PLoS One: a mikro-RNS-338 gátolja, invázió és metasztázis gyomorrák megcélozva NRP1 Expression

absztrakt katalógusa

NRP1 a többfunkciós nem tirozin-kináz receptorok kritikus szerepet játszanak a betegség progresszióját. A mikroRNS (miRNS-ek) fontos osztályát átható gének, melyek részt vesznek a különböző biológiai funkciók, különösen a rák. Nem világos, hogy a miRNS-ek is expresszióját szabályozzák NRP1. A tanulmány célja az volt, hogy azonosítsa a miRNS-ek, amelyek gátolják a növekedést, invázió és metasztázis gyomorrák megcélozva NRP1 kifejezést. Azt találtuk, hogy a miR-338 expresszió csökkent a gyomorrák sejtvonalakban és gyomorrák szövetekben. Sőt, azt találtuk, hogy a miR-338 gátolja gyomorrák sejtek migrációját, invázió, proliferáció és támogatni apoptózis célzásával NRP1 kifejezést. Mint upstream szabályozója NRP1, miR-338 közvetlenül célozza NRP1. Az erőltetett expressziója miR-338 gátolta a foszforiláció az ERK1 /2, p38 MAPK és az Akt; Azonban a kifejezés a foszforilált ERK1 /2, p38 MAPK és az Akt helyreállt a overexpressziója NRP1. AGS fertőzött sejtek miR-338 vagy transzfektált SiNRP1, a fehérje szintje a fibronektin, vimentin, N-kadherin és SNAIL csökkentek, de a kifejezés az E-cadherin nőtt. A kifejezés a mesenchymalis markerek miR-338-et expresszáló sejtek vissza a normális szintre a helyreállítás NRP1 kifejezés. In vivo katalógusa, miR-338 is csökkentette a tumor növekedését és elnyomott D-MVA célzási NRP1. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a miR-338 működik, mint egy új tumor-szuppresszor gén gyomorrák. miR-338 képes csökkenteni vándorló, invazív, proliferatív és apoptotikus viselkedés, valamint gyomorrák EMT, által enyhítő expresszióját NRP1.

bevezető hivatkozás: Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) a mikro-RNS-338 gátolja, invázió és metasztázis gyomorrák által célzás NRP1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10,1371 /journal.pone.0094422 katalógusa

Szerkesztő: Chih-Hsin Tang, Kína Orvostudományi Egyetem, Taiwan katalógusa

Beérkezett: október 18, 2013; Elfogadva: március 16, 2014; Megjelent: április 15, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Peng, et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott projekt a Tudományos és Technológiai Bizottság Shapingba kerület Chongqing (201302). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Neuropilins, beleértve neuropilin1 (NRP1) és neuropilin2 (NRP2), a többfunkciós nem-tirozin-kináz-receptorok, amelyek először azonosították alapján kritikus szerepet a fejlődő idegrendszerben [1]. Nrp1 és Nrp2 van 44% -ban hasonló, sok közös szerkezeti és biológiai tulajdonságai. NRP1 főleg létezik bloodvesselendothelia és NRP2 főképp a nyirokerek [2], [3]. Későbbi vizsgálatok azonosítottak NRP-1 mint a receptor a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) -A izoforma VEGF-165 mind az endoteliális sejtek és bizonyos daganatsejtek [4], [5]. A kutatások kimutatták, hogy a NRP1 akár szabályozott többféle tumortípusban és expresszálódik különböző tumor érhálózatra [3], [6], ami arra utal, hogy NRP1 kritikus szerepet játszik a tumor progressziójában. A korai kutatások során kiderült, hogy NRP1 befolyásolhatja a daganatok növekedését, mint a coreceptor VEGFR [5]. A tudósok később kiderül, hogy NRP1 növelhetné tumorangiogenesis, felgyorsítja a tumor növekedését és a járdaszegély tumor apoptózis nélkül VEGFR [7]. NRP1 lehet egy coreceptor más növekedési faktorok, amely megvilágítja, hogy miért a VEGF jelezheti keresztül neuropilins hiányában a VEGFR-1, vagy VEGFR-2 [8], [9]. Mint coreceptor a TβRI /TβRII, NRP1 megfékezni tumor apoptózis és felgyorsítja a tumor növekedését keresztül mind a kanonikus és nem kanonikus jelátviteli [10]. NRP1, mint coreceptor PDGFR /cMet, fokozhatja tumorangiogenesis keresztül p38MAPK és ERK jelátviteli [11].

upstream szabályozó gének NRP1, a transzkripciós faktorok SP1 /3 és AP1 lehet expresszióját szabályozzák NRP1 [ ,,,0],12]. Egyes kutatások kimutatták, hogy a butirát elnyomja a kifejezés a neuropilin I kolorektális sejtvonalak gátlása révén Sp1 transzaktivációs [13].

