PLoS ONE: MicroRNA-338 Slopina augimo, invazija ir metastazių skrandžio vėžio nukreipiant NRP1 raiškos

Anotacija

NRP1 taip daugiafunkcinių ne tirozino kinazės receptorius-žaisti kritinių vaidmenis naviko progresavimo. Mikro RNR (miRNAs) yra svarbi klasės sparčiausiai plintančių genų, kurie yra susiję su biologinių funkcijų, ypač vėžio įvairovė. Lieka neaišku, ar miRNAs gali reguliuoti NRP1 išraiška. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti miRNAs kad gali slopinti augimą, invazija ir metastazes skrandžio vėžio nukreipiant NRP1 išraiška. Mes nustatėme, kad Pasaulis-338 išraiška buvo sumažintas skrandžio vėžio ląstelių linijų ir skrandžio vėžio audiniuose. Be to, mes nustatėme, kad Pasaulis-338 slopina skrandžio vėžio ląstelių migraciją, invazija, platinimu ir skatinti apoptozę nukreipiant NRP1 išraiška. Kaip prieš srovę reguliatorius NRP1, PPN-338 tiesiogiai skirta NRP1. Priverstinis išraiška miR-338 slopino ERK1 /2, P38 MAPK ir AKT fosforilinimo; Tačiau fosforilinto ERK1 /2, P38 MAPK ir AKT išraiška buvo atkurta iki NRP1 raiškos. Be AGS ląstelių užsikrėtusių miR-338 arba transfektuotose SiNRP1, baltyminiai lygiai fibronektino, vimentin, N-cad ir sraigė sumažėjo, tačiau padidėjo E-cad išraiška. Iš mezenchiminių žymenų Pasaulis-338-išreiškiančius ląstelių išraiška buvo atkurta iki normalaus lygio iki NRP1 išraiškos atkūrimo. , in vivo
, PPN-338 taip pat sumažėjo naviko augimą ir slopina D-MVA nukreipiant NRP1. Todėl, galime daryti išvadą, kad miR-338 veikia kaip naują auglio slopinamojo geno skrandžio vėžio. Pasaulis-338 gali sumažinti migracijos, invazinės, proliferacijos ir apoptozinių elgesį, taip pat skrandžio vėžys EMT, kurias lengvinančias į NRP1 išraišką

nurodomoji dalis:. Peng Y Liu YM Li LC Wang LL, VU XL (2014) MicroRNA-338 Slopina augimo, invazija ir metastazes skrandžio vėžio nukreipiant NRP1 išraiška. PLoS ONE 9 (4): e94422. Doi: 10,1371 /journal.pone.0094422

redaktorius: Chih-Hsin Tango, Kinijos medicinos universitetas, Taivanis

Įstojo: Spalio 18, 2013; Priėmė: Kovo 16, 2014 m Paskelbta: Balandžio 15, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Peng et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė projektą mokslo ir technologijų komiteto Shapingba rajone Chongqing (201302). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Neuropilins, įskaitant neuropilin1 (NRP1) ir neuropilin2 (NRP2), yra daugiafunkcinis ne tirozino kinazės-receptorius, kad pirmą kartą buvo nustatyti remiantis jų kritinės vaidmenų besivystančiame nervų sistemos [1]. Nrp1 ir Nrp2 turi 44% homologiją ir dalintis daug struktūrinių ir biologinių savybių. NRP1 daugiausia egzistuoja bloodvesselendothelia ir NRP2 dažniausiai būna limfagyslių [2], [3]. Vėlesni tyrimai identifikuojamos NRP-1, kaip, skirto kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) -A izoforma VEGF-165 abiejose endotelio ląstelių receptoriaus ir tam tikrų vėžinių ląstelių [4], [5]. Tyrimai parodė, kad NRP1 yra iki reguliuojama keliomis tipų navikais ir išreiškiami įvairiais navikais vasculatures [3], [6], o tai rodo, kad NRP1 vaidina svarbų vaidmenį navikų progresavimo. Ankstyvas tyrimai parodė, kad NRP1 gali paveikti auglių augimą, kaip VEGFR [5] coreceptor. Mokslininkai vėliau nustatė, kad NRP1 galėtų padidinti tumorangiogenesis, paspartinti naviko augimą ir pažaboti naviko apoptozę be VEGFR [7]. NRP1 gali būti kitų augimo faktorių coreceptor, kuris nušviečia kodėl VEGF gali reikšti per neuropilins į VEGFR-1or VEGFR-2 [8] nėra, [9]. Kaip TβRI /TβRII coreceptor, NRP1 gali pažaboti naviko apoptozę ir pagreitinti naviko augimą per tiek kanoninės ir nekanoninį signalizacijos [10]. NRP1, kaip PDGFR /cMet coreceptor, gali padidinti tumorangiogenesis per P38MAPK ir ERK signalizacijos [11].

