Nrp1 als multifunctionele non-tyrosine-kinase receptoren spelen cruciale rol in de progressie van de tumor. MicroRNAs (miRNAs) zijn een belangrijke klasse van doordringende genen die betrokken zijn bij verschillende biologische functies, met name kanker. Het blijft onduidelijk of miRNAs de expressie van Nrp1 kan reguleren. Het doel van deze studie was miRNAs die de groei, invasie en metastase van maagkanker kan remmen doelwit Nrp1 expressie te identificeren. We vonden dat miR-338 expressie werd verminderd bij maagkanker cellijnen en weefsels bij maagkanker. Bovendien vonden we dat miR-338 remde maagkanker celmigratie, invasie, proliferatie en apoptose bevorderd door doelgerichtheid Nrp1 expressie. Als een upstream regulator van Nrp1, miR-338 rechtstreeks richt Nrp1. De geforceerde expressie van miR-338 remde de fosforylering van