A mikroRNS (miRNS-ek) között nem kódoló RNS-molekulák körülbelül 21-23 nukleotid hosszúságú, hogy a szabályozzák a génexpressziót a poszt-transzkripciós szintű [14], [15], [16]. miRNS expressziós profil elemzések feltárták a globális down-regulációja érett miRNS szintek primer humán tumorok viszonyítva a normál szövetekben [17], [18]. Így miRNS működhet tumorszupresszorokkal vagy onkogének és szabályozatlan miRNS expresszió hozzájárulhat a tumorsejt-metasztázis. Nem világos, hogy a miRNS-ek is expresszióját szabályozzák NRP1; Ezért célul tűztük ki, hogy meghatározza a cél miRNS az NRP1. További funkciói NRP1 által is felfedezhető tanulmányozása a cél miRNS az NRP1. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Az emberi szövetminták és sejtvonalak

Ez a vizsgálat felhasználható friss szövetek, köztük 41 humán gyomorrák minták és 24 minta a szomszédos normális nyálkahártya szövetek származó 41 beteg műtéten átesett a második Affiliated Kórház Chongqing Orvostudományi Egyetem között 2012 és 2013 Ezt a vizsgálatot végeztek szerint "Biomedical Research, amelyek emberi etikai felülvizsgálati (kísérleti) "szabályozása az egészségügyi Minisztérium és a Helsinki nyilatkozat etikai elveiről szóló bevonó orvosi kutatás az emberi alanyokat. Minden mintát kaptunk a tájékoztatáson alapuló beleegyezése a betegek és a kísérleteket jóváhagyta az Institutional Review Board második Affiliated Kórház Chongqing Orvostudományi Egyetem. Minden résztvevő írásos beleegyezését adta, hogy vegyenek részt a vizsgálatban. Katalógusa

Az SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 és N87 sejtvonalak az American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA , USA), és a GES-1 sejtvonal vásárolt a Type Culture Collection a kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína). A sejtvonalakat tenyésztettünk RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS) és inkubáltuk 37 ° C hőmérsékleten, 5% CO2-t.

alapozók, RNS-izolálás és miRNS Detection

a primerek miR-338-3p és U6 gyártottak a miScript Primer vizsgálat kit (Qiagen Düsseldorf, Németország). A szekvenciákat a miRNS-ek ebben a tanulmányban alkalmazott a következők voltak: a miR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG és U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. A fordított primereket is használják a reverz transzkripciós lépést. Összesen miRNS extraháljuk a tenyésztett sejtekből és a humán szövetmintákban segítségével RNAiso Small RNS-t (Takara Bio, Otsu, Japán) határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. Poly-A farok adunk miR-338 és U6 a miRNS Reaction Buffer Mix (Takara Bio), majd cDNS-t szintetizáltunk a 5 ng teljes RNS felhasználásával miRNS PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara Bio). Real-time PCR-t végeztünk egy CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio). A PCR körülményei a következők voltak: 95 ° C-on 30 s, majd 40 ciklus: 95 ° C 5 s és 60 ° C-on 30 másodpercig. Az adatokat normalizáltuk ellen U6 snRNS. Az amplifikálás után egy olvadási görbe analízist végeztünk, hogy erősítse meg a specificitás a termékek.

pcDNS kifejező plazmidok, és a plazmid transzfektálása

Az ORF szekvenciáját NRP1 amplifikáltuk genomi DNS-t izoláltunk az AGS sejt vonal, és az ORF régió a NRP1 cDNS-t ezután szubklónoztuk GV230 vektorba (GeneChem Corporation, Shanghai, Kína) .A plazmidot transzfektáljuk AGS és MKN45 sejteket Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-négy órával a transzfekció után, a sejteket alkalmaztuk a mentési kísérletben. AGS sejtek stabilan transzfektáltunk NRP1 alkalmazásával szelektáltuk 2 ug /ul puromicin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Franciaország) 48 óra után a transzfekciós.