Kaip gavybos reguliavimo genų NRP1, transkripcijos veiksniai SP1 /3 ir AP1 gali reguliuoti NRP1 išraišką [ ,,,0],12]. Kai kurie tyrimai parodė, kad butiratas slopina neuropilin i storosios žarnos ląstelių linijų išraišką per SP1 transactivation [13] slopinimo.

mikro RNR (miRNAs) yra ne kodavimo RNR molekules maždaug 21-23 nukleotidų ilgio, kad reguliuoti genų ekspresiją ne po transkripcijos lygio [14], [15], [16]. Mirna išraiška profiliavimo analizes atskleidė pasauliniu žemyn reguliavimą brandus Mirna lygių pradinėse žmogaus navikų, palyginti su sveikų audinių [17], [18]. Taigi, miRNAs gali veikti kaip naviko slopintuvai ar onkogenų ir dysregulated Mirna išraiškos gali prisidėti prie naviko ląstelių metastazės. Lieka neaišku, ar miRNAs gali reguliuoti NRP1 išraišką; Todėl siekėme nustatyti tikslines miRNAs iš NRP1. Papildomos funkcijos NRP1 gali būti atrastas tiriant tikslines miRNAs iš NRP1.

Medžiagos ir metodai

žmogaus audinių pavyzdžiai ir ląstelių linijų

Šis tyrimas naudojami švieži audiniai, įskaitant 41 žmogaus skrandžio vėžio mėginiai ir 24 bandiniai gretimuose normaliuose gleivinės audinių gautų iš 41 pacientų, kuriems buvo atlikta operacija per Antrąjį filialas ligoninės Chongqing medicinos universiteto tarp 2012 ir 2013 m šis tyrimas buvo atliktas pagal "Biomedicininių tyrimų, kuriuose naudojamos žmogaus etikos apžvalga (preliminariai) "reguliavimas sveikatos apsaugos ministerijos ir Helsinkio deklaracija dėl etinių principų medicinos tyrimų su žmonėmis susijusių. Visi mėginiai buvo gauti informuoto sutikimo pacientų ir eksperimentai buvo patvirtintas pagal institucinius ekspertizės valdyba Antrojo filialas ligoninės Chongqing medicinos universitete. Visi dalyviai raštu pateikė informuoti sutikimą dalyvauti šiame tyrime

SGC-7901, HGC-27, MAA, MKN-45 ir N87 ląstelių linijos buvo gauta iš amerikiečių tipas Kultūros kolekcijos (ATCC,. Manassas, VA , JAV), o GES-1 ląstelių linija buvo įsigyta iš tipas kultūros kolekcijos Kinijos mokslų akademijos (Šanchajus, Kinija). Ląstelių linijų buvo auginamos RPMI1640 (Hyclone, Logan Juta JAV), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) ir buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje su 5% CO2.

Gruntai, RNR išskyrimas ir mirna aptikimo

mir-338-3p ir U6 pradmenys buvo pagaminti naudojant miScript Gruntas Analizės rinkinį (Qiagen Diuseldorfas Vokietija). Iš miRNAs naudojami šiame tyrime sekas buvo taip: mir-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG ir U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Atvirkštinės pradmenys taip pat buvo naudojami atvirkštinės transkripcijos žingsnio. Iš viso Mirna buvo išgauti iš išaugintų ląstelių ir žmogaus audinių pavyzdžius naudojant RNAiso mažųjų RNR (TAKARA bio, Otsu, Japonija), pagal gamintojo instrukcijas. Poli-A uodegos buvo įtraukta į miR-338 ir U6 su Mirna reakcijos buferio Mix (Takara "Bio), tada kDNR buvo sintetinamas iš 5 ng visų RNR naudojant Mirna PrimeScript RT fermento mišinio (TAKARA BIO). Realaus laiko PGR buvo atliekama CFX96 Realaus laiko PGR aptikimo sistemos (Bio-Rad) su SYBR Pašaro Ex Taq II (TAKARA Bio). PGR sąlygos buvo 95 ° C temperatūroje 30 s, o po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 5 s ir 60 ° C temperatūroje 30 s. Duomenys buvo normalizuotas prieš U6 snRNA. Po amplifikacijos, lydymosi kreivės analizė buvo atlikta siekiant patvirtinti produktų specifiką.

pcDNR plazmidės ir plazmidžių transfekcijq

ORF seka NRP1 sustiprino iš genomo DNR, išskirtos iš AGS ląstelių linija, o ASR regionas NRP1 kDNR buvo tada subklonuotas į GV230 vektoriaus (GeneChem Corporation, Šanchajus, Kinija) .Sriegines plazmidės buvo pernešta į AGS ir MKN45 ląstelių naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty keturias valandas po transfekciją, The ląstelės buvo naudojamas gelbėjimo eksperimento metu. AGS ląstelės, kurios buvo stabiliai transfektuotose NRP1 buvo atrinkti naudojant 2 ug /ul puromicino (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Prancūzija) 48 val po transfekciją.

