Plos ONE: MicroRNA-338 zavira rast, invazijo in metastaz želodčnega raka z usmerjanjem NRP1 izražanja

Povzetek

NRP1 kot večnamenske non-tirozin-kinaze receptorjev igrajo ključne vloge v napredovanje tumorja. MicroRNAs (miRNAs) so pomemben razred prodorne genov, ki so vključeni v različnih bioloških funkcijah, zlasti raka. Še vedno ni jasno, ali lahko miRNAs regulira izražanje NRP1. Cilj te raziskave je bil ugotoviti miRNAs, ki bi lahko zavirajo rast, invazijo in metastaze raka želodca z usmerjanjem NRP1 izraz. Ugotovili smo, da je miR-338 ekspresijo zmanjšano v želodčnih raka celičnih linijah in v želodčnih tkivih raka. Poleg tega smo ugotovili, da miR-338 zaviral migracije želodčni rak celic, invazijo, proliferacijo in spodbuja apoptozo z usmerjanjem NRP1 izraz. Kot pridobivalnem regulatorja NRP1, miR-338 neposredno namenjen NRP1. Prisilna izraz miR-338 inhibira fosforilacijo Erk1 /2, P38 MAPK in Akt; Vendar pa je bilo izražanje fosforiliranega Erk1 /2, P38 MAPK in Akt obnovil čezmerni NRP1. V AGS celicah okuženih z miR-338 ali transfektiranih z SiNRP1 smo zmanjšali raven proteinske fibronektina, vimentina, N-kadherina in polža, vendar se je zvišala ekspresijo E-kadherina. Izraz mezenhimskih označevalcev v miR-338-izražajo celic smo ponovno na normalno raven z vrnitvijo NRP1 izražanja. V vivo
, miR-338 se je zmanjšala tudi rast tumorjev in zatreti D-MVA z usmerjanjem NRP1. Zato sklepamo, da miR-338 deluje kot nove zaviralnih genov pri raku želodca. miR-338 lahko zmanjša selitvene, invazivne, proliferacije in apoptotične vedenja, kot tudi želodčne EMT raka, ki ga olajševalnih izražanje NRP1

Navedba. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) MicroRNA-338 Zavira rast, invazijo in metastaze želodca raka z usmerjanjem NRP1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10,1371 /journal.pone.0094422

Urednik: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Tajvan

Prejeto: 18. oktober, 2013; Sprejeto: 16. marec, 2014; Objavljeno: 15. april 2014

Copyright: © 2014 Peng, et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprlo projekt znanost in tehnologijo odbora v Shapingba okrožja Chongqing (201302). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Neuropilins, vključno neuropilin1 (NRP1) in neuropilin2 (NRP2), so večnamenski non-tirozin-kinaze receptorje, ki so bile odkrite najprej na podlagi njihovih ključnih vlog pri razvoju živčnega sistema [1]. Nrp1 in Nrp2 imajo 44% homologijo in imata veliko strukturnih in bioloških lastnosti. NRP1 večinoma obstaja v bloodvesselendothelia in NRP2 je v glavnem najdemo v limfnih žil [2], [3]. Preiskave označene NRP-1 kot receptorja za vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF) -A izooblika VEGF-165 v obeh endotelijskih celic in nekaterih tumorskih celic [4], [5]. Raziskave so pokazale, da je NRP1 up-urejena v različnih vrstah tumorjev in se izraža v različnih tumorskih vasculatures [3], [6], ki kažejo, da ima NRP1 ključno vlogo pri napredovanju tumorja. Zgodnje raziskave so pokazale, da lahko NRP1 vpliva na rast tumorjev kot coreceptor za VEGFR [5]. Znanstveniki kasneje ugotovili, da bi lahko NRP1 povečanje tumorangiogenesis, pospešiti rast tumorja in praznega tumorja apoptozo brez VEGFR [7]. NRP1 lahko coreceptor drugih rastnih faktorjev, ki pojasnjuje, zakaj VEGF signala skozi neuropilins v odsotnosti VEGFR-1 ali VEGFR-2, [8], [9]. Kot coreceptor za TβRI /TβRII, lahko NRP1 omeji tumorja apoptozo in pospeši rast tumorja preko tako kanonični in nekanonične signalizacijo [10]. NRP1, kot coreceptor za PDGFR /cMet, lahko povečajo tumorangiogenesis preko P38MAPK in ERK signalizacijo [11].