miRNS Gene klónozása és ektópiás expressziója

emberi miR-338 gén PCR-rel amplifikáltuk a normál genomiális DNS-t és klónoztuk lentivirális vektorba. A lentivírusok voltak által generált együttes transzfekció HEK293T-sejtek plazmidokkal PGC-LV, pHelper 1,0 és pHelper 2,0 Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vírusok gyűjtöttünk 48 órával a transzfekció után, és a fertőzések végeztük jelenlétében 2 mg /ml polibren (GeneChem Corporation). Ellenőrző miRNS vírusokat a vásárolt GeneChem Corporation (Sanghaj, Kína). AGS sejtek stabilan fertőzött miR-338 segítségével választottuk 2 ug /ul puromicin (Invitrogen) után 48 órával a fertőzést. Katalógusa

Gene Expression Knockdown RNS-interferencia katalógusa

NRP1 expresszió AGS sejtek elhallgattatta transzfek következő célzott siRNS szekvenciák (Sangon Biotech, Shanghai, Kína) és Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (ha nincs megadva, siRNShasználtuk). Ellenőrző siRNS (sic!) Keletkezett bevezetésével 4 bázis helyettesítéseket NRP1 célszekvenciát (GATAGGTCATGACTGCCC). Negyvennyolc órával a transzfekció után, NRP1 expresszióját vizsgáltuk immunoblot.

luciferáz riporter vizsgálat

PsicheckTM-2 Dual-Luciferáz miRNS cél expressziós vektort használtuk 3'UTR luciferáz assay (Sangon Biotech, Shanghai, Kína). A cél onkogén miRNS-338 került kiválasztásra alapján az online mikroRNS cél adatbázis http://www.microrna.org/microrna/home.do. A primer szekvenciák a vad típusú 3'UTR a következők voltak: Forward: 5'-CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 'és reverz 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3'. Mivel van két kötőhelyek NRP1 3'UTR, terveztünk két primer szekvenciák a mutáns 3'UTR. Az egyik mutáns 3'UTR, a primer szekvenciák a következők voltak: Forward: 5'GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'és reverz: 5'GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3'. A többi mutáns 3'UTR, a primer szekvenciák a következők voltak: Forward: 5'GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'és reverz: 5'GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. A luciferáz assay, Lipofectamine 2000 használtunk cotransfect MKN45 sejtek a HSA-miR-338 és PsicheckTM-2 Dual-Luciferáz miRNS cél expressziós vektorokat tartalmazó vad típusú vagy mutáns célszekvenciák. A szentjánosbogár luciferáz aktivitását mértük Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI, USA) 18 órával a transzfekció után, és az eredményeket normalizáltuk ellen Renilla luciferáz. Mindegyik riporter plazmidot transzfektáljuk legalább háromszor (különböző napokon), és minden egyes mintát három párhuzamosban vizsgáltuk.

a sejtek életképességét és Clonability Assay

A transzfektált sejteket oltottunk 96 lyukú lemezekre sűrűségben 1 × 10 ^{4 sejt /lyuk. MTT-oldatot (20 ul 5 mg /ml MTT-t) adunk a tenyészetekhez (a teljes térfogat 200 ul), és inkubáltuk 4 sapka 37 ° C-on. Eltávolítását követően a táptalaj, a maradék kristályokat feloldottuk DMSO-ban, és az abszorbanciát 570 nm-en mértük. A telepképző assay sejteket oltottunk egy kis sűrűségű (1000 sejt /lemez), és hagytuk növekedni, amíg látható telepeket megjelent. A sejteket ezután megfestettük Giemsa, és a kolóniákat megszámoltuk.}

migrációs és behatolás vizsgálatok

A transwell migrációs vizsgálatokban, 10 × 10 ^{4 sejteket a felső kamrában egy nem bevont membrán (24 lyukú inszert; 8 mm-es pórusméretű; BD Biosciences). Az inváziós vizsgálati eljárást, 2 × 10 5 sejteket a felső kamrában egy Matrigel bevont membrán (24 lyukú inszert; 8 mm-es pórusméretű; BD Biosciences). Mindkét vizsgálati eljárások, a sejteket szérummentes tápközegben, és egy táptalajban, amely 10% szérumot alkalmaztunk kemoattraktáns az alsó kamrában. A sejteket 16 órán át 37 ° C-on és 5% CO 2 szövettenyésztő inkubátorban. 16 óra elteltével a nem-migrált /nem-behatoló sejteket eltávolítottuk a felső oldalán a transwell membrán szűrő betétek segítségével pamut-hegyű törlőkendő. A migrált /inváziót sejtek az alsó oldalán a lapkák megfestettük Giemsa, és a sejteket megszámláltuk.}