Mirna Genų klonavimas ir negimdinis išraiška

žmogaus ir miR-338 genas buvo PGR-amplifikuotas iš įprasto genominės DNR ir klonuotas į lentiviruso vektorių. Į lentiviruses buvo sukurtas pagal HEK293T ląstelių kontransfekcijai su plazmidžių PGC-LV, pHelper 1.0 ir pHelper 2,0 naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virusai buvo surinktos 48 valandas po transfekciją, ir infekcijos buvo atliekami pagal su 2 mg /ml polibrenui (GeneChem Corporation) buvimą. Valdymo Mirna viruse buvo įsigytas iš GeneChem Corporation (Šanchajus, Kinija). AGS ląstelės, kurios buvo stabiliai užsikrėtę miR-338 buvo atrinktos naudojantis 2 ug /ul puromicino (Invitrogen) 48 val po užsikrėtimo.

Genų ekspresija triuškinantis pagal RNR trukdžių

NRP1 išraiška pagal AGS ląstelės buvo nutildyti transfekuoja šiuos tikslinius siRNA sekas (Sangon Biotech, Šanchajus, Kinija) su Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (kur nenurodyta, siRNRbuvo naudojamas). Valdymo siRNAs (NAK) buvo sukurtas įvedant 4 bazių pakaitas yra NRP1 orientacija seką (GATAGGTCATGACTGCCC). Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, NRP1 išraiška buvo nagrinėjama munoblotingu.

liuciferazės Žurnalistė Analizės

PsicheckTM-2 Dual-liuciferazės Mirna tikslas ekspresijos vektorius buvo naudojamas 3'UTR liuciferazės tyrimai (Sangon Biotech ", Šanchajus, Kinija). Tikslinė onkogeno iš Mirna-338 buvo atrinkti remiantis internetinės MicroRNA tikslinės duomenų bazės http://www.microrna.org/microrna/home.do~~pobj pagrindu. Grunto sekų laukinio tipo 3'UTR srities buvo taip: į priekį: 5'-CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 "ir pakeisti 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3". Kadangi yra du privalomi svetainių NRP1 3'UTR srities, mes sukūrėme dvi gruntas sekų mutantas 3'UTR srities. Dėl vieno mutanto 3'UTR srities, kad gruntas sekos buvo taip: į priekį: 5'-GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 "ir pakeisti: 5'-GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3". Už kitos mutantas 3'UTR srities, pradmenys sekos buvo taip: į priekį: 5'-GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'ir atbulinės eigos: 5'-GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. Dėl liuciferazės tyrimą, Lipofectamine 2000 buvo naudojamas cotransfect MKN45 ląsteles su HSA-miR-338 ir PsicheckTM-2 Dual-liuciferazės Mirna tikslas ekspresijos vektoriai, kurių sudėtyje yra laukinio tipo arba mutantas tikslines sekas. Firefly liuciferazė aktyvumas buvo matuojamas naudojant Dual liuciferazės tyrimas (PROMEGA, Madison, WI, JAV) 18 val po transfekciją, o rezultatai buvo normalizuotas prieš Renilla liuciferazės. Kiekvienas reporteris plazmidės buvo pernešta bent tris kartus (skirtingomis dienomis), ir kiekvienas mėginys buvo tiriami trimis egzemplioriais.

ląstelių gyvybingumas ir Clonability Bandymai

Transfekuoti ląstelės buvo pasėjamos į 96-duobučių lėkštelėse esant 1 × 10 ^{4 ląstelių tankis /pat. MTT tirpalą (20 ul 5 mg /ml MTT) buvo įtraukta į kultūrų (iš viso tūrio 200 ul) ir inkubuojama 4 skrybėlę 37 ° C temperatūroje. Po to, kai mitybinės terpės pašalinimas, likę kristalai buvo ištirpinta DMSO, ir esant 570 nm bangos ilgiui, absorbcija, buvo matuojamas. Koloniją formavimo tyrime, ląstelės buvo pasėjamos esant mažo tankio (1000 ląstelių /plokštė) ir leidžiama augti iki matomos kolonijos atsirado. Tuomet ląstelės buvo tamsintas su Giemsa ir buvo skaičiuojami kolonijos.}

Migracija ir invazija Bandymai

Dėl transwell migracijos tyrimus, 10 × 10 ^{4 ląstelės buvo padengtas į viršų kamerą su nepadengto membrana (24 gerai įdėklas; 8 mm akučių dydį; BD Biosciences). Dėl invazija tyrimai, 2 × 10 5 ląstelės buvo padengtas į viršų kameroje su Matrigel dengtos membrana (24 šulinėlių įdėklas; 8 mm, porų dydis; BD biomokslai). Už abu tyrimai, ląstelės buvo padengtą kraujo serumo neturinčioje terpėje, ir vidutinio papildytas 10% serumo buvo naudojamas kaip apatinę kamerą chemoattractant. Ląstelės buvo inkubuojamos 16 h esant 37 ° C ir 5% CO2 A audinių kultūra inkubatoriuje. Po 16 h greičiu, ne migravo /ne užplūsta ląstelės buvo pašalintas iš viršutinių pusių transwell membraninį filtrą intarpais naudojant medvilnės nulenkti tamponai. Išsiskyrusio /įsiveržė ląstelės apatinėje pusėse įdėklų buvo tamsintas su Giemsa ir buvo skaičiuojami ląstelės.}