Kot nabavnih regulatornih genov NRP1 so transkripcijski faktorji SP1 /3 in AP1 regulira izražanje NRP1 [ ,,,0],12]. Nekatere raziskave so pokazale, da butirat zavira izražanje nevropilin I v debelega celičnih linijah s pomočjo zaviranja s servisnim paketom SP1 transaktivacije [13].

MicroRNAs (miRNAs), so v dolžino nekodirajoče RNA molekule približno 21-23 nukleotidov, ki uravnavajo izražanje genov na ravni post-transkripcijski [14] [15] [16]. miRNA izraz profiliranje analize so pokazale globalno navzdol regulacijo ravni zrel miRNA v osnovnih človeških tumorjih relativno do zdravega tkiva [17], [18]. Tako lahko miRNAs delujejo kot tumorskih razbijal ali onkogenov in dysregulated miRNA izražanja lahko prispevajo k tumorskih celic metastaz. Še vedno ni jasno, ali lahko miRNAs regulira izražanje NRP1; Zato smo želeli določiti ciljne miRNAs za NRP1. Dodatne funkcije NRP1 se lahko odkrijejo s preučevanjem ciljne miRNAs za NRP1.

Materiali in metode

Human vzorci tkiva in celičnih linij

Ta študija uporabljene sveže tkiva, vključno z 41 človekovih želodca vzorcev raka in 24 vzorcev iz sosednjih zdravega tkiva sluznice, ki izhajajo iz 41 bolnikih, ki so operirani na drugem odvisnimi bolnišnici Chongqing Medical University med letoma 2012 in 2013. Ta študija je bila izvedena v skladu s "biomedicinske raziskave, ki vključujejo človeške Review etiko (Pogojno) "uredba ministrstva za zdravje in Helsinški deklaraciji o etičnih načelih za zdravstvene raziskave, ki vključujejo ljudi. Vsi vzorci so bili pridobljeni s privolitvijo bolnikov in poskuse je odobril revizijski odbor institucionalne Drugega odvisnimi bolnišnici Chongqing Medical University. Vsi udeleženci ob predložitvi pisnega soglasja, da sodelujejo v tej študiji

SGC-7901, HGC-27, AGS, so MKN-45 in N87 celičnih linij, pridobljenih iz American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , ZDA) in celična linija GES-1 je bila kupljena od Type Culture Collection kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska). Celične linije smo kultivirali v RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah ZDA), dopolnjenem z 10% fetalni goveji serum (FBS) in inkubiramo pri 37 ° C s 5% CO2.

premazi, RNA izolacija in zaznavanje miRNK

primerji za pokoj-338-3p in U6 so bili izdelani s pomočjo miScript Primer Analiza kit (Qiagen Dusseldorf Nemčija). Sekvence v miRNAs, ki se uporabljajo v tej študiji, so bili naslednji: Mir-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG in U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Je reverzne primerje uporabimo tudi v obratnem stopnji transkripcije. Skupaj miRNA je bila vzeta iz gojenih celic in primerkov človeških tkiv uporabo RNAiso za majhne RNA (Takara Bio, Otsu, Japonska) v skladu z navodili proizvajalca. repi poli-A dodamo k miR-338 in U6 z miRNA reakcije Buffer Mix (Takara Bio) in nato cDNA smo sintetizirali od 5 ng celotne RNK z uporabo Mirne PrimeScript RT encimske zmesi (Takara Bio). PCR v realnem času je bila izvedena v sistemu CFX96 PCR v realnem času Detection (Bio-Rad) z SYBR premiks Ex Taq II (Takara Bio). Pogoji PCR so bili 95 ° C za 30 sekund, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 5 sekund in 60 ° C za 30 sekund. Podatke smo normalizirali proti U6 snRNA. Po pomnoževanju je bila analiza melting curve opraviti za potrditev specifičnost izdelkov.

pcDNA Expression plazmidi in plazmida Transfekcija

ORF zaporedje NRP1 smo pomnožili iz genomske DNA, izolirani iz AGS celice linija, in regija ORF v cDNA NRP1 je nato subklonirali v GV230 vektor (GeneChem Corporation, Šanghaj, Kitajska) .The plazmid smo transfektirali v letnem pregledu rasti in MKN45 celic z uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-štiri ure po transfekciji je celice so bile uporabljene za reševanje eksperiment. AGS celice, ki so stabilno transfektirane s NRP1 so bile izbrane z 2 ug /ul puromicina (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francija), 48 ur po transfekciji.