Antitestek

elleni ellenanyagokat a fibronektin, vimentin, N-kadherin, E-cadherin, Csiga és GAPDH vásároltuk a Santa Cruz Biotechnology (Kalifornia, USA). Phospho-ERK1 /2, foszfo-Akt, foszfo-p38MAPK cégtől vásároltuk ABCAM (Cambridge, UK), és a teljes ERK1 /2, Akt és p38MAPK voltak a BD Biosciences (USA). Elleni antitest NRP1 vásároltunk a R &D Systems (Minneapolis, MN, USA), és a HRP-vel (torma-peroxidáz) konjugált kecske anti-egér IgG-t és HRP-konjugált kecske anti-nyúl IgG-t szereztünk be a Santa Cruz Biotechnology.

immunoblot

Összes fehérje kivontuk a transzfektált sejtek alkalmazásával RIPA lízis pufferben (Beyotime, Kína), a gyártó utasításai szerint. Miután a teljes-sejt protein extraktumokat mennyiségileg BCA fehérje vizsgálat, ekvivalens mennyiségű sejtlizátumokat 10% -os SDS-poliakrilamid-gél-elektroforézissel és vittük egy polivinilidén-fluorid membrán, amelyet ezután blokkoltuk 5% zsírmentes tej TBST 1 órán át 4 ° C-on. A blotokat ezután inkubáltuk primer antitestekkel. Inkubálás után HRP-konjugált másodlagos antitestekkel, a protein sávokat láthatóvá alkalmazásával fokozott kemilumineszcencia reagenssel (Millipore, Billerica, MA, USA). A következő ellenanyag hígításokat alkalmaztuk: anti-fibronektin, 1:200; anti-vimentin, anti-E-kadherin és anti-N-kadherin, 1:1200; anti-Csiga és anti-GAPDH, 1:500; anti-foszfo-ERK1 /2, anti-foszfo-Akt, és az anti-foszfo-p38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-összes ERK1 /2, anti-Akt, és az anti-p38MAPK, 1:500; és HRP-konjugált IgG, 1:7000. katalógusa

xenograft kísérletek katalógusa

Férfi athymikus egereket 6-8 hetes korban kapott Animal Kísérleti Központ Chongqing Orvostudományi Egyetem és akklimatizálódni 2 hét. Ezt a vizsgálatot végeztek szigorú ajánlásaival összhangban az útmutató a Care and Use of Laboratory Animals Chongqing Orvostudományi Egyetem. A protokoll hagyta jóvá a Bizottság Etikai állatkísérletek Chongqing Orvostudományi Egyetem. Minden műtét alatt végeztük nátrium pentobarbitál érzéstelenítés, és minden erőfeszítést tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. Azonos számú AGS sejtek (10 ^{6) erőltetett expressziója miR-338 vagy CONT-mir, vagy anélkül NRP1 helyreállítás, szuszpendáljuk 100 ul PBS-ben és szubkután injektáltuk a jobb hátsó szárnyon minden egér (10 egér per csoport) .Tumor monitoroztuk a növekedést naponta minden egyes csoportban. A tumor térfogatot képlet szerint kiszámított V = 1/2 × B2, ahol a a leghosszabb tumor tengely, és b jelentése a legrövidebb tumor tengelyen. Az egereket feláldoztuk 5 héttel később, és a tumorokat két részre oszlik. Az egyik részt rögzítették formolon későbbi immunhisztokémiai analízis, a másik részét pedig fennmaradt liquidnitrogen a Western blot vagy qRT-PCR. Katalógusa}

Az immunhisztokémiai katalógusa

A tumorokat tartósított formalin helyeztük parafintömböket és szekcionált ra pozitív töltésű tárgylemezre. A metszeteket paraffint xilolban, hidratáljuk osztályozzák alkohol, és előkezeljük antigén visszakeresés citrát pufferben 20 percig egy 98 ° C-gőzös (CD34 és NRP1). A metszeteket inkubáltuk 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) és NRP1 (1:100 R &D rendszerek). Immunfestést segítségével végeztük ultraszenzitív S-P Detection Kit (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, Kína), valamint a szín felhasználásával fejlesztették DAB készlet (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, Kína) .Subsequently a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük. A lemezeket ezután festjük H &E értékelésére morfológiáját. Katalógusa

számszerűsítése immunhisztokémiai festési intenzitása katalógusa

Az egyes tumor mikroerek sűrűség, öt véletlenszerűen kiválasztott világos- mikroszkópos képek (nagyítás 40 ×; terület 0,89 mm ^{2) mintánként fentiekben leírt módon kapott, és a pozitívan festődő mikroerek megszámoltuk a ImageJ programot. A vörös csatorna, amely megfelel a CD34-festés, izoláljuk, digitalizált egy bináris képet, fekete jelezve foltos hajók és fehér jelezve, hogy nincs-festéssel. Hajók lumen digitálisan töltött, és egy összetett D-MVA mennyiségileg. A ImageJ program barna színű képeket adott DAB festést vontuk egy szín dekonvolúciós makró. Minden az intenzitás értékek az adott csoporton belül átlagoltuk kiszámításához az arányok az egyes csoportok között. Katalógusa}