Antikūnai

Antikūnai prieš fibronektino, vimentin, N-cad, E-cad, SRAIGĖ ir GAPDH buvo įsigytas iš Santa Cruz Biotechnology (CA, JAV). PHOSPHO-ERK1 /2, PHOSPHO-Akt ir PHOSPHO-P38MAPK buvo įsigytas iš Abcam (Cambridge, UK) ir visos ERK1 /2 Akt ir P38MAPK buvo iš BD biomokslų (JAV). Antikūnas prieš NRP1 buvo įsigytas iš R & D sistemos (Mineapolis, MN, JAV) ir HRP (krienų peroksidazės) konjuguoto ožkos anti-pelės IgG ir HRP konjuguoto ožkos anti-triušį IgG buvo perkamos iš Santa Cruz Biotechnology

imunoblotas

viso baltymas gaunamas iš perkeltų ląstelių naudojant Ripa lizės buferiniame tirpale (Beyotime, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Po viso ląstelių baltymų ekstraktai kiekybiškai naudojant BCA baltymų tyrimą, lygiaverčiai kiekiai ląstelių fragmentai buvo išspręsta 10% SDS poliakrilamido gelyje ir buvo perkelti ant polivinilidenfluorido membrana, kuri tada buvo užblokuotas 5% neriebalinės pieno TBST 1 valandą 4 ° C temperatūroje. Tuomet dėmės buvo inkubuojami su pirminių antikūnų. Po inkubacijos su HRP konjuguotų antrinių antikūnų, baltyminiai juostos buvo ryškinamos naudojant sustiprintą chemiliuminescencine reagentą (Millipore, BILLERICA, MA, JAV). buvo naudojami šie antikūnų skiedinius: anti-fibronektiną, 1:200; Anti-vimentin, Anti-E-cad ir anti-N-cad, 1:1200; prieš SRAIGĖ ir anti-GAPDH, 1:500; Anti-PHOSPHO-ERK1 /2, anti-PHOSPHO-Akt, ir anti-PHOSPHO-P38MAPK, 1:2000; prieš NRP1, 1:600; Anti-viso ERK1 /2, anti-Akt, ir anti-P38MAPK, 1:500; ir HRP konjuguoto IgG, 1:7000.

ksenografiniuose eksperimentai

Vyras athymic nuogas pelės nuo 6 iki 8 savaičių amžiaus, buvo gauti iš gyvūnų eksperimentinės centro Chongqing medicinos universiteto ir buvo aklimatizuotis už 2 savaites. Šis tyrimas buvo atliktas griežtai laikantis šio vadovo rekomendacijas dėl priežiūros ir naudojimo laboratorinių gyvūnų Chongqing medicinos universitete. Protokolas buvo patvirtintas dėl pranešimo apie gyvūnų eksperimentai Chongqing medicinos universiteto etikos komitetas. Visos operacijos buvo atliktos pagal natrio pentobarbitalio anestezijos ir buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų. Lygios numeriai AGS ląstelių (10 ^{6) priverstinio išraiška miR-338 ar tęsinys-PPN, su arba be NRP1 atkūrimo, buvo sustabdytas 100 iL PBS ir švirkščiamas po oda į dešinę galinio sparno kiekvieno pele (10 pelės kiekvienai grupei) .Tumor augimas buvo stebimas kasdien, kiekvienoje grupėje. Navikas tūris buvo apskaičiuotas pagal šią formulę V = 1/2 × B2, kur a yra ilgiausias auglio ašį, ir b yra trumpiausias navikas ašis. Pelės buvo paaukotos 5 savaičių ir navikai buvo padalintas į dvi dalis. Viena dalis buvo nustatyta formalino tolesniam imunohistocheminio analizės, o kita dalis buvo išsaugota liquidnitrogen už Imunoblotingo ar KRL-PGR.}

imunohistocheminis

Augliai konservuoti formalinu buvo sudėti į parafino blokus ir suskirstyta į teigiamą krūvį stiklelių. Skyriai buvo deparaffinized į ksileno, hidratuotas ir rūšiavo alkoholio ir išvalytos antigeno paieškos citrato buferiu 20 min per 98 ° C garlaivis (CD34 ir NRP1). Skyriai buvo inkubuojami esant 4 ° C naktį su CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) ir NRP1 (1:100 & D Systems). Imunodažymu atlikta naudojant UltraSensitive S P aptikimo rinkinį (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, Kinija), ir spalva buvo sukurtas naudojant DAB rinkinį (PW017, Sangon Biotech, Šanchajus, Kinija) .Subsequently, sekcijos buvo counterstained hematoksilinu. Tuomet skaidres buvo tamsintas su H &. E įvertinti morfologiją