miRNA Gene Kloniranje in zunajmaternična Expression

človek miR-338 gen je bil PCR pomnožili od normalnega genomske DNA in klonirali v lentivirusni vektor. V lentiviruses so jih ustvari kotransfekcijo za HEK293T celic s plazmidi PGC-LV, pHelper 1,0 in pHelper 2,0 uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virusi požanjemo 48 h naknadno transfekciji in okužbe smo izvedli v prisotnosti 2 mg /ml polybrene (GeneChem Corporation). Nadzor miRNA strup je bila kupljena od GeneChem Corporation (Shanghai, Kitajska). AGS celice, ki so trajno okuženih z miR-338 so bile izbrane z 2 ug /ul puromicina (Invitrogen), 48 ur po okužbi.

Gene Expression s RNA-Interference
rasklapanje

NRP1 izraz, ki ga AGS celice so utihnile s transfekcijo naslednjih ciljnih siRNA sekvenc (Sangon Biotech, Šanghaj, Kitajska), z Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (kjer ni določena, je bila uporabljena siRNA). Nadzor siRNAs (SOP) je nastalo z uvedbo 4 substitucijo baz v NRP1 ciljanje zaporedje (GATAGGTCATGACTGCCC). Oseminštirideset ur po transfekciji je NRP1 izraz pregledal imuno.

luciferaza Reporter Vsebnost

A PsicheckTM-2 Dual-luciferaza miRNA ciljni vektor za izražanje je bila uporabljena za 3'UTR luciferazni testih (Sangon Biotech, Šanghaj, Kitajska). Ciljna onkogena Mirna-338 je bil izbran na podlagi spletnega ciljne microRNA http://www.microrna.org/microrna/home.do~~pobj baze podatkov. V začetnih oligonukleotidov zaporedja za divjega tipa 3'UTR je bil naslednji: naprej: 5'CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 "in obratno 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3". Ker obstajata dve vezave mest v NRP1 3'UTR, smo oblikovali dva grundirne sekvence za mutirane 3'UTR. Za eno mutiranim 3'UTR, so primerji zaporedja naslednje: naprej: 5'GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 ", in obratno: 5'GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3". Za druge mutantov 3'UTR, so bili naslednji temeljni premaz zaporedja: naprej: 5'GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 ", in obratno: 5'GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3". Za luciferazni test je bil Lipofectamine 2000 uporabljena za cotransfect MKN45 celice z HSA-miR-338 in PsicheckTM-2 Dual-luciferaza miRNA ciljno izražanje vektorji vsebujejo divjim tipom ali mutant ciljne sekvence. Firefly merimo luciferazno aktivnost z Dual luciferazni test (Promega, Madison, WI, ZDA) 18 ur po transfekciji in rezultati so bili normalizirani proti Renilla luciferaze. Vsak reporter plazmid smo transfektirali vsaj trikrat (na različnih dnevih), in vsak vzorec smo testirali v trojniku.

preživetje celic in Clonability Testi

transficirane celice smo zasejali v 96-vdolbinami z gostoto 1 × 10 ^{4 celic /dobro. Raztopina MTT (20 ul 5 mg /ml MTT) smo dodali kulturam (za skupno prostornino 200 ul) in inkubirali 4 kapo 37 ° C. Po odstranitvi gojišča so preostale kristale raztopimo v DMSO, in smo izmerili absorbanco pri 570 nm. Za testu tvorbe kolonije smo celice zasejali z nizko gostoto (1000 celic /ploščo) in pustimo, da raste dokler se pojavile vidne kolonije. Celice smo nato obarvamo z Giemsa in preštejemo kolonije.}

migracije in vdora Testi

transwell migracijske teste na 10 x 10 ^{4 celice zasadimo v zgornji komori s prevleko ne membrane (24-dobro vstaviti; 8 mm velikost por; BD Biosciences). Za invazijo testih 2 x 10 5 celice zasadimo v zgornji komori s Študiie obložena membrano (24 vdolbinami vložka; 8 mm, velikost por, BD Biosciences). Pri obeh testih smo celice prekrita v mediju brez seruma, in srednje dopolnjen z 10% seruma uporabimo kot chemoattractant v spodnjem prostoru. Celice inkubiramo 16 ur pri 37 ° C in 5% CO2 v inkubatorju v tkivnih kultur. Po 16 urah so brez preseljene /celice nenamenski vdrla odstrani iz zgornje strani membranskega filtra transwell vložki na uporabo tamponov, bombaža konico. So prehajali /napadel celice na spodnjih straneh vložkov smo obarvali z Giemsa in preštejemo celice.}