Statisztikai elemzés katalógusa

SPSS 17.0 szoftvert használtuk a statisztikai elemzést. Az adatokat, mint az átlag ± szórás (S.D.). Csoport összehasonlításokat végeztük Student-féle t-teszt. Különbségek tekintettük szignifikánsnak p < 0,05. Katalógusa

Eredmények katalógusa

MIR Selection katalógusa

Ahhoz, hogy szerepel a későbbi elemzés fehérje célpontjai NRP1 kellett egybehangzóan által megjósolt legalább három a következő négy előrejelző eszközöket: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan /index.html) és miRDB (mirdb.org/miRDB/). Alapján 2012. januári kiadás változata, azt találtuk, 11 mikroRNS potenciálisan célzott NRP1. Mi már korábban azonosított számos miRNS rendellenesen kifejezve gyomor karcinóma alkalmazásával gén chip [19] (1. táblázat). A fentiek alapján két, mi várható egy upstream miRNS az NRP1: miR-338. Katalógusa

miR-338 lefelé szabályozni gyomorrákban szövetek és sejtvonalak

feltárásához a miR -338 humán gyomorrák fejlesztés, elemeztük annak expressziós szintje 41 humán gyomorrák minták és 24 szomszédos normál nyálkahártya mintákban. Szerint a QRT-PCR elemzés, a szint a miR-338 expresszió szignifikánsan csökkent a tumor szövetekben, mint a szomszédos normális nyálkahártya szövetekben (1A.). Ezen túlmenően, a miR-338 expresszió csökkent a gyomor rákos sejtvonalak (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 és N87), mint a normál gyomornyálkahártya sejtvonal (GES1) (1B ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-338 lefelé szabályozni a gyomor rákos sejtek, a megállapítás, amely releváns lehet az emberi gyomor rák kialakulásához. Katalógusa

miR-338 közvetlenül célozza onkogén NRP1 katalógusa

NRP1 óta számoltak be, hogy egy fontos molekulát, ami hajtja a gyomorrák migrációs és behatolás. Segítségével előrejelző eszközöket, azt jósolták, hogy a cél miRNS az NRP1 volt miR-338. Ahhoz, hogy tovább erősítse meg, hogy a miR-338 közvetlenül célozza onkogén NRP1 végeztünk luciferáz riporter assay kell vizsgálni, hogy a miR-338 közvetlen kölcsönhatásban a megcélzott onkogén NRP1. Azonosítottunk két potenciális kötőhelyek miR-338, a 3'UTR a NRP1 mRNS. Annak meghatározásához, hogy NRP1 szabályozza miR-338 közvetlen kötődését az 3'UTR a NRP1, létrehoztunk egy sor 3'UTR fragmentumok, beleértve a teljes hosszúságú vad típusú NRP1 3'UTR, egy kötőhelyet 1 mutáns és kötőhelyet 2 mutáns (2A.). Ezeket a fragmenseket ezután behelyezzük a psiCHECK2 luciferáz riporter plazmiddal. Azt találtuk, hogy az együttes transzfekciójával miR-338 és a vad típusú NRP1 3'UTR okozott szignifikáns csökkenést luciferáz egységek a kontrollokhoz képest. Azonban a ko-transzfekciója miR-338 és a mutáns NRP13'UTR nem okozott csökkenését luciferáz egységek (ábra. 2b). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-338 célokat NRP1 közvetlenül. Katalógusa

miR-338 gátolja a gyomorsav Cancer Cell Migration, invázióját és proliferációját, és elősegíti az apoptózist által NRP1 katalógusa