kiekybinis Imunohistocheminis Stain intensyvumas

Norėdami nustatyti naviko kraujagyslių tankis, penkis atsitiktinai atrinktų brightfield mikroskopiniai vaizdai (didinimo 40 ×; 0,89 plotas mm ^{2) už mėginio buvo gauti, kaip aprašyta aukščiau, ir teigiamai tamsintas mikrokraujagyslės buvo skaičiuojami naudojant ImageJ programą. Raudona kanalas, atitinkantis CD34 dažymo, buvo izoliuota ir suskaitmenintas į dvejetainį vaizdas, su juoda nurodant tamsintas laivus ir balta nurodant jokios dėmės. Laivuose su liumenų buvo skaitmeniniu būdu užpildyti ir sudėtinis D-MVA buvo kiekybiškai. Naudojant ImageJ programą, specifiniai DAB dažymo rudos spalvos vaizdai buvo ekstrahuojamas spalva deconvolution makro. Visi intensyvumo reikšmės toje pačioje grupėje buvo vidutiniškai apskaičiuoti santykį tarp skirtingų grupių.}

Statistinė analizė

SPSS 17.0 programinė įranga buvo naudojama statistinės analizės. Duomenys pateikiami kaip priemonėmis ± standartinis nuokrypis (Š.D.). Grupė palyginimai buvo atliekami naudojant Stjudento t-testą. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, kai p <. 0,05

Rezultatai

MIR atranka

Jei būti įtraukti į mūsų vėlesnei analizei, baltymų tikslai NRP1 turėjo būti nuosekliai atitikti prognozavo bent trijų iš šių keturių prognozavimo įrankius: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan index.html) ir miRDB (mirdb.org/miRDB/). Remiantis Sausis 2012 laidos versijos, mes nustatėme 11 mikro RNR, kurie potencialiai tikslines NRP1. Mes anksčiau nustatė keletą miRNAs neįprastai išreikštas skrandžio karcinoma, naudojant genų mikroschema [19] (1 lentelė). Remiantis pirmiau minėtų dviejų mes prognozuojama prieš srovę Mirna iš NRP1: Pasaulis-338

Pasaulis-338 yra neveiksnus reguliuojama skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų

Jei ištirti PPN vaidmenis. -338 žmogaus skrandžio vėžio išsivystymo, mes matuojamas savo lygius raiškos 41 žmogaus skrandžio vėžio mėginiai ir 24 gretimų normalios gleivinės mėginiai. Atsižvelgiant į KRL-PGR metodu, miR-338 raiškos lygis buvo žymiai sumažėjo naviko audinių sritis lyginant su gretimų įprastomis gleivinės audinių (pav. 1A). Be to, PPN-338 išraiška sumažėjo skrandžio vėžio ląstelių linijų (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 ir N87), palyginti su įprastu skrandžio gleivinės ląstelių linijos (GES1) (pav 1B). Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-338 yra žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ląsteles, išvadą, kad gali būti svarbi žmogaus skrandžio vėžio vystymąsi.

Pasaulis-338 Tiesiogiai tikslai onkogeniniam NRP1

NRP1 buvo pranešama, kad svarbi molekulė, kuri vairuoja skrandžio vėžys migracija ir invazija. Naudojant prognozavimo įrankius, mes prognozuojama, kad tikslinė Mirna iš NRP1 buvo Pasaulis-338. Siekiant dar labiau patvirtina, kad Pasaulis-338 tiesiogiai skirta onkogeno NRP1, mes atliekame liuciferazės reporteris tyrimus, atliekamus išnagrinėti, ar Pasaulis-338 sąveikauja tiesiogiai su savo tikslinę onkogeninių NRP1. Mes išskyrė dvi potencialias privalomus svetainių Mir-338 ties NRP1 mRNR 3'UTR srities. Norėdami nustatyti, ar NRP1 reglamentuoja miR-338 per tiesioginio privalomas į NRP1 3'UTR srities, mes sukonstravo iš 3'UTR fragmentų serija, įskaitant pilnametražis laukinio tipo NRP1 3'UTR, privalomojo svetainė 1 mutantas ir rišimosi vietos, 2 mutantas (pav. 2A). Šie fragmentai buvo tada įkišti į psiCHECK2 liuciferazės reporteris plazmidės. Mes nustatėme, kad bendrai transfekcija miR-338 ir laukinio tipo NRP1 3'UTR srities sukelia reikšmingai sumažėjo liuciferazės vienetų, lyginant su kontrole. Vis dėlto, jei-transfekavimas miR-338 ir mutantas NRP13'UTR nebuvo sukelti į liuciferazės vienetų (2b pav.) Sumažėjimą. Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-338 tikslai NRP1 tiesiogiai.