Protitelesa

protitelesa proti fibronektin vimentina, N-kadherina, E-kadherina, POLŽ in GAPDH so bili kupljeni od Santa Cruz Biotechnology (CA, ZDA). Fosfo-Erk1 /2, fosfo-Akt, in fosfo-P38MAPK so bile kupljene od Abcam (Cambridge, UK), in skupno Erk1 /2, Akt, in P38MAPK bilo iz BD Biosciences (ZDA). Protitelo proti NRP1 je bila kupljena iz R & D Systems (Minneapolis, MN, ZDA), in HRP (hrenovo peroksidazo) označenih s kozo proti mišjim IgG in HRP-konjugirano kozje anti-zajec IgG so bili kupljeni od Santa Cruz Biotechnology

imunoblot

Skupaj protein je bila vzeta iz transfektiranih celic, ki uporabljajo Ripa lize pufra (Beyotime, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. Potem ko so bile proteinske ekstrakte celih celic količinsko s testom BCA beljakovin so enakovredne zneske celičnih lizatov rešiti z 10% SDS poliakrilamidno gelsko elektroforezo in jih prenese na poliviniliden fluorida membrano, ki je bil nato blokiran v mleku 5% nemastnega pri TBST 1 uro pri 4 ° C. So blots smo nato inkubirali s primarnimi protitelesi. Po inkubaciji s HRP-konjugiranih sekundarnih protiteles, so proteinski trakovi vizualiziramo z uporabo okrepljenega kemiluminescenco reagenta (Millipore, Billerici, MA, ZDA). Uporabljene so bile naslednje razredčitve protiteles: anti-fibronektin, 1:200; anti-vimentin, anti-E-kadherina in anti-N-kadherina, 1:1200; anti-POLŽ in anti-GAPDH, 1:500; anti-fosfo-Erk1 /2, anti-fosfo-Akt, in anti-fosfo-P38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-skupno Erk1 /2, anti-Akt, in anti-P38MAPK, 1:500; in HRP konjugiranih IgG, 1:7000.

ksenotransplantskih Experiments

Moški gole miši 6 do 8 tednov starosti, pridobljenih s poskusnimi Center živali Chongqing Medical University in so aklimatizirajo za 2 tedne. Ta študija je bila izvedena dosledno v skladu s priporočili v navodilih za nego in uporabo laboratorijskih živali iz Chongqing Medical University. Protokol je odobril Odbor za etiko o poskusih na živalih v Chongqing Medical University. Vse operacije so bile izvedene v skladu z natrijevim pentobarbital anesteziji, in si je prizadevala za zmanjšanje trpljenja. Enako število AGS celic (10 ^{6), s prisilnim izražanjem miR-338 ali nadalj-miR, z ali brez NRP1 obnovo, smo suspendirali v 100 ul PBS in injicirali subkutano v zadnji desni bok vsaki miši (10 miši ) na skupino rast .Tumor je dnevno spremljati v vsaki skupini. Volumen tumorja smo izračunali z uporabo formule V = 1/2 a × b2, kjer je najdaljši tumorske os, in b je najkrajša tumor os. Miši smo usmrtili 5 tednov kasneje in tumorji so bile razdeljene na dva dela. En del je bil določen v formalinom za nadaljnjo imunohistokemičnim analizo, drugi del pa je ohranjen v liquidnitrogen za zahodni odtisi ali QRT-PCR.}

Imunohistokemija

tumorjev ohranjeni v formalinu so bili dani v parafinske bloke in deljiva na pozitivno nabitih mikroskopskih diapozitivov. Oddelki so deparaffinized v ksilen, hidrirani v razvrstijo alkohola in obdelamo za pridobivanje antigena v citratnega pufra 20 minut pri 98 ° C parnik (CD34 in NRP1). Oddelki so inkubirali pri 4 ° C čez noč s CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) in NRP1 (1:100 R & D Systems). Imunskim barvanjem je bila izvedena s pomočjo Detection Kit UltraSensitive S-P (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, Kitajska), in barva je bila razvita s pomočjo DAB kit (PW017, Sangon Biotech, Šanghaj, Kitajska) .Subsequently, so odseki jih nasprotno s hematoksilinom. Diapozitivi so nato obarvali s H &. E za oceno morfologije