Annak vizsgálata funkcionális jelentősége miR-338 túltermelése a gyomorrák, mi fertőzött a gyomorrák sejtvonalakon AGS és MKN45 LV-HSA-mir-338. Összehasonlítva a kifejezés cont-miR, miR-338 szignifikánsan túltermelõdik az AGS és MKN45 sejtvonalak fertőzés után LV-HSA-mir-338 (3A). Azt is megállapították, hogy, szemben a folytatás-miR, a kifejezés NRP1 szignifikánsan lefelé szabályozni a AGS és MKN45 sejtvonalak fertőzés után LV-HSA-mir-338 (3B). A sejteket erőltetett expressziója miR-338 mutatott szignifikánsan csökkent proliferációs összehasonlítva a sejtek erőltetett expressziója cont-miR (3C, ábra). A miR-338-fertőzött sejteket is mutatott csökkent telepek kialakulása képesség: a szám a gócok a miR-338-et expresszáló sejtek aránya csökkent, mint a folytatás-miR-fertőzött sejtek (ábra 3D). A transzwell migráció és Matrigél behatolás vizsgálatokban kimutatták, hogy a miR-338 szignifikánsan csökkentette a migrációs és behatolás kapacitásait az AGS és MKN45 sejtek (ábra 3E). A fluoreszcencia-aktivált sejtosztályozással (FACS) elemzés azt mutatta, hogy az erőltetett expressziója miR-338 előnyét, gyomorrák sejt apoptózist. Százalékos aránya az apoptotikus sejtek (korai apoptotikus + késői apoptotikus) szignifikánsan 11% -kal nőtt, válaszul a miR-338 túltermelése képest folyt-miR túltermelése AGS sejtekben. Egy 10% -os számának növekedése az apoptotikus sejtek volt megfigyelhető a MKN45 sejtek miR-338 túltermelése képest CONT-miR (ábra 3F). miR-338 képes expresszióját szabályozzák NRP1 által közvetlenül gátolta NRP1 átírás vagy egyéb közvetett áramkörök, így a következő vizsgálni, hogy a csökkentés a NRP1 kifejezés megmagyarázhatja a gátlását gyomorrák sejtek migrációját, invázióját és proliferációját után megfigyelt kényszerű expresszióját miR 338. Ezért kénytelen a kifejezés a miR-338 AGS sejtek együtt konstrukciót tartalmazó NRP1 kódoló szekvenciát, de hiányzik a 3'UTR a NRP1 mRNS. Ennek eredményeképpen ez a konstrukció eredményezett egy NRP1 mRNS, amely rezisztens volt a miR-338. Azt találtuk, hogy a gyomorrák sejtek migrációját, invázió, proliferáció és az apoptózis-ben restaurálták a AGS sejtvonal kénytelen miR-338 expresszió és NRP1 helyreállítása (ábra 3G-3J). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a miR-338 gátolja gyomorrák sejtek migrációját, invázióját és proliferációját, és elősegíti az apoptózist célzott NRP1. Katalógusa

Effect miR-338 jelátviteli AGS Cells katalógusa

A nem- tirozin-kináz-receptor, NRP1 lehet mérsékelten növeli a kifejezés a foszforiláció az ERK1 /2, Akt és p38MAPK hogy támogassák a tumorsejtek proliferációját és metasztázis, valamint, hogy megfékezze a apoptózis és immunválaszt. Mivel NRP1 downstream célpontja a miR-338, azt feltételeztük, hogy a miR-338 csökkentheti a kifejezés a foszforiláció Erk1 /2, Akt és p38MAPK. Azt találtuk, hogy az erőltetett expressziója miR-338 gátolja a foszforiláció az ERK1 /2, de a relatív expressziós szint a teljes Erk1 /2 nem változott szignifikánsan. miR-338 is csökkenti a foszforiláció p38 MAPK és az Akt (ábra 4A). miR-338 képes kötődni a 3'UTR a NRP1 mRNS, hogy szabályozza a foszforiláció az ERK1 /2, Akt és p38MAPK; azonban azt nem tudta, hogy a miR-338 képes kötődni a 3'UTRs más gének elérésére azonos hatást. Tehát megmentésére kísérletet végeztünk, és a helyreállítás NRP1 expresszió megerősítette keresztül immunoblot analízis (ábra 4B). Azt találtuk, hogy a foszforiláció szintje Erk1 /2, Akt és p38MAPK nem változtatta meg lényegesen a AGS sejtek kénytelen miR-338 expresszió és NRP1 helyreállítás (4c). Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a miR-338 szabályozza a foszforilációja ERK1 /2, p38 MAPK és az Akt keresztül NRP1. Katalógusa

