalni testovi ARID1A Netlogu u želučanom staničnim linijama karcinoma strane Zang i sur pregled. predložio da ARID1A
napregnuti tumor-supresorski aktivnost [23]. Guan i sur pregled. pokazali su da obnove ekspresiju divljeg tipa ARID1A pregled dovoljna za suzbijanje proliferacije i tumorigenecity -tnora s humanog karcinoma jajnika stanične linije nose ARID1A
mutacije, a RNA smetnji posredovanih ARID1A pregled utišavanje pojačava staničnu proliferaciju i torn smjeru u dva ne transformira ljudskim epitelnim stanicama jajnika, IOSE-80PC i OSE4 [27]. Ovi podaci, zajedno s našima, ukazuju na to da gubitak ARID1A pregled može igrati važnu ulogu u procesu karcinogeneze. Pregled

Na kraju, mi smo pokazali gubitak ARID1A
ekspresija u karcinomu želuca i korelirana s više maligni fenotip i lošijom prognozom u velikom broju kliničkih uzoraka. Osim toga, pokazalo se da je ARID1A pregled može inhibirati rast tumorskih stanica i nastanak kolonija in vitro. Koliko je nama poznato, podaci generirani u studiji predstavlja prvo izvješće correlating prisutnost ARID1A Netlogu s kliničkopatološkim karakteristikama i ukupno preživljenje pacijenata s rakom želuca. Zajedno s rezultatima Wang i sur. Netlogu i Zang i sur pregled. [19], [23], što dodatno potvrdio da ARID1A pregled može poslužiti kao sredstvo za suzbijanje tumora kandidat i prognostički biomarkera u želučanom karcinogeneze. Pregled

materijali i postupci

Etika Izjava pregled

istraživanje je odobrilo Etičko povjerenstvo Sun Yat-sen University Cancer Center i pismeni informirani pristanak dobiven je od svakog pacijenta koji su uključeni u studiju. pregled

stanične linije i uvjeti uzgoja

želučanog raka stanične linije, SGC7901, AGS, MGC803, a želučani epitela sluznica stanične linije GES1 dobiveni su od odbora Type Culture Collection kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina). Stanična linije su uzgojene u RPMI 1640 mediju za uporabu s 10% fetalnog goveđeg seruma toplinski neaktivan (FBS). Stanice se inkubiraju na 37 ° C u vlažnoj komori koja sadrži 5% CO _{2. Pregled}

Human Tissue Uzorak s

Ukupno 66 paru kancerogeni i nađeno susjedne noncancerous želučane sluznice tkiva prikupljeni su od pacijenata s rakom želuca prolaze gastrektomije na Sun Yat-sen University Cancer Center između 2009. i 2011. godine, a dijagnoza je potvrđena patološkog pregleda. 25 uparen kancerogeni odgovarajuće susjedne nekancerozno želučane sluznice tkiva koriste za otkrivanje ekspresije ARID1A proteina u western blotting odabrano 66 upareni uzorcima. Nakon kirurške resekcije, svježe tkiva su uronjeni u odmah RNAlater (Ambion, Inc., USA) da bi se izbjegla razgradnja RNA, pohranjeno na 4 ° C preko noći kako bi se omogućilo prodiranje temeljito RNAlater u tkivu i zatim zamrznute na -80 ° C do RNA ekstrakcija proteina se izvodi. Još 224 primarni uzorci karcinom želuca parafin uklopljenih koje su prikupljene u razdoblju od 2003. do 2005. godine, dobiveni su iz Sun Yat-sen University Cancer Center. Nijedan od ovih bolesnika nije primio radioterapiju ili kemoterapiju prije operacijskog zahvata. Follow-up podataka od pacijenata s rakom želuca u ovoj studiji su dostupni i potpuni. Postoperativni follow-up dogodila u našoj ambulanta i uključiti kliničke i laboratorijske preglede svaka 3 mjeseca za prve 2 godine, svakih 6 mjeseci tijekom treće do pete godine, svake godine za dodatnih 5 godina ili do smrti pacijenta, koje je prvo dogodile. Histopatološko tip i stadij raka želuca određuje se prema kriterijima klasifikacije Svjetske zdravstvene organizacije i TNM fazi postavljen od strane Europske unije za međunarodnu kontrolu raka. Pregled