Količinska Imunohistokemijsko Stain Intenzivnost

Za določitev gostote tumor microvessel pet naključno izbranih svetlem mikroskopske slike (povečava 40 x; območje 0.89 mm ^{2) na vzorcu smo dobili, kot je opisano zgoraj, in pozitivno obarvajo microvessels preštejemo s programom ImageJ. Rdeča kanal, ki ustreza CD34 barvanjem, smo izolirali in digitalizirane v binarno sliko, s črno kaže obarvajo žile in belo kaže, da ni madeže. Plovila z lumnov so digitalno zapolniti, in kompozitni D-MVA kvantitativno. Uporaba programa ImageJ so rjave barve slike, specifični za DAB obarvanje pridobljeni z barvo Opadanje makro. Vse vrednosti intenzitete v isti skupini so bili v povprečju za izračun razmerja med različnimi skupinami.}

Statistična analiza

SPSS 17.0 programska oprema je bila uporabljena za statistično analizo. Podatki so predstavljeni kot sredstvo ± standardno deviacijo (SD). Primerjave skupine so bile izvedene z uporabo t-test. Razlike so bile upoštevane značilno pri p <. 0,05

Rezultati

MIR Izbor

Da se vključi v naši poznejši analizi, je beljakovinski cilji NRP1 se konkordantno napovedujejo vsaj tri od naslednjih štirih napoved orodij: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan /index.html) in miRDB (mirdb.org/miRDB/). Temelji na različici izdaje januar 2012, smo ugotovili 11 microRNAs da lahko ciljno NRP1. Imeli smo že ugotovila več miRNAs neobičajno, izražene v raka želodca, ki uporabljajo gensko čip [19] (Tabela 1). Na podlagi zgoraj navedenih dveh, smo napovedali pridobivalnem Mirna za NRP1: miR-338

miR-338 je zelo urejeno želodčnega raka tkiv in celic Lines

Če želite raziskati vlogo Mir. -338 želodčnega razvoju človeškega raka, smo izmerili raven svoje izražanja v 41 človeških želodčne vzorcev raka in 24 sosednjih normalnih vzorcev sluznice. Po analizi QRT-PCR, je bila stopnja miR-338 ekspresijo znatno zmanjša pri tumorskih tkivih v primerjavi s sosednjimi normalnih sluznici tkiva (sl. 1A). Poleg tega je miR-338 ekspresijo zmanjšal v želodčni rak celičnih linij (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 in N87) v primerjavi z običajnim želodčne sluznice celične linije (GES1) (slika 1B). Ti rezultati kažejo, da je miR-338 navzdol urejeno v želodčnih rakavih celic, je ugotovitev, da bi lahko bile pomembne za želodčne razvoj človeškega raka.

miR-338 Neposredno cilji onkogeni NRP1

NRP1 je bil poročali, da je pomembna molekula, ki poganja želodca migracije in invazijo raka. Uporaba orodja za napovedovanje, smo predvidevali, da je bil cilj miRNA za NRP1 miR-338. Da bi še dodatno potrjujejo, da miR-338 neposredno namenjen onkogensko NRP1, smo izvedli luciferazo reporter teste, da preveri, ali miR-338 komunicira neposredno s ciljno onkogenih NRP1. Identificirali smo dva potencialna vezavna mesta za pokoj-338 na 3'UTR v NRP1 mRNA. Da bi ugotovili, ali je NRP1 ureja miR-338 z direktno vezavo na 3'UTR NRP1, smo zgradili vrsto 3'UTR fragmentov, vključno s polno dolžino divjega tipa NRP1 3'UTR, zavezujoče stran 1 mutanta in zavezujoč mestu 2 mutant (sl. 2A). Ti delci so nato vstavili v psiCHECK2 luciferazno reporterskega plazmida v. Ugotovili smo, da je sodelovanje transfekciji miR-338 in divjega tipa NRP1 3'UTR povzročila znatno zmanjšanje luciferazno enot, v primerjavi s kontrolno skupino. Vendar pa so-transfekciji miR-338 in mutiranega NRP13'UTR ni povzročil znižanje luciferaza enotah (sl. 2B). Ti rezultati kažejo, da miR-338 ciljev NRP1 neposredno.

miR-338 zavira želodca Cancer Cell migracije, invazije in orožja in spodbuja apoptozo s NRP1