miR-338 Meghatározza Epithelialis fenotípusa gyomorrák katalógusa

EMT fontos mechanizmus rákkal invazivitását és a metasztázist. A jelenséget a EMT úgy definiáljuk, mint az átmenet az epiteliális sejtek fibroblastoid- vagy mezenchymális-szerű sejtek. EMT jellemzi elvesztése epithelialis markerek és az akvizíció a mesenchymalis elemek. E-cadherin, occludin és citokeratin vannak downregulált során EMT, míg az N-cadherin, vimentin, fibronektin SNAIL felszaporodnak. NRP1 fokozza jelző keresztül három nagy utat, hogy is kapcsolódik a EMT, azaz, a TGF-β, HH és HGF /cMet. Ahhoz, hogy megtalálja a szerepét NRP1 fenntartásában mesenchymalis fenotípusa gyomor sejtek, mi leütötte a kifejezés NRP1 RNS interferencia (RNSi) (ábra. 5A) és kifejeződését vizsgáltuk mesenchymalis markerek, például fibronektin, vimentin, N-kadherin és csiga, valamint az epitheliális marker E-kadherin, az AGS sejtekben. Azt találtuk, hogy az expressziós szintek a fibronektin, vimentin, N-kadherin és SNAIL csökkentek, de a kifejezés a E-cadherin növelte a NRP1-hiányos tumorsejtek (ábra. 5B). Az eredmény azt mutatja, hogy NRP1 vezetheti EMT folyamata a gyomorrák. Mivel NRP1 downstream célpontja a miR-338, azt feltételeztük, hogy a miR-338 képes meghatározni a epithelialis fenotípusát gyomorrák. Annak meghatározására, hogy a molekuláris változások jellemző egy csökkentett EMT történt miR-338-et expresszáló sejtek, megvizsgáltuk expresszióját mesenchymalis és epithelialis markerek AGS sejtekben. Az immunoblot analízis azt mutatta, hogy az expressziós szintek a fibronektin, vimentin, N-kadherin és SNAIL csökkentették az AGS sejteket a kényszerű expresszióját miR-338. Továbbá, az erőltetett expressziója miR-338 fokozott expresszióját E-cadherin az AGS sejtvonal, míg a kontroll-fertőzött sejtek maradtak E-cadherin negatív. Azt találtuk, hogy a miR-338 szabályozott foszforilációja az ERK1 /2, p38 MAPK és az Akt keresztül NRP1; Ezért szükséges volt megvizsgálni, hogy a miR-338 lehetett szabályozni EMT keresztül NRP1. Az immunoblot analízis azt mutatta, hogy a kifejezés a fenti mesenchymalis markerek a miR-338-et expresszáló sejtek helyreállt a normális szintre a helyreállítása NRP1 kifejezés (ábra. 5C). Összességében ezek az eredmények igazolták, hogy a miR-338 gátolhatja EMT keresztül NRP1 gyomorrákban sejtekben. Katalógusa

miR-338 Csökkenti a tumor növekedését és Megszünteti D-MVA célzás NRP1 In Vivo Matton

alapján a megfigyelt csökkenése vándorló, az invazív és proliferatív viselkedések AGS és MKN45 fertőzött sejtek LV-HSA-mir-338, mi következő betöltött szerepét vizsgáltuk miR-338 in vivo növekedését. Mi szubkután beoltott csupasz egerek egyenlő számú (1 × 10 ^{6 sejt per egér) AGS sejteket a kényszerű kifejezése miR-338 vagy cont-miR, vagy anélkül NRP1 helyreállítása. A tumor előfordulási értékelték kéthetente, és a tumorok jelentek meg az összes egér. miR-338 expresszió a meztelen egér tumorok mértük QRT-PCR, és azt találtuk, hogy a miR-338 expressziója szignifikánsan megnövekedett a tumorok overexpresszált miR-338 (6a ábra). Az erőltetett expressziója miR-338 szignifikánsan gátolta a tumor növekedését in vivo, de a túlzott expressziója NRP1 helyreállíthatja tumornövekedést (6B). Ezután megvizsgáltuk NRP1 kifejezést a csupasz egér daganatok western blot és immunhisztokémiai. Azt találtuk, hogy NRP1 expressziója szignifikánsan csökkent a tumorok overexpresszált miR-338; azonban NRP1 kifejezés helyreállt a tumorokat, amelyek túlzott mértékben NRP1 (A 6C, 4D). Így arra következtetni, hogy a miR-338 gátolta a tumornövekedést, sarokvasak NRP1 expresszió in vivo. NRP1 fokozhatja tumorangiogenesis; Ezért azt feltételeztük, hogy az erőltetett expressziója miR-338 gátolja tumorangiogenesis keresztül NPR1. Immunhisztokémiai festését CD34 használták, hogy értékelje a száma és morfológiai jellemzőinek erek belül minden egyes daganat. Az edényeket felsorolt ​​megszámoljuk a szerkezetek diszkrét festéssel egyes területeken belül, tekintet nélkül a hajó mérete és átjárhatóságát. A hajók a tumorokat, amelyek túlzott mértékben a miR-338 szubjektíven kevesebb, mint a folytatás-miR-expressziót mutató tumorok; száma azonban a hajók helyreállt a tumorokat, amelyek túlzott mértékben NRP1 (ábra 6E). A digitalizált mikrovaszkuláris terület (D-MVA) analizáltuk, hogy bele hajóméret és átjárhatóságát a mi elemzés a tumor érrendszerének azáltal, hogy egy becslést az integrált lumen területének és feltehetően a vér áramlását merőleges a tumor részben. A D-MVA csökkent a miR-338 expressziót mutató tumorok. Meglepetésünkre azt találtuk, hogy NRP1-expressziót mutató tumorok nem szignifikánsan mutatnak megnövekedett angiogenezis, de a csökkentés a D-MVA miatt miR-338 túltermelése visszaállt a tumorokat, amelyek overexpresszált NRP1 (ábra 6F és 6g). Úgy gondoljuk, hogy NRP1 kifejezés már fokozódik gyomorrák, ezért további expresszált NRP1 nem tudja jelentősen növelni tumor érrendszer de visszaállíthatja tumor érrendszer amelyet csökkenteni miR-338. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a miR-338 csökkenti a tumor növekedését és elnyomja a D-MVA megcélozva NRP1 in vivo. Katalógusa}