Pasaulis-338 slopina skrandžio vėžio ląstelių migraciją, invazija ir neplatinimo ir skatina apoptozę iki NRP1

Jei išnagrinėti funkcinę reikšmę PPN-338 raiškos skrandžio vėžio, mes užsikrėtę skrandžio vėžio ląstelių linijų AGS ir MKN45 su KS-HSA-mir-338. Palyginti su tęsinys-miR išraiškos, PPN-338 buvo žymiai ekspresija į AGS ir MKN45 ląstelių linijas po užsikrėtimo LV-HSA-mir-338 (3A pav.) Mes taip pat nustatė, kad, palyginti su tęsinys-PPN, kad NRP1 išraiška buvo gerokai žemyn reguliuojama AGS ir MKN45 ląstelių linijas po užsikrėtimo LV-HSA-mir-338 (3b pav.) Ląstelės su priverstinio išraiška miR-338 eksponavo platinimu gerokai sumažėjo, palyginti su ląstelėmis, priverstinai išraiška tęsinys-miR (3c pav.) Mir-338 infekuotų ląstelių, taip pat eksponuojami lengvatinį kolonija formavimo galimybes: iš židinių skaičių Mir-338-išreiškiančius ląstelių buvo sumažėjęs, lyginant su tęsinys-Pasaulis-infekuotų ląstelių (3D pav.) Transwell migracija ir Matrigel invazija tyrimai parodė, kad Pasaulis-338 žymiai sumažino migracijos ir invazija gebėjimus AGS ir MKN45 ląstelių (3e pav). Fluorescencijos aktyvuota ląstelių rūšiavimo (FACS) analizė parodė, kad priversti išraiška Pasaulis-338 švino skrandžio vėžio ląstelių apoptozę. Iš viso apoptozinių ląstelių procentas (anksti aprotoninis + vėlai aprotoninis) žymiai padidėjo 11%, atsižvelgiant į Pasaulis-338 raiškos palyginti su tęsinys-miR raiškos į AGS ląsteles. 10% padidėjo apoptozinių ląstelių skaičius buvo pastebėta MKN45 ląstelių su Pasaulis-338 raiškos, palyginti su tęsinys-miR (3f pav). Pasaulis-338 gali reguliuoti NRP1 išraiška tiesiogiai slopina NRP1 stenogramą ar kiti netiesioginiai grandines, todėl kitą kartą patikrinti, ar iš NRP1 raiškos sumažinimas galėtų paaiškinti skrandžio vėžio ląstelių migracija, invazija ir platinimu, pastebėta po priverstinio išraiška miR- slopinimas 338. Todėl mes priversti PPN-338 išraišką AGS ląstelių kartu su konstruktas, kuriame yra NRP1 kodavimo sekos, tačiau neturinti iš NRP1 mRNR 3'UTR. Kaip rezultatas, tai konstruktas leidžia spręsti, kad buvo atsparus miR-338 yra NRP1 iRNR. Mes nustatėme, kad skrandžio vėžys ląstelių migracija, invazija, proliferacija ir apoptozė buvo atkurta AGS ląstelių linijos su priverstinio Pasaulis-338 saviraiškos ir NRP1 atkūrimo (pav 3G-3j). Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-338 slopina skrandžio vėžio ląstelių migraciją, invazija ir proliferaciją ir skatina apoptozę nukreipiant NRP1.

Poveikis miR-338 signalizacijos kelius AGS Ląstelės

Kaip ne- tirozinkinazės receptoriaus, NRP1 gali vidutiniškai padidinti į ERK1 /2, Akt fosforilinimo išraiška, ir P38MAPK skatinti naviko ląstelių proliferaciją ir metastazių, taip pat siekiant neleisti apoptozę ir imuninį atsaką. Kadangi NRP1 yra tolesnis tikslas miR-338, mes prielaidą, kad Pasaulis-338 gali sumažinti apie ERK1 /2 Akt ir P38MAPK fosforilinimo išraiška. Mes nustatėme, kad priversti išraiška miR-338 slopino ERK1 /2 fosforilinimas, tačiau santykinė išraiška lygis visos ERK1 /2 buvo reikšmingai nepakito. ir miR-338 taip pat gali sumažinti P38 MAPK ir AKT (pav 4a) fosforilinimo. Pasaulis-338 gali įpareigoti iš NRP1 mRNR 3'UTR reguliuoti ERK1 /2, Akt ir P38MAPK fosforilinimo; Tačiau, mes ne žinoti, ar miR-338 gali surišti kitų genų 3'UTRs užtikrinti vienodą poveikį. Taip gelbėjimo eksperimentas buvo atliktas, ir NRP1 išraiškos atkūrimas buvo patvirtinta per Imunoblotingas (pav 4B). Mes nustatėme, kad fosforilinimo lygis ERK1 /2 Akt ir P38MAPK nebuvo reikšmingai pakeista AGS ląstelių su priverstinio Pasaulis-338 saviraiškos ir NRP1 atkūrimo (pav 4c). Todėl galime daryti išvadą, kad Pasaulis-338 reglamentuoja ERK1 /2, P38 MAPK ir AKT fosforilinimo per NRP1.