Da bi preučili funkcionalni pomen miR-338 prekomerno raka želodca, smo okužene želodčne linije AGS rak celic in MKN45 z LV-HSA-MIR-338. V primerjavi z ekspresijo nadalj-miR je miR-338 značilno prekomerno v AGS in celičnih linij MKN45 po okužbi z LV-HSA-MIR-338 (slika 3A). tudi Ugotovili smo, da je v primerjavi z nadalj-MIR, bistveno je izraz NRP1 navzdol urejena v letnem pregledu rasti in celičnih linij MKN45 po okužbi z LV-HSA-MIR-338 (slika 3B). Celice s prisilnim ekspresije miR-338 razstavljena znatno zmanjšal proliferacijo v primerjavi s celicami z umetnim ekspresije nadalj-miR (slika 3C). Za miR-338-okužene celice razstavljena tudi zmanjšano tvorbo kolonije sposobnost: število žarišč v miR-338-izražajo celic je znižala v primerjavi z nadaljevanje-miR-okuženih celic (slika 3D). Migracije transwell in poskusa vdora v Matrigel je pokazala, da miR-338 bistveno zmanjša migracije in invazijo zmogljivosti letnem pregledu rasti in MKN45 celic (Slika 3E). The-fluorescenca aktivirana celica sortiranje analiza (FACS) je pokazala, da je prisilno izražanje miR-338 vodi do rakavih celic apoptoze želodca. Odstotek vseh apoptotskih celic (zgodnje apoptotske + pozno apoptotske) v odgovor znatno povečal za 11% na miR-338 prekomerno primerjavi z nadalj-miR prekomerno v AGS celicah. so opazili 10% povečanje števila apoptotskih celic v MKN45 celic z miR-338 prekomerno primerjavi z nadalj-miR (Slika 3F). miR-338 lahko regulira ekspresijo NRP1 neposredno inhibicijo NRP1 prepis ali drugih posrednih vezja, zato smo poleg preveriti, ali bi zmanjšanje NRP1 izražanja razložiti zaviranje želodčne migracije rakave celice, invazije in širjenja opazili po prisilni izražanje miR- 338. Zato smo prisiljeni izražanje miR-338 v AGS celic skupaj s konstruktom, ki vsebuje NRP1 kodiranje zaporedja, vendar nimajo 3'UTR na NRP1 mRNA. Kot rezultat, ta konstrukt dale NRP1 mRNA, ki je odporen na miR-338. Ugotovili smo, da so migracije želodčni karcinom, invazija, proliferacijo in apoptozo obnovljena v skladu celic AGS s prisilnim miR-338 izražanja in NRP1 obnove (Slika 3G-3J). Ti rezultati kažejo, da miR-338 zavira želodčni rak celic migracijo, invazijo in proliferacijo in spodbuja apoptozo z usmerjanjem NRP1.

Vpliv miR-338 na signalnih poti v AGS Celice

Kot ne- tirozin-kinaze receptorja, NRP1 lahko zmerno povečanje ekspresije fosforilacijo Erk1 /2 Akt in P38MAPK spodbujajo celično proliferacijo tumorja in metastaz, kot tudi, da se omeji apoptoze in imunske odzive. Ker NRP1 je ciljna nadaljnji miR-338, smo predpostavili, da bi miR-338 zmanjša ekspresijo fosforilacijo Erk1 /2 Akt, in P38MAPK. Ugotovili smo, da prisilno izraz miR-338 inhibira fosforilacijo Erk1 /2, vendar je relativna stopnja izraz celotne Erk1 /2 ni pomembno spremenila. miR-338 lahko zmanjša tudi fosforilacijo P38 MAPK in Akt (slika 4A). miR-338 lahko veže 3'UTR v NRP1 mRNA za urejanje fosforilacijo ERK1 /2, Akt in P38MAPK; Vendar pa nismo vedeli, ali bi miR-338 veže 3'UTRs drugih genov, da bi dosegli enak učinek. Tako je bilo reševanje eksperiment izvedli, in obnova NRP1 izražanja je bila potrjena z analizo imunoblot (slika 4B). Ugotovili smo, da je raven fosforilacijo Erk1 /2, Akt in P38MAPK niso bistveno spremenila v AGS celic s prisilno miR-338 izražanja in NRP1 obnove (slika 4C). Zato sklepamo, da miR-338 ureja fosforilacijo ERK1 /2, P38 MAPK in Akt preko NRP1.