Vita katalógusa

A gén-chip és a bioinformatika, azt jósolta, hogy a cél miRNS az NRP1 volt miR -338. A kutatások kimutatták, hogy a kifejezés a miR-338 változik a különböző daganatok. Huang XH et al. azt mutatta, hogy a miR-338-3p elnyomott májrák sejtek invázióját megcélozva simítani [20]. Sőt, melanóma, miR-193a, miR-338, miR-565 és kimutatták, hogy alulexpresszáltak betegeknél a BRAF mutáció [21]. Ezekből az adatokból azt következtetni, hogy a miR-338 működhetne tumorszuppresszor. Nincs publikált szakirodalomban arról, hogy a miR-338 alulexpresszáltak gyomorrákban. Vizsgálatunkban expressziós szintjét miR-338 először mért 41 humán gyomorrák minták és 24 minta a szomszédos normális nyálkahártya szöveteket. Ezután értékeltük a kifejezés a miR-338 öt gyomorrák sejtvonalakat és normál gyomornyálkahártya sejtvonalakban. Azt találtuk, hogy a kifejezés a miR-338-ben alulszabályozott mind a tumor szövetekben, és a rákos sejtvonalak. Sőt, a túlzott mértékben expresszált miR-338 gátolhatja gyomorrák sejtek migrációját, invázióját és proliferációját, és elősegíti az apoptózist. Eközben a daganatkeltő minőséget lehet teljesen helyreállítani NRP1 túltermelése. Ezen felül, a luciferáz riporter assay azt javasolta, hogy a miR-338 célokat NRP1 közvetlenül. Így arra a következtetésre jutunk, hogy a miR-338 működik, mint egy potenciális tumor szupresszor gyomorrákban, hogy a funkció úgy végezzük visszaszorítása kifejezése NRP1. Katalógusa

A nem-tirozin-kináz-receptor, NRP1 is mérsékelten növelik a kifejezése a foszforiláció az ERK1 /2, Akt és p38MAPK. M Akagi et al. megállapították, hogy a gátlása NRP-1 csökkent a kifejezés a foszforiláció az ERK1 /2, Akt és p38MAPK [22]. Továbbá, a kutatások kimutatták, hogy ez a kifejezés az ERK1 /2 foszforiláció up-szabályozott NRP-1-overexpresszáló sejtek [23]. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy túlzottan kifejezett miR-338 csökkentheti a kifejezés a foszforiláció az ERK1 /2, Akt és p38MAPK, amely hatás a megfordult upon NRP1 helyreállítása. Az aktiválás ERK, Akt és p38MAPK társítva apoptózis ellenállás /a sejtek túlélését már jól dokumentált a különböző modell rendszerek [24], [25], [26].

• PLoS One: Összefüggés P53 állapota és a kemoterápiára adott válasz a gyomorrákos betegeknél: A meta-analízis
• PLoS One: Expression az EGF család gyomorrákban: downregulációját HER4 és annak aktiválása ligand NRG4