PLoS ONE: sumažėjęs išraiška ARID1A genas yra siejamas su prastomis prognoze pirminis navikas

Anotacija

Fonas

ARID1A
genas koduoja adenino-Timinas (AT) -rich interaktyvų baltymų 1A domeno, kurių sudėtyje yra, kuri dalyvauja chromatino rekonstruoti. ARID1A
buvo parodė, kad veiktų kaip naviko slopintuvas įvairių vėžio rūšių. Atsižvelgiant į dabartinę tyrime mes tyrė išraiška ir prognozavimo vertę ARID1A
pirminės skrandžio vėžio. Tuo tarpu, biologinis vaidmuo ARID1A
toliau buvo tiriami naudojant mobilųjį modelį in vitro.

Metodologija /Pagrindinės išvados

Jei ištirti vaidmenį, ARID1A
genų pirminėje skrandžio vėžio patogenezės, realaus laiko kiekybine PGR ir imunoblotingu buvo naudojami išnagrinėti ARID1A
išraišką suporuotas vėžinių ir noncancerous audiniuose. Rezultatai parodė, sumažėjo ARID1A
iRNR ( P
= 0,0029) ir baltymų ( P
= 0,0015) išraiška daugeliu naviko guolio audinių palyginti su suderintos gretimame ne auglys audiniai, ir skrandžio vėžio ląstelių linijų. Toliau tirti klinikos ir prognostinius vaidmenis ARID1A
išraiška, mes atliekame imunohistocheminis analizuoja iš 224 parafino įterptųjų skrandžio vėžio audinių blokus. Duomenys parodė, kad ARID1A
išraiška nuostoliai reikšmingai koreliavo su T etape ( P
= 0,001) bei klasės ( P
= 0,006). Suderinamas su šiais rezultatais, mes nustatėme, kad ARID1A
išraiška reikšmingai koreliavo su prasta išlikimo skrandžio vėžiu sergančių pacientų ( P
= 0,003) nuostolių. Cox regresijos analizė parodė, kad ARID1A
išraiška buvo nepriklausoma prognozuoti bendrojo išgyvenamumo ( P
= 0,029). Be to, iš funkcijos ARID1A
į platinimo ir kolonijos formavimo skrandžio ląstelių linijų buvo analizuojami transfekuoja ląsteles pilnametražis ARID1A
ekspresijos vektorius arba siRNR orientacija ARID1A
, Atkūrimas ARID1A
išraiška skrandžio vėžio ląsteles žymiai slopinamas ląstelių proliferacija ir kolonija formavimas. Triukšmo slopinimo ARID1A
išraiška skrandžio epitelio ląstelių linijos gerokai padidinti ląstelių augimo greitį.

Išvados /Reikšmė

Mūsų duomenys rodo, kad ARID1A
gali atlikti svarbų vaidmuo skrandžio vėžio ir gali tarnauti kaip vertingą prognostinį persekiotoją ir galimo tikslo genų terapija skrandžio vėžiui gydyti

nurodomoji dalis:. Wangas dd, Chen, Yb, visos K Wang W Chen Sp Chen Jg , ir kt., (2012) Sumažėjęs išraiška ARID1A
genas yra siejamas su prastomis prognoze pirminis navikas. PLoS vieną iš 7 (7): e40364. Doi: 10,1371 /journal.pone.0040364

redaktorius: Patrickas Tan kunigaikštis-Singapūro nacionalinio universiteto Graduate medicinos mokyklos, Singapūras

Įstojo: sausio 19, 2012; Priėmė: Gegužės 6, 2012 m Paskelbta: Lie 13, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Dandan et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (30973398) ir Guangdong gamtos mokslo fondo (925.100.890). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia piktybinių navikų visame pasaulyje ir antra dažniausia vėžio mirčių kiekvienais metais (10,4% mirčių nuo vėžio) [1]. Gydyti skrandžio vėžio apima chirurgija, chemoterapija, arba spindulinės terapijos derinys. Tačiau, beveik 60% iš pacientų, sergančių pasiduoti skrandžio vėžio net po to, kai tik, gydomojo rezekcija arba po to, kai adjuvantiniam gydymui, [2]. Jau seniai žinoma, kad skrandžio vėžys atsiranda dėl aplinkos veiksnių ir bendrųjų ir specifinių genetinių pakitimų kaupimosi. Daugelis genetinių ar epigenetinių pokyčių, susijusių su skrandžio vėžiu, įskaitant negautą heterozigotiškumu, mikrosatelitiniai ir chromosomų nestabilumo ir hypermethylation, buvo pranešta [3]. Suprasti šiuos pakeitimus ir molekulinius mechanizmus, skrandžio kancerogenezėje bus lemtingi diagnozės, gydymo ir prognozės prognozuojant šios ligos tobulinti.