Ekstrakcija ukupne RNA i real-time PCR Kvantitativni pregled

Ukupna RNA je ekstrahirana korištenjem Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) prema uputama proizvođača. Ukupna koncentracija RNA je procijenjena mjerenjem apsorbancije pri 260 nm upotrebom spektrofotometra (NANO DROP ND-1000, Thermo Scientific, USA). Reverzna transkripcija (RT) za sintezu prvog lanca cDNA izvedena je s 2 ug ukupne RNA tretiranog s M-MLV reverzne transkriptaze (Promega, SAD), prema preporukama proizvođača. Dobivena cDNA je zatim podvrgnut realnom vremenu kvantitativnog PCR za procjenu relativne mRNA od ARID1A pregled i GAPDH pregled (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, kao interna kontrola) sa sljedeći primera: ARID1A
naprijed: 5'-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ', i obrnuto: 5'-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3'; GAPDH
naprijed: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', i obrnuto: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. Gen-specifična amplifikacija je provedena primjenom ABI 7900HT real-time PCR sustavu (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) sa 15 ul PCR smjese koja sadrži 0,5 ul cDNA, 7,5! JI 2 x SYBR Green glavne smjese (Invitrogen, Carlsbad , California, USA), i 200 nM odgovarajućih oligonukleotididnih primera. Mješavina zagrije na 95 ° C (10 min), a zatim pojačan na 95 ° C (30 sekundi) i 60 ° C (1 minuta) za 45 ciklusa. Krivulja rezolucija je mjerena na 95 ° C 15 s, 60 ° C tijekom 15 sekundi i 95 ° C tijekom 15 sekundi. CT (prag ciklusa) vrijednosti svakog uzorka je izračunata s praga ciklusa s softveru instrumenta (SDS 2.3), i relativna ekspresija ARID1A pregled mRNA je normalizirana na GAPDH
vrijednosti , Podaci su analizirani primjenom usporedne prag ciklusa (2 ^{-ΔCT) metoda.}

Western blot-analiza pregled

uzoraka homogenizirane rak želuca, uključujući tumor i nontumor tkiva, kao i stanične linije , liziran je u RIPA puferu za liziranje, a lizati su skupljene centrifugiranjem (12.000 okretaja u minuti) na 4 ° C tijekom 30 minuta. Približno 50 J..lg proteina uzorci su zatim razdvojeni elektroforezom u 12% natrij dodecil sulfata poliakrilamidnom gelu i prenesen na poliviniliden fluorida membranu. Nakon blokiranja nespecifična mjesta za vezanje 60 min sa 5% bezmasnim mlijekom, membrane se inkubiraju preko noći na 4 ° C s mišjim monoklonskim protutijelom protiv ARID1A (Abgent Primarna antitijela Company, SAD, na 1:1000 razrjeđenje) , Membrane su zatim isprane tri puta s TBST (tris-puferiranoj otopini soli s Tween-20) tijekom 10 minuta i ispitana sa peroksidazom hrena (HRP), koje je konjugirano zečji anti IgG antitijela (Immunology konzultanata Laboratory, SAD, na 1: 2000 razrjeđenje) na 37 ° C kroz 1 sat. Nakon tri ispiranja, membrane su razvijeni od strane hemiluminiscencija sustava (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Intenzitet Bend je mjerena densitometrij pomoću softvera Količina One (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). Razine proteina su normalizirani na onom GAPDH otkriti pomoću miša anti-humani GAPDH monoklonalno antitijelo (Shanghai Kangchen, Kina, na 1:10000 razrjeđenje). Pregled

Imunohistokem Analiza pregled

sekcije tkiva deparafmizirani s dimetilbenzen i rehidrirane 100%, 95%, 90%, 80% i 70% etanola. Nakon tri ispiranja u PBS (fosfat-buferirana otopina soli), stakalca su kuhani u antigena dohvat puferu koji je sadržavao 0,01 M natrijev citrat-solnom kiselinom (pH = 6,0), tijekom 15 min u mikrovalnoj pećnici. Nakon ispiranja s PBS, sekcije tkiva su inkubirani s primarnim antitijelom te su stakalca tada ispere 3% otopine peroksidaza gašenje (Invitrogen) kako bi se blokirala unutarnja peroksidaza. Sekcije su zatim inkubirane s mišjim monoklonskim protutijelom protiv ARID1A (Abgent primarnog antitijela Company, SAD, na 1:300 razrjeđenja) na 4 ° C preko noći i potom inkubiraju s peroksidazom iz hrena (HRP) (DAKO ChemMateTM EnVisionTM Detection Kit) pri sobnoj temperatura se 30 minuta. Nakon ispiranja u PBS, vizualizacija signal je razvijen s 3, 3'-diaminobenzidin (DAB) otopini i sve slajdove su prebrojane s hematoksilinom. Kao negativne kontrole, susjedne sekcije su obrađeni kako je gore opisano, osim što su inkubirani preko noći na 4 ° C u blokirajućoj otopini bez primarnog antitijela, pregled