Pasaulis-338 Nustato epitelio fenotipo skrandžio vėžio

EMT yra svarbus mechanizmas susijęs su vėžio invazijos ir metastazių. Iš EMT reiškinys yra apibrėžiamas kaip epitelinių ląstelių pereiti prie fibroblastoid- arba mezenchiminių-kaip ląstelių. EMT yra būdinga tai, kad epitelio žymenų praradimo ir mezenchiminių komponentų įsigijimo. El cad, occludin ir citokeratino yra downregulated metu EMT, o N-cad, vimentin, fibronektino ir sraigė yra aktyvinama. NRP1 pagerina signalo per tris pagrindinius kelius, kad buvo susijęs su EMT t.y. TGF-β, HH ir HGF /cMet. Norėdami rasti NRP1 vaidmenį palaikant mezenchiminių fenotipą skrandžio ląstelėse, mes išjudinti žemyn NRP1 ekspresiją RNR trukdžių (RNAi) (. 5A pav) ir išnagrinėjo mezenchiminių žymenų, tokių kaip fibronektino, vimentin, N-cad išraišką ir SRAIGĖ, taip pat epitelio gaudantis E-cad, į AGS ląstelių. Mes nustatėme, kad sąvoka lygiai fibronektino, vimentin, N-cad ir sraigė sumažėjo, tačiau E-cad išraiška išaugo NRP1-išeikvoti vėžinių ląstelių (5b pav.). Rezultatai rodo, kad NRP1 gali vairuoti EMT procesą skrandžio vėžio. Nes NRP1 yra pasroviui tikslas miR-338, mes prielaidą, kad miR-338 galėtų nustatyti, epitelio fenotipą skrandžio vėžio. Norėdami nustatyti, ar molekuliniai pokyčiai būdingi sumažintą EMT įvyko Pasaulis-338-išreiškiančius ląstelių, mes išnagrinėjo mezenchiminių ir epitelio žymenų AGS ląstelių išraiška. Imunoblotingas parodė, kad sąvoka lygiai fibronektino, vimentin, N-cad ir sraigė sumažėjo į AGS ląstelių su priverstinio išraiškos PPN-338. Be to, priversti išraiška miR-338 padidino E-cad į AGS ląstelių linijos išraiška, o kontrolės ir infekuotų ląstelių liko El cad neigiamas. Mes nustatėme, kad Pasaulis-338 sureguliavo ERK1 /2, P38 MAPK ir AKT per NRP1 fosforilinimo; Todėl buvo būtina nustatyti, ar Pasaulis-338 gali reguliuoti EMT per NRP1. Imunoblotingas parodė, kad iš minėtų mezenchiminių žymenų Mir-338-išreiškiančius ląstelių išraiška buvo atkurta normali iki NRP1 išraiškos (5c pav.) Atkūrimo. Iš viso, šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-338 gali slopinti EMT per NRP1 skrandžio vėžio ląsteles.