eukaryotically užkonservuoti SWI /PBK chromatino-remodeling kompleksas vaidina pagrindinius vaidmenis veislės ląstelinių procesų, įskaitant diferenciacijos, platinimo ir DNR reparacijos [4]. Praradimas SWI /PBK padaliniuose buvo pranešta dauguma navikų, ir daug eksperimentinių stebėjimų rodo, kad šis kompleksas yra labai svarbus naviko slopinimą [5]. Kompleksai yra sudaryti iš septynių ar daugiau noncatalytic subvienetus, kad matyt, padėti moduliuoti taikymą ir aktyvumą ATPazės [6]. Vienas dalinys šio komplekso, hSNF5 /Ini1 /BAF47, buvo nustatyta, kad auglio slopinamojo [7], [8]. Kitas noncatalytic subvieneto, P270 /ARID1A /BAF250a (adenino-timiną turtingas interaktyvus domenų, kurių sudėtyje yra baltymų 1A), buvo įrodyta, kad svarbu normaliam ląstelių ciklo areštas [9]. Nokdaunas iš ARID1A
į leukemijos ląstelių linijos suteikia atsparumą Fas sąlygojamą apoptozės [10].

Neseniai ARID1A
mutacijų ir praradimo BAF250a baltymų buvo nustatyta, kad koreliuoja stipriai su kiaušidžių aišku ląstelių karcinoma ir gimdos žemos kokybės endometrioid karcinoma [11] - [13]. Šios pastabos rodo, kad ARID1A
yra potencialus kandidatas į naviko slopintuvas genų. Tačiau klinikinė reikšmė tokia diferencinė ekspresija o ARID1A baltymų funkcija lieka neapibrėžta dėl tyrimų, naudojant šviežią žmogaus navikų mėginiuose trūkumo. Šiame tyrime mes analizuojami ARID1A
išraiška lygį skrandžio vėžio naudojant realaus laiko kiekybine PGR, Imunoblotingo ir imunohistocheminis. Tuo tarpu, mes nustatyti tarp ARID1A
saviraiškos ir klinikos ypatybių santykį ir įvertinti savo prognostinę vertę po rezekcija išlikimo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Be to, mes įvertino funkcinį vaidmenį ARID1A
pirminės skrandžio vėžio Tumorigenesis nagrinėjant in vitro platinimo ir kolonijų susidarymą skrandžio ląstelių linijų.

Rezultatai

ARID1A
iRNR raiška analizuojama realaus laiko kiekybine AT-PGR

iRNR lygį, ARID1A
nulėmė realaus laiko kiekybine AT-PGR 66 suporuotas vėžinėmis ir suderintus gretimuose normaliuose skrandžio gleivinės audiniuose. ARID1A
išraiška lygis buvo gerokai mažesnis 43 (65.15%) naviko guolio audinių, palyginti su gretimų ne navikų audiniuose ( P
= 0,0029, 1 pav.)

ARID1A baltymo ekspresija analizuojami Imunoblotingo

imunoblotingu buvo atlikta 25 skrandžio vėžiu egzempliorių ir atitinkantis gretimų nevėžinės skrandžio gleivinės audinius nuo 66 suporuotų pavyzdžius. Rezultatai parodė, ARID1A juosta numatytu dydžio 242 kDa ir ARID1A baltymų, esančių suma buvo toliau, išmatuotas densitometrija. Suderinamas su kiekybinių realaus laiko PGR rezultatus, A ARID1A išraiškos sumažėjimas buvo pastebėtas 13 (52%) iš skrandžio navikų audiniuose, palyginti su suderintų gretimų ne navikų audiniuose ( P
= 0,0015, 2A pav ir 2B pav.) Be to, ARID1A baltymo ekspresija buvo nepaprastai sumažėjo skrandžio vėžio ląstelių linijas, SGC7901, AGS, ypač MGC803, palyginti su įprastine skrandžio ląstelių linijos GES1 (2C pav.)

Imunohistocheminis analizė ARID1A išraiška skrandžio vėžio audinių Pavyzdžiai ir jos santykis su klinikos parametrų įvertinimas

Jei toliau tirti klinikos ir prognostinius vaidmenis ARID1A išraiška, mes atlikto Imunohistocheminiais analizuoja iš 224 parafino įterptųjų skrandžio vėžio audinių blokus. Apskritai, 115 224 (51,3%) atvejais parodė neigiamą ARID1A išraišką vėžinių audinių (3b pav), o 109 (48,7%) atvejai parodė teigiamą imunodažymu (3c pav & D). Normalus skrandžio gleivinė parodė stipriausia ARID1A teigiamą dažymo (3a pav.) Skirtumas tarp ARID1A ir įvairių klinikos parametrų išraiškos koreliacija yra išvardyti 1 lentelėje duomenys rodo, kad ARID1A išraiška nuostoliai reikšmingai koreliavo su gylio naviko infiltracijos (T etape P
= 0,001) ir naviko įvertinimas ( P
= 0,006), bet ne su amžiumi, lytimi, naviko dydį, tolimos metastazės (M stadijos) ir naviko lokuso arba vietinio limfmazgio metastazių (N etapas).