Ukupno ARID1A imunološko rezultat je izračunata kao zbroj posto pozitivno mrlje od tumorske stanice i intenzitet bojenja. Ukratko, postotak pozitivnim bojanjem ocijenjena je kao 0 (0-9%, negativan), 1 (10% -25%, sporadično), 2 (26% -50%, žarišna) ili 3 (51% -100% difuzno), a intenzitet kao 0 (nema bojenje), 1 (slabo obojenje), 2 (umjereno bojenje) i 3 (tamno bojanje). Ukupna ocjena imunološko je izračunata s vrijednošću posto pozitivnost rezultatom × ocjena intenziteta bojenja, koja se kretala od 0 do 9. razina ekspresije ARID1A je definirana kako slijedi: "-" (negativan rezultat 0), "+" (slabije pozitivni, rezultat 1-3), "++" (pozitivni, rezultat 4-6), "+++" (jako pozitivni, rezultat 7-9). Na temelju razine ARID1A ekspresije, pacijenti s rakom želuca su bili podijeljeni u dvije skupine:. Negativna ARID1A izraz skupina (ARID1A-) i pozitivne ARID1A izraz skupina (ARID1A +, ARID1A ++ ili ARID1A +++) pregled

plazmida ekspresije i prolaznih transfekcija

A eukariotskim plazmida ekspresije pCMV6-Entry sadrži pune dužine humanog ARID1A pregled cDNA dobivena iz Asbio Technology Company (Guangzhou, Kina). Prazan vektor je korišten kao negativna kontrola. MGC803 uzgajane su u ploče sa 6 jažica dok ne postigne 85-90% konfluentnosti i nakon toga transfekcije provedene su pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, ekspresija gena je ispitan pomoću Western blotting analizama. A onda, stanična proliferacija i formiranje kolonija su izvedeni. Pregled

RNA nukleotida i Transfekcija stanica

Za obaranje ARID1A pregled izraz, a siRNA su sintetizirani GenePharma Company (Shanghai, Kina). SiRNA sekvence su kako slijedi: siRNA- ARID1A pregled, osjećaj: 5'GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 ', negativna: 5'AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3'. Negativna kontrola (NC), osjećaj: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 ', negativna: 5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3'. 400 pmol siRNA- ARID1A pregled ili NC klonovi ubačeni u 2 × 10 ^{5 GES1 stanice korištenjem Lipofektaminje RNAi MAX reagens (Invitrogen, USA) u skladu s uputama proizvođača. Nakon toga, onda je izvedena stanična proliferacija. Pregled}

proliferacije pregled

stopa rasta ćelija MGC803 ili GES1 stanica je otkrivena od strane MTS proliferacije stanica. Stanice su nasađene na ploču s 96 jažica u gustoći od 5 × 10 ^{2 stanica po bazenčiću. Brzina rasta stanica je određeno primjenom proliferaciju MTS kompleta prema uputama proizvođača (Promega, SAD). Svaki pokus je proveden u tri primjerka. Pregled}

Kolonija Formiranje Test pregled

Za testom formiranja kolonije, ARID1A pregled -eksprimirajući MGC803 stanice ili kontrolu MGC803 stanice su stavljene u 6-dobro ploča kod gustoće od 5 × 10 ^{2 stanica po bazenčiću. Nakon 10 dana uzgoja, preživjelih kolonija (pri 50 stanica po kolonija) su izbrojani s kristalnim ljubičastim (0,5%) obojenja. Učinkovitost stvarale koloniju (CFE%) je definiran kao omjer broja kolonija formirana u kulturi na broj stanica inokulirane. Pokus je učinjeno u tri primjerka. Pregled}

Statistička analiza pregled

Razlike u mRNA i proteina između tumorskih uzoraka i uparenim uzoraka tkiva susjednih ne-tumorske ocijenjeni su s uparenim-uzoraka t-test. Χ ^{2 test je korišten za analizu odnosa između izražavanja ARID1A i razne kliničkopatološkim parametrima. Krivulje preživljavanja izračunate su pomoću Kaplan-Meier metodi i usporediti je log-rank testa. Coxova razmjerna opasnosti regresijski model je korišten za univarijantna i multivarijatne analize proučavati učinke kliničkopatološkim varijabli i ARID1A izražavanja na preživljavanje. Dvosmjernog Nespareni Student t pregled test korišten je za procjenu razlike u brzini rasta stanica i formiranja kolonija. Statističke analize su provedene sa statističkog paketa za društvene znanosti, verzija 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), a obostrani se smatra P pregled vrijednost manja od 0,05 do statistički značajna. pregled}

• PLoS ONE: divergentno trendovi u posljednjih nekoliko tipu stanovništva Stope preživljavanja u ezofagealni i rak želuca
• PLoS ONE: Identifikacija HSA-Mir-335 kao prognostički Potpis na rak želuca