miR-338 Določa epitelijskih fenotip želodčnega raka

EMT je pomemben mehanizem povezana z invazivnosti raka in metastaz. Pojav EMT je definirana kot prehod epitelnih celic fibroblastoid- ali mezenhimskih podobnih celicah. EMT je označena z izgubo epitelijskih označevalcev in pridobitvijo mezenhimskih komponent. E-kadherina, occludin in citokeratinskim se navzdol reguliranih med EMT, ker N-kadherina, vimentina, fibronektin in polža se molekul. NRP1 pa se povečuje signalizacijo preko treh glavnih poti, ki so bile povezane z EMT, tj, TGF-β, Hh in HGF /cMet. Da bi našli vlogo NRP1 pri ohranjanju mezenhimskih fenotip želodčnih celic, smo podrli izraz NRP1 jih RNA interference (RNAi) (sl. 5A) in preučila izražanje mezenhimskih markerjev, kot so fibronektin vimentina, N-kadherina in POLŽ, kot tudi epitelijska dvojno podajo E-kadherina, v AGS celicah. Ugotovili smo, da so stopnje izraženosti fibronektina, vimentina, N-kadherina in polž zmanjšal ampak izraz E-kadherina je v-NRP1 osiromašenega tumorskih celic (sl. 5B) poveča. Rezultat kaže, da lahko NRP1 voziti EMT proces rakom želodca. Ker NRP1 je ciljna nadaljnji miR-338, smo predpostavili, da bi miR-338 določi epitelne fenotip raka želodca. Če želite ugotoviti, ali so molekularne spremembe, značilne nižje EMT je prišlo v miR-338-izražajo celic, smo pregledali izraz mezenhimskih in epitelnih označevalcev v AGS celicah. Analiza imunoblot pokazala, da so stopnje izraženosti fibronektina, vimentina, N-kadherina in polž v AGS celic s prisilno ekspresije miR-338 zmanjšalo. Poleg tega je prisiljen izraz miR-338 povečala ekspresijo E-kadherina v celični liniji AGS, medtem ko so celice-kontrolni okuženih ostala E-kadherina negativna. Ugotovili smo, da miR-338 uredila fosforilacijo ERK1 /2, P38 MAPK in Akt preko NRP1; Zato je bilo treba ugotoviti, ali bi miR-338 urediti EMT preko NRP1. Analiza imunoblot je pokazala, da je bila ekspresija zgornjih mezenhimskih označevalcev v miR-338-izražajo celic povrne v normalno ravni obnove NRP1 izražanja (sl. 5C). Skupaj ti rezultati pokazali, da bi lahko miR-338 zavira EMT preko NRP1 v želodčnih rakavih celic.

miR-338 Zmanjša rast tumorja in Zavira D-MVA z usmerjanjem NRP1 V Vivo

na podlagi opaženih zmanjšanjem selivk, invazivne in proliferacije vedenja v letnem pregledu rasti in MKN45 celic, okuženih z LV-HSA-MIR-338, bomo naslednjič raziskovali vlogo miR-338 v rasti in vivo. Mi subkutano inokulirali golih miših z enakimi številkami (1 × 10 ^{6 celic na miški) za AGS celic s prisilno izražanje miR-338 ali nadalj-MIR, z ali brez NRP1 obnovo. Incidenca Tumor je bila ocenjena štirinajstdnevnika, in tumorji pojavil v vseh miši. miR-338 izraz v golih tumorjev miši smo merili z QRT-PCR, in smo ugotovili, da miR-338 izraz v tumorjev, ki prekomerno MIR-338 (slika 6A) znatno povečal. Prisilno izraz miR-338 znatno inhibira rast tumorjev in vivo, vendar prevelike količine NRP1 bi ponovna rast tumorja (slika 6B). Dalje, smo pregledali NRP1 izraz v golih mišjih tumorjev z Western Blot in imunohistokemijo. Ugotovili smo, da NRP1 izraz bistveno zmanjšala v tumorjev, ki prekomerno MIR-338; Vendar pa je bila NRP1 izraz obnovljena v tumorjev, ki prekomerno NRP1 (slika 6C, 4D). Tako smo sklepati, da miR-338 inhibirana rast tumorja z omejevanjem NRP1 izražanja in vivo. NRP1 lahko spodbudi tumorangiogenesis; Zato smo predpostavili, da bo prisiljen izraz miR-338 zavirajo tumorangiogenesis preko NPR1. Imunohistokemijsko za CD34 je bila uporabljena za oceno številko in morfološke značilnosti krvnih žil v vsaki tumorja. Plovila so našteti s štetjem števila objektov z diskretno obarvane v vsakem področju, ne glede na velikost posode ali prehodnosti. Plovila v tumorjev, ki prekomerno MIR-338 je bilo subjektivno manj kot nadaljevanje-miR-prekomerno ekspresijo tumorje; Vendar pa je bila obnovljena število plovil v tumorjev, ki prekomerno NRP1 (slika 6E). Analizirali smo digitalizirano mikrovaskularna področje (D-MVA) za vgradnjo velikosti plovil in prehodnosti v našo analizo vaskulature tumorja z zagotavljanjem oceno integriranega svetilnosti območju in verjetno pravokotno pretok krvi v oddelku tumorja. D-MVA se je zmanjšala v MIR-338 prekomerno tumorjev. Na naše presenečenje smo ugotovili, da NRP1-prekomerno tumorji se ni bistveno kažejo povečano angiogenezo, vendar pa je zmanjšanje D-MVA zaradi miR-338 čezmernega je bila obnovljena leta tumorjev, ki prekomerno NRP1 (Slika 6F in 6g). Mi špekulirajo, da je NRP1 izraz že povečana pri raku želodca, tako da še naprej prekomerno NRP1 ni mogoče bistveno povečati tumorja žilja, vendar se lahko obnovi tumorja žilja, ki je bila zmanjšana za pokoj-338. Ti rezultati so pokazali, da miR-338 zmanjšuje rast tumorjev in zavira D-MVA z usmerjanjem NRP1 vivo.}

Pogovor

Uporaba genskih čipov in bioinformatiko, smo predvidevali, da je bil cilj miRNA za NRP1 miR -338. Raziskave so pokazale, da je izraz miR-338 se razlikuje v različnih tumorjev. Huang XH sod. je pokazala, da miR-338-3p zatreti jeter rakavih celic invazijo z usmerjanjem gladka [20]. Poleg tega je v melanomov, miR-193.a, miR-338, in so bili prikazani miR-565, ki se underexpressed pri bolnikih z BRAF mutacije [21]. Iz teh podatkov smo sklepali, da bi miR-338 deluje kot tumorski supresorski. Ni objavljene literature o tem, ali je miR-338 underexpressed raka želodca. V naši raziskavi, so ekspresijski nivoji miR-338 prva izmerjena pri 41 človeške želodčne vzorcev z rakom in 24 vzorcev sosednjih normalnih sluznici tkiv. Nato smo ocenili ekspresijo miR-338 v petih želodčnih raka celičnih linijah in v normalnih želodčne sluznice celičnih linij. Ugotovili smo, da je bila ekspresija miR-338 navzdol urejeno tako tumorskih tkiv in rakavih celic prog. Poleg tega bi lahko prekomerno miR-338 zavirajo migracijo želodčni rak celic, invazijo in razmnoževanje, in spodbujajo apoptozo. Medtem, lahko te kancerogen kakovosti, ki se v celoti obnovljena s NRP1 prekomerno. Poleg tega luciferazne reporter testi kažejo, da miR-338 tarče NRP1 neposredno. Tako sklepamo, da MIR-338 deluje kot potencialni zaviralnih na raka želodca, funkcijo, ki je dosežena z omejevanjem izražanja NRP1.

Kot non-tirozin-kinaze receptorja, NRP1 lahko nekoliko poveča izraz fosforilacijo Erk1 /2 Akt, in P38MAPK. M Akagi sod. ugotovljeno, da je zaviranje NPR-1 zmanjša ekspresijo fosforilacijo Erk1 /2 Akt, in P38MAPK [22]. Poleg tega je raziskava pokazala, da je bila ekspresija ERK1 /2 fosforilacijo navzgor regulirano v NRP-1-prekomerno ekspresijo celic [23]. V tej študiji smo ugotovili, da lahko prekomerno miR-338 zmanjša ekspresijo fosforilacijo Erk1 /2 Akt, in P38MAPK, učinek, ki se je obrniti na NRP1 obnovo. Aktivacija ERK, Akt in P38MAPK v povezavi s preživetjem apoptoza odpornost /celico je dobro dokumentirana v različnih modelnih sistemih [24], [25], [26].

• Plos ONE: Razmerje med P53 statusu in odziva na kemoterapijo pri bolnikih z želodčnim rakom: Meta Analysis
• Plos ONE: Izražanje družine ESPG želodčnega raka: downregulation za HER4 in njenega Aktiviranje ligand NRG4