išraiška iš ARID1A ir klinikinės baigties pervežimas

5 metų bendras išgyvenamumas pacientams su teigiamais ir neigiamais ARID1A išraiška buvo 68,8% ir 52,2%, atitinkamai. Bendras išgyvenamumas pacientų neigiami ARID1A išraiška buvo žymiai blogesnė nei ARID1A-teigiamiems pacientams ( P
= 0,003, log-rank testas, 4 pav.) Vienmatės Cox regresijos analizė parodė, kad gylis naviko infiltracijos vietos limfmazgių metastazių, tolimos metastazės, naviko dydžio ir ARID1A išraiška buvo reikšmingai susijęs su bendro išgyvenamumo (2 lentelė). Be to, daugiamatis Cox regresinė analizė patvirtino naviko infiltracijos vietos limfmazgių metastazių, tolimos metastazės ir ARID1A išraiška nepriklausomi faktoriai bendro išgyvenimo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams Gylis (2 lentelė).

Iš vaidmuo ARID1A
į ląstelių proliferaciją ir Colony formavimo MGC803 ir GES1 ląstelių linijų

Jei įvertinti ARID1A
ant ląstelių proliferaciją, ARID1A
ekspresijos vektorius ir valdymo vektorius buvo atitinkamai transfekuota į MGC803 ląstelių. ARID1A
išraiška perkeltų ląstelių buvo aptikta Imunoblotingo (5a pav.) Ląstelių augimas tyrimas atskleidė, kad mobilieji augimo normą, ARID1A
-transfected skrandžio vėžio ląstelės buvo gerokai mažesnis nei kontrolinių užkrato perkeltų skrandžio vėžio ląstelių (5c pav). Tuo tarpu kolonijos formavimosi efektyvumas buvo reikšmingai ( P
= 0,0379) slopinamas ARID1A
-transfected skrandžio vėžio ląstelės, lyginant su kontrolinės užkrato perkeltų skrandžio vėžio ląstelių (5d pav). Siekiant dar labiau patvirtina platinimu slopinimo funkciją ARID1A
, mes nutildė ARID1A
išraiška GES1 ląstelių linijos su siRNA. ARID1A
išraiška perkeltų ląstelių buvo aptikta Imunoblotingo (5b pav.) Mes nustatėme, kad triukšmo slopinimo išraiškos ARID1A
GES1 gerokai padidinti ląstelių proliferacija, palyginti su maketas siRNA gydymo (5E pav.)

Diskusijos

nepaisant didžiulę pažangą diagnozė ir gydymas, skrandžio vėžys išlieka viena iš labiausiai mirtinų navikais, su sužaidė prognozei po radikalaus pašalintas skrandis [14], [15]. Klinikinis rezultatas skrandžio vėžiu lemia naviko charakteristikų, kaip antai locoregional naviko augimui ir invazijos, diferenciacijos laipsnio, angiogenezę, tolimos metastazės ir ląstelės ciklo progresavimo, kurie reglamentuoja susijusių genų įvairovė, įskaitant onkogenų ir naviko slopintuvas serijos genai. Todėl, identifikavimo skrandžio vėžio konkrečių biologinių žymenų, susijusių su šių procedūrų yra labai svarbus diagnostikos, gydymo ir prognozės prognozavimas klinikoje.

ARID1A
, naujai nustatyti naviko slopintuvas genų, kurie koduoja narys apie SDI /PBK komplekso, yra didelis mutacijų dažnį šlapimo pūslės vėžys, gimdos endometrioid karcinoma, kiaušidžių endometrioid ir aišku ląstelių karcinoma [11] - [13], [16], [17]. Kiaušidžių aiškiai ląstelių karcinoma, ji pranešė, kad ARID1A
mutacijos yra reikšmingai susijęs su ARID1A reaktyvumas [18]. Neseniai exome sekos tyrimas atskleidė, kad ARID1A
taip pat dažnai mutavo skrandžio vėžio [19], [23]. Tačiau iki šiol išraiškos, klinikinės reikšmės ir biologinių funkcijų, ARID1A
skrandžio vėžio nebuvo ištirta. Todėl mes įvertino ARID1A
išraišką skrandžio vėžio realaus laiko PGR, Imunoblotingo ir imunohistocheminiu, be to, jos klinikos ir prognozuojamų reikšmę didelei žmonių atranką. Be to, naudojant in vitro ląstelių modelio, mes taip pat tyrė auglio slopinamojo vaidmenį, ARID1A
skrandžio ląstelių išsamiai.