Pasaulis-338 Sumažina naviko augimą ir slopina D-MVA nukreipiant NRP1 , in vivo

"remiantis pastebėtus sumažėja migracijos, invazinių ir proliferacijos elgsena AGS ir MKN45 ląstelių užsikrėtusių LV-HSA-mir-338, kitą kartą tyrė PPN-338 vaidmenį augimui in vivo. Mes po oda užsėti nuogas peles su vienodo skaičiaus (1 × 10 ^{6 ląstelės per pele) iš AGS ląstelių su priverstinio išraiška miR-338 ar tęsinys-PPN, su arba be NRP1 atkūrimo. Navikas dažnis, nustatytas du kartus per savaitę, ir navikai pasirodė visų pelių. Pasaulis-338 išraiška nuogas pelių navikams buvo matuojamas naudojant KRL-PGR, ir mes nustatėme, kad Pasaulis-338 išraiška labai padidėjo navikų, kad ekspresija MIR-338 (6a pav.) Priversti išraiška miR-338 žymiai slopinamas naviko augimą in vivo, bet NRP1 raiškos galėtų atkurti naviko augimą (6b pav). Be to, mes išnagrinėjo NRP1 išraišką nuogas pelių navikams Vakarų dėmė ir imunohistocheminiu. Mes nustatėme, kad NRP1 išraiška labai sumažėjo navikų, kad ekspresija MIR-338; Tačiau NRP1 išraiška buvo atkurta navikų, kad ekspresija NRP1 (pav 6C, 4d). Taigi, mes daryti išvadą, kad Pasaulis-338 slopinamas naviko augimą ribojant NRP1 išraiška in vivo. NRP1 gali padidinti tumorangiogenesis; Todėl, mes iškėlė hipotezę, kad priverstinis išraiška miR-338 slopina tumorangiogenesis per NPR1. Imunohistocheminis dažymas CD34 įvertinti buvo naudojama skaičius ir morfologines savybes kraujagyslių kiekvienoje naviko. Laivai buvo išvardyti skaičiuojant statinių su diskrečiųjų dažymo kiekvienoje srityje skaičių, neatsižvelgiant į laivo dydį ar praeinamumą. Į navikų, kad ekspresija MIR-338 laivai buvo subjektyviai mažiau nei tęsinys-Pasaulis-ekspresija navikų; Tačiau iš laivų skaičius buvo atkurta navikų, kad ekspresija NRP1 (6e pav.) Suskaitmenintas smulkiųjų kraujagyslių plotas (D-MVA) buvo analizuojami įtraukti laivo dydį ir praeinamumas į mūsų analizės naviko kraujagyslių, teikiant integruotos liumenų srityje sąmatą ir, matyt, kraujotaka statmenos naviko skyriuje. D-MVA buvo sumažintos ir miR-338 ekspresija navikų. Mūsų nuostabai, mes nustatėme, kad NRP1 aktyvuojami navikai neturėjo reikšmingos rodo padidėjusį angiogenezę, bet D-MVA sumažinimas dėl Pasaulis-338 raiškos buvo atkurta navikų, kad ekspresija NRP1 (6F ir 6g paveikslas). Mes spėlioti, kad NRP1 išraiška jau buvo aktyvinama skrandžio vėžio, todėl toliau ekspresija NRP1 negali žymiai padidinti naviko kraujagyslių bet gali atkurti naviko kraujagyslių, kurios buvo sumažintos iki miR-338. Šie rezultatai parodė, kad Pasaulis-338 sumažina naviko augimą ir slopina D-MVA nukreipiant NRP1 in vivo.}

Diskusijos

Naudojant genų lustai ir bioinformatikos, mes prognozuojama, kad tikslinė Mirna iš NRP1 buvo miR -338. Tyrimai parodė, kad miR-338 išraiška yra skirtingas navikų. Huang XH ir kt. parodė, kad Pasaulis-338-3p slopino kepenų vėžio ląstelių invaziją nukreipiant smoothened [20]. Be to, melanomos, PPN-193a, PPN-338, ir Pasaulis-565 buvo įrodyta, kad būti underexpressed pacientams, kuriems BRAF mutacijos [21]. Iš šių duomenų, mes daryti išvadą, kad miR-338 gali veikti kaip auglio slopinamojo. Nėra paskelbta literatūra dėl to, ar Pasaulis-338 yra underexpressed skrandžio vėžio. Mūsų tyrimo duomenimis, ekspresijos lygis PPN-338 pirmą kartą buvo matuojamas 41 žmogaus skrandžio vėžio mėginiai ir 24 mėginių gretimų normalios gleivinės audiniuose. tada mes įvertintas miR-338 ekspresiją penkių skrandžio vėžio ląstelių linijų ir įprastomis skrandžio gleivinės ląstelių linijų. Mes nustatėme, kad miR-338 išraiška buvo žemyn reguliuojama tiek navikų audiniuose ir vėžio ląstelių linijų. Be to, ekspresija Pasaulis-338 gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių migraciją, invazija ir platinimu, skatinti apoptozę. Tuo tarpu tie, navikų savybės gali būti visiškai atkurta NRP1 raiškos. Be to, liuciferazės žurnalistė tyrimai rodo, kad miR-338 tikslai NRP1 tiesiogiai. Taigi, galime daryti išvadą, kad Mir-338 veikia kaip potencialus naviko slopintuvas skrandžio vėžio, funkcija, kuri pasiekiama iki pažaboti NRP1 išraišką.

Kaip ne tirozino kinazės-receptorių, NRP1 gali vidutiniškai padidinti išraiška ERK1 /2 Akt ir P38MAPK fosforilinimo. M Akagi ir kt. Nustatyta, kad NRP-1 slopinimas sumažino į ERK1 /2, Akt fosforilinimo išraiška, ir P38MAPK [22]. Be to, tyrimai parodė, kad ERK1 /2 fosforilinimo išraiška buvo iki-reguliuojami NRP-1-ekspresija ląstelės [23]. Šiame tyrime mes nustatėme, kad ekspresija Pasaulis-338 gali sumažinti apie ERK1 /2 Akt ir P38MAPK, šis poveikis buvo atstatomi ant NRP1 atkūrimo fosforilinimo išraiška. Iš ERK, Akt ir P38MAPK aktyvacijos kartu su apoptozės atsparumas /ląstelių išlikimas buvo gerai dokumentuoti modelio sistemų įvairovė [24], [25], [26].

• PLoS ONE: Ryšys tarp P53 statuso ir atsako į chemoterapiją sergantys skrandžio vėžiu: metaanalizė
• PLoS ONE: išraiška EGF Šeima skrandžio vėžiu: downregulation iš HER4 ir jos aktyvinimas ligandas NRG4