dabartinės tyrime mes parodė, kad ARID1A
buvo išreikštas tiek mažesnę iRNR ir baltymų lygį skrandžio vėžio audiniuose už atitinkamus nevėžinės gleivinę. Sutinka su šiais molekuliniais ir biologiniais duomenimis, immunohisto- chemija su Anti-ARID1A antikūnų parodė, kad ARID1A
buvo visiškai nutildė 115 iš 224 pacientų skrandžio vėžio mėginių su teigiamais išraiškos kitoje 109 pacientų. Mūsų pastebėjimas yra susitarusi su studijų apreikšti serijos, kad ARID1A
išraiška dažnai pametami arba sumažinta vėžio audinių ir ląstelių linijų, pavyzdžiui, krūties vėžio, gimdos endometrioid karcinoma, kiaušidžių aiškiai ląstelių ir endometrioid karcinoma skaičius [13,18,20 ir 21].

Iki šiol priežasčių, ARID1A
triukšmo slopinimo nebuvo visiškai aiški. Esami tyrimai sutelkti dėmesį mutacijų ARID1A
, ypač Ginekologinės vėžio. Ji pranešė, kad nesąmonė arba INDEL mutacija ARID1A
koreliavo su praradimo ar sumažinimo baltymų raiškos gimdos endometrioid karcinoma, kiaušidžių endometrioid karcinoma ir aišku ląstelių karcinoma [11] - [13], [18]. Integruotai genomo tyrimas, Mamo ir kt
. tik rasti vieną nukirst mutaciją, ARID1A
į T47D krūties vėžio ląstelių linijos, nė kiek nesumažinant 11 krūties vėžio mėginių, kurie parodė DNR kopijų skaičiaus nuostolius tuo 1p36.11 lokuso greta ARID1A
[22]. Aštuoni iš devynių mėginių DNR kopijų skaičiaus nuostoliai 1p36.11 taip pat turi mažai ARID1A baltymų raišką, rodo parengti atitikties tarp DNR kopijų skaičiaus praradimo ir ARID1A
nukenksminimą. Į exome sekos tyrimo Wang ir kt
., Iš 46 mutacijų iš viso buvo rasti 32 iš 109 (29%) skrandžio vėžys mėginių, 39 (85%) sutrumpintas mutacijų [19]. Dvidešimt keturios (75%) iš 32 skrandžio vėžiu mėginių ARID1A
mutacijos parodyti arba praradimą arba gerokai sumažintas baltymų raišką palyginti su tais, be ARID1A pervežimas mutacijos. Priešingai, yra tik 6 skrandžio vėžio mėginiai, rodantys nėra arba silpnas baltymo ekspresija aptinkamos ARID1A pervežimas mutacija, kuri rodo, kad kiti mechanizmai gali prisidėti prie ARID1A
nukenksminti nėra. Neseniai kitas exome sekos tyrimai iki Zang ir kt
. taip pat parodė, ARID1A
mutacijos 8% skrandžio mėginius, iš kurių prarastų ar sumažintas baltymų raišką [23] 75%. Dar įdomiau, abu tyrimai parodė didesnis, ARID1A
pakitimai skrandžio vėžio mėginių mikrosatelitiniai nestabilumo (MSI), nei su mikrosatelitiniai stabilumo (MSS). Be to, mutacija spektras ARID1A
skiriasi tarp dviejų genetinių tipų skrandžio vėžiu, su daugeliu indels į MSI tipą ir daugiau vieno neucliotide svyravimų MSS tipo. MSI apibrėžiamas kaip INDEL mutacijų per nukleotidų kartojasi (žinomas kaip mikrosatelitinių regionuose) lėmė DNR neatitikimo remontas genų nukenksminimo sukeltos replikacijos klaidų [24]. Siūloma kaip inicijuojantis genomo įvykių skrandžio vėžio MSI dažnai veda prie kaupimo papildomų vėžį susijusios genetinių nepastovumu, tokių kaip alelių nuostolių ir rėmelio mutacijų genuose dalyvaujančių ląstelių proliferaciją reguliavimas, apoptozės ir DNR remontas. Buvo pranešta, kad MSI įvyksta 25% iki 50% atsitiktinio skrandžio vėžio, apibrėžiant unikalų genetinį tipo liga su įvairių klinikos funkcijų [24]. Atsižvelgiant Wang studijos ir kt
., The INDEL mutacijos dažnis (78%) iš ARID1A
MSI skrandžio vėžys yra panašus į TGFBR2
MSI dvitaškis vėžys, nusistovėjęs ir funkciškai patvirtintas vairuotojas genas inaktyvuoja MSI [25]. Šie duomenys rodo, kad mutacija ARID1A
kartu su MSI gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio kancerogenezėje. Todėl tarp ARID1A
pakeitimus ir MSI statusą skrandžio vėžiu, taip pat jos klinikos reikšmę, santykiai turi tolesnį tyrimą būsimos mokslinių tyrimų.

Wang tyrimo ET al.,
, kad išraiška ARID1A
buvo aptiktas tik nedidelio dydžio imtį (32 atvejai), ir ten buvo ne toliau tirti jo klinikinės reikšmės [19]. Čia, didesnio skrandžio vėžio gyventojų (224 atvejų), mes nustatėme, kad ARID1A
išraiška reikšmingai koreliavo su didesniu T etape skrandžio vėžiu, o tai reiškia, kad nėra praradimas, ARID1A
išraiška gali skatinti navikų augimą ir invazija. Be to, mes nustatėme žemesnį ARID1A reaktyvumas prastai diferencijuotų skrandžio vėžio audiniuose nei gerai diferencijuotų tie, rodo, kad sumažėjo, ARID1A
išraiška gali vaidinti svarbų vaidmenį navikų de-diferenciacija. Atitinka Mūsų duomenimis, kiti tyrėjai taip pat nustatė, kad sumažėjo ARID1A
išraiška yra reikšmingai susijęs su aukštesnio lygio krūties vėžio [22], taip pat aukštesnio FIGO etape kiaušidžių aiškiai ląstelių karcinoma [21]. ARID1A skatina BRG1 arba BRM įmontuotu SWI /PBK chromatino remodeling kompleksų, kurie yra būtini normaliai ląstelės ciklo areštas [9] formavimą, [26].

Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė parodė reikšmingą koreliaciją tarp iš ARID1A
išraiška nuostoliai ir skurdesnių klinikinė rezultatas skrandžio vėžiu sergantiems pacientams po radikalaus veikimo. Coxas rizikos santykis regresijos analizės dar parodė, kad ARID1A
išraiška lygis buvo nepriklausoma rizikos veiksnys dėl išlikimo, o tai rodo, kad jis gali būti vertingas prognostinį biologinis žymuo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams po operacijos ir galimo tikslo genų terapija skrandžio vėžio gydymas. Kiaušidžių aiškiai ląstelių karcinoma, ji taip pat buvo pranešta, kad pacientams su teigiamais ARID1A
išraiška turėjo ilgesnį išgyvenimą be progresavimo nei neigiami, ARID1A
išraiška [21]. Be to, praradimas ARID1A
išraiška yra gerokai koreliuoja su Atsparumas cheminėms kiaušidžių aiškiai ląstelių karcinoma, kuri taip pat yra susijęs su prasta prognozė vėžio. Šie duomenys rodo, kad ARID1A
išraiška ir mutacijos tyrimas gali būti naudinga pagrindinis klinikinis valdymą. Kartu paėmus, mūsų pastebėjimai, kad ARID1A
išraiška skrandžio vėžio yra susijęs su daugiau piktybiniais fenotipų praradimas ir blogiau prognozė reiškia, kad jis gali vaidinti auglio slopinamojo vaidmenį skrandžio kancerogenezėje.

toliau nagrinėjo funkcinį vaidmenį ARID1A
skrandžio ląstelių linijų. Atkūrimas ARID1A
išraiška skrandžio vėžio ląsteles žymiai slopinamas ląstelių proliferacija ir kolonija formavimas. Triukšmo slopinimo išraiškos ARID1A
skrandžio epitelinių ląstelių žymiai pagerino mobiliojo augimo greitį. Šie nurodyti rezultatai, ARID1A
gali atlikti importo vaidmenį slopinant auglio ląstelių augimą. Neseniai funkciniai tyrimai yra ARID1A
skrandžio vėžio ląstelių linijas Zang ir kt
. teigė, kad ARID1A
daryti naviku slopinamąjį aktyvumą [23]. Guan ir kt
. parodė, kad atkurti laukinio tipo išraiška ARID1A
pakanka slopinti platinimu ir tumorigenecity iš audiniuose, žmogaus kiaušidžių vėžio ląstelių linijas slėpimas ARID1A
mutacijos, o RNR interferencija tarpininkaujant ARID1A
triukšmo slopinimo pagerina ląstelių proliferaciją ir tumorogeniš- dviem netransformuotos žmogaus kiaušidžių epitelinių ląstelių linijų, IOSE-80PC ir OSE4 [27]. Šie duomenys, kartu su mūsų, rodo, kad nuostoliai ARID1A
gali vaidinti svarbų vaidmenį kancerogenezėje procese.

Taigi, mes parodėme, kad nuostolių, ARID1A
raiška skrandžio vėžiu ir jo koreliacija su daugiau piktybinės fenotipo ir prastesne prognoze daug klinikinių mėginių. Be to, mes įrodė, kad ARID1A
gali slopinti auglio ląstelių augimą ir kolonijų susidarymą in vitro. Kiek mums žinoma, sukaupti dabartinės studijų atstovauti pirmąją ataskaitą Susijusios su ARID1A
buvimas su klinikos ypatybes ir bendrą išgyvenamumą skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Kartu su Wang ir kt.
Ir Zang rezultatus, ir kt
. [19], [23], mes dar kartą patvirtino, kad ARID1A
gali tarnauti kaip kandidatas naviko slopintuvas ir prognozuojamų biologinis į skrandžio kancerogenezėje.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

tyrimai buvo patvirtintas etikos komiteto Sun Yat-sen universiteto Cancer Center, ir raštu informuoti sutikimas buvo gautas iš kiekvieno paciento tyrime dalyvavusių.

Mobilaus ryšio linijos ir kultūra sąlygos

skrandžio vėžio ląstelių linijas, SGC7901, AGS, MGC803 ir skrandžio epitelio gleivinės ląstelių linija GES1 buvo gautas tipas kultūros kolekcijos Kinijos mokslų akademija (Šanchajus, Kinija) komitetas. Ląstelių linijų buvo auginamos RPMI 1640 žiniasklaidai pateiktus su 10% šilumos neaktyvus vaisiaus galvijų serumo (FBS). Ląstelės buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje drėgnoje kameroje sudėtyje yra 5% CO _2.

Žmogaus audinių pavyzdys, -ai

66 viso suporuotas vėžinėmis ir suderintos gretimų noncancerous skrandžio gleivinės audiniai buvo surinkti iš skrandžio vėžiu pacientams, kuriems atliekama pašalintas skrandis ne Sun Yat-sen universiteto Cancer Center tarp 2009 ir 2011, o diagnozė buvo patvirtinta patologinį tyrimą. 25 suporuotas vėžinėmis ir atitinkamas gretimų noncancerous skrandžio gleivinės audinių, naudojamų aptikti ARID1A baltymų raišką Imunoblotingo buvo atrinkti iš 66 suporuotų pavyzdžius. Po chirurginės rezekcijos, švieži audiniai buvo nedelsiant immerged į RNAlater (Ambion, Inc., JAV), kad būtų išvengta RNR degradacija, laikomas 4 ° C temperatūroje per naktį, kad būtų galima kruopščiai skverbtis RNAlater į audinį ir tada užšaldyti iki -80 ° C iki RNR ir baltymų gavybos buvo atliktas. Dar 224 parafino įterptųjų pirminis skrandžio karcinoma, kuri buvo surinkta tarp 2003 ir 2005 m mėginiai buvo gauti iš Sun Yat-sen Universiteto onkologijos centras. Nė vienas iš šių pacientų gavo radioterapija ar chemoterapija prieš operaciją. Tolesnes duomenys skrandžio vėžiu sergantiems pacientams šio tyrimo yra ir baigtas. Pooperacinis tolesnių įvyko mūsų ambulatorinio skyriaus ir įtraukti klinikiniai ir laboratoriniai tyrimai kas 3 mėnesius per pirmuosius 2 metus, kas 6 mėnesius Per trečiąjį kad penktaisiais metais, kasmet už papildomą 5 metus arba kol paciento mirties, kuri įvyko pirmasis. Histopatologinė tipas ir etapas skrandžio vėžio buvo nustatytos atsižvelgiant į Pasaulio sveikatos organizacijos klasifikavimo ir TNM etape nustatyta, kad Sąjunga Tarptautinės vėžio kontrolės kriterijus.

Gavyba iš viso RNR ir realaus laiko kiekybine PGR

viso RNR išskirta naudojant TRIzol (INVITROGEN, Carlsbad, Kalifornija, JAV) pagal gamintojo protokolą. Iš viso RNR koncentracija buvo vertinama matuojant optinį tankį esant 260 nm, naudojant NANO DROP spektrofotometru (ND-1000, Thermo Scientific, JAV). Atvirkštinės transkripcijos (RT), sintetinti pirmą kryptį kDNR buvo atliktas su 2 mikrogramų visų RNR gydomi M-MLV atvirkštinės transkriptazės (Promega, JAV) pagal gamintojo rekomendacijas. tada Gautas kDNR buvo atliktas realaus laiko kiekybine PGR įvertinimo santykinis mRNR lygių ARID1A parsisiųsti ir GAPDH
(gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės, kaip vidaus kontrolė) su Žemiau pradmenis: ARID1A
priekį: 5'-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ", ir atvirkštiniai: 5'-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3"; GAPDH
priekį: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ", ir atvirkštiniai: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3". Genų konkrečių amplifikacija buvo atlikta naudojant "ABI 7900HT realaus laiko PGR sistema (Life Technologies", Karlovi Varai, Kalifornija, JAV) su 15 iL PGR mišinio, kuriame yra 0,5 įxL kDNR 7,5 įxL 2 x SYBR Žaliosios pagrindinės mišinio (INVITROGEN, Carlsbad , California, JAV), ir 200 nM atitinkamų oligonukleotidų pradmenis. Mišinys buvo pakaitinti 95 ° C temperatūroje (10 minučių) ir po to amplifikuojami 95 ° C temperatūroje (30 sec) ir 60 ° C temperatūroje (1 min) 45-ciklų. Raiška kreivė buvo matuojamas, esant 95 ° C temperatūroje 15 sekundžių, 60 ° C temperatūroje 15 sekundžių ir 95 ° C temperatūroje 15 sek. CT (riba ciklas) vertė kiekvieno mėginio buvo skaičiuojamas nuo ribinių ciklų su prietaisu programinės įrangos (SDS 2.3), o santykinė išraiška ARID1A
iRNR buvo normalizuotas į GAPDH pervežimas vertės , Duomenys buvo analizuojami naudojant lyginamąją slenkstinis ciklas (2 ^{-ΔCT) metodas.}

Imunoblotingo analizė

homogenizuotus skrandžio vėžio mėginius, įskaitant naviko ir nontumor audinių, taip pat ląstelių linijas , buvo lizuojamos į Ripa lizės buferiniame tirpale, ir lizatai nuimami, esant 4 ° C centrifuguojant (12000 rpm) 30 min. Maždaug 50 mikrogramų baltymo mėginiai buvo tada atskirti elektroforezės 12% natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelyje ir patenka ant spausdinamo polivinilideno fluorido membrana. Po blokuoja nespecifinį svetaines 60 min su 5% neriebalinės pieno, Membranos buvo inkubuojami per naktį 4 ° C su pele monokloniniai antikūnai prieš ARID1A (Abgent Pirminis antikūnų Company ", JAV, bent 1:1000 praskiedimas) , tada membranos tris kartus buvo plaunamos su TBST (Tris-buferio druskų tirpalo su Tween-20) 10 min ir tyrinėjo su krienų peroksidazės (HRP) konjuguoto triušio prieš pelės IgG antikūnų (Imunologija Konsultantai laboratorija, JAV, esant 1: 2000 praskiedimas), esant 37 ° C temperatūroje 1 valandą. Po trijų plovimų, Membranos sukūrė sustiprintą cheminės liuminescencijos sistemos (Mobilusis Signalizacijos technologijų, Danvers, Masačusetsas, JAV). Grupė intensyvumas buvo matuojamas densitometrija naudojant Kiekis One "programinė įranga (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, JAV). Baltymų kiekis buvo normalizuotas kad GAPDH aptiktas naudojant pelės anti-žmogaus GAPDH monokloninis antikūnas (Šanchajus Kangchen, Kinija, ne 1:10000 praskiedimas).

imunohistocheminis analizė

audinio skyriai buvo deparaffinized su dimetilbenzen ir rehidrataciją per 100%, 95%, 90%, 80% ir 70% etanolio. Po trijų plovimų PBS (fosfato buferinis tirpalas), skaidres buvo virti antigeno pakartotinio buferio, kuriame 0,01 M natrio citrato-vandenilio chlorido rūgštis (pH = 6,0) 15 min mikrobangų krosnelėje. Praplovus PBS, audinių dalys buvo inkubuotos su pirminiais antikūnais ir tada skaidres buvo perplaunamos 3% peroksidazės gesinandiojo tirpalo (Invitrogen) blokuoti endogeninio peroksidaze. tada dalys buvo inkubuotos su pelės monokloniniai antikūnai prieš ARID1A (Abgent pirminį antikūną Company, JAV, esant 1:300 praskiedimas), esant 4 ° C temperatūroje per naktį, ir inkubuojami su krienų peroksidazės (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM aptikimo Kit) kambario temperatūra 30 min. Nuplovus PBS, vizualizacija signalas buvo sukurtas 3, 3'-diaminobenzidinas (DAB) tirpalo, ir visi skaidrėse buvo counterstained hematoksilinu. Kaip neigiamos kontrolės, kad gretimi skyriai buvo apdoroti kaip aprašyta aukščiau išskyrus tai, kad jie buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje, blokuojančiu tirpalu be pirminio antikūno.

, kad bendras ARID1A imunodažymu rezultatą buvo apskaičiuota kaip į teigiamai proc sumos Dėmėti vėžinių ląstelių ir dažymo intensyvumą. Trumpai, pelnytas teigiamų dažymo procentinė dalis, 0 (0-9%, neigiamas), 1 (10% -25%, atsitiktinis), 2 (26% -50%, židinio) arba 3 (51% -100%, difuzinis), ir intensyvumas kaip 0 (dažymo), 1 (silpnas dažymo), 2 (vidutinio sunkumo dažymo) ir 3 (tamsaus dažančio). Bendras imunodažymu rezultatas buvo apskaičiuojamas su proc teigiamos rezultatas vertės × dažymo intensyvumo balas, kuris svyruoja nuo 0 iki 9. išraiška lygis ARID1A buvo apibrėžta kaip: "-" (neigiamas, rezultatas 0), "+" (silpnai teigiamas, rezultatas 1-3), "++" (teigiamas, rezultatas 4-6), "+++" (stipriai teigiamas, rezultatas 7-9). Remiantis ARID1A ekspresijos lygį, skrandžio vėžiu sergančių pacientų buvo suskirstyti į dvi grupes:. Neigiamas ARID1A išraiška grupė (ARID1A-) ir teigiamas ARID1A išraiška grupė (ARID1A + ARID1A ++ arba ARID1A +++)

išraiška plazmidžių ir trumpalaikis transfekcija

eukariotinių išraiška plazmidės pCMV6 įrašo, kuriame yra visą ilgį žmogaus ARID1A
kDNR buvo gautas iš Asbio Technology Company (Guangzhou, Kinija). Tuščias vektorius buvo panaudotas kaip neigiama kontrolė. MGC803 ląstelės buvo auginamos 6-duobučių lėkštelėse, kol jie pasiekė 85-90% santaką, tada praeinantys transfekcija buvo atliekama naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, genų ekspresijos išnagrinėjo Imunoblotingo analizė. Ir tada, buvo atlikta ląstelių proliferacija ir kolonija formavimas.

RNR nukleotidai ir ląstelių transfekcija

triuškinantis iš ARID1A
išraiška, kad siRNAs buvo sintetinamas GenePharma Company (Šanchajuje, Kinija). SiRNA sekas buvo taip: siRNA- ARID1A
, jausmas: 5'GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 "Priešprasminis: 5'AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3". Neigiama kontrolė (NC), jausmas: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 "Priešprasminis: 5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3". 400 pmol siRNA- ARID1A
arba NC buvo pernešta į 2 × 10 ^{5 GES1 ląstelės naudoja Lipofectamine RNRi MAX reagentą (Invitrogen, JAV) pagal gamintojo protokolą. Po to, ląstelių proliferacija buvo tada atlikti.}

neplatinimo Analizės

Mobilusis augimo tempas MGC803 arba GES1 ląstelių buvo aptiktos MTS ląstelių proliferacijos tyrimu. Ląstelės buvo pasėjamos į 96-šulinėlių plokštelės esant 5 × 10 ^{2 ląstelių viename gerai tankio. Ląstelių augimo tempas buvo aptiktas naudojant ląstelių proliferaciją MTS komplektas pagal gamintojo nurodymus (Promega, JAV). Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.}

kolonija formavimas Analizės

kolonija formavimosi tyrime, ARID1A
-expressing MGC803 ląstelių arba kontroliuoti MGC803 ląstelės buvo padengtas į 6-gerai plokštelė esant 5 × 10 ^{2 ląstelių viename gerai tankis. Po 10 dienų kultūra, išlikusių kolonijų (> 50 ląstelių viename kolonija) buvo skaičiuojamas violetinei (0,5%) dėmių. Kolonijas sudarančių efektyvumas (CFE%) buvo apibrėžiamas kaip kolonijų susidariusių kultūros prie ląstelių inokuliacija skaičiaus santykis. Eksperimentas buvo atliekamas tris kartus.}

Statistinė analizė

Skirtumai mRNR ir baltymų raiška tarp navikų mėginiuose ir suporuotas gretimų ne vėžinių audinių mėginių buvo įvertinta suporuoti imčių t-testą. Χ ^{2 bandymas buvo naudojamas analizuoti tarp ARID1A raiškos ir įvairių klinikos parametrų santykius. Išgyvenimo kreivės buvo apskaičiuotas naudojant Kaplan-Meier metodą ir lyginant pagal žurnalą rango testą. Cox proporcingas pavojaus regresijos modelis buvo naudojamas vienmatės ir matricų analizė studijuoti į klinikos kintamųjų ir ARID1A raiškos išlikimo poveikį. Du-tailed neporiniai Studento , T
testas buvo naudojamas įvertinti skirtumus ląstelių augimo tempas ir "Colony formavimas. Statistinė duomenų analizė buvo atlikta su statistikos paketas Socialinių mokslų 17,0 versija (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV), ir dvipusis , buvo laikoma P
vertė mažesnė nei 0,05 statistiškai reikšmingas.}

• PLoS ONE: prieštaringos tendencijos pastaraisiais gyventojams skirtas išgyvenimo į stemplės ir skrandžio Cancer
• PLoS ONE identifikavimas HSA-miR-335 kaip prognostinio parašas Skrandžio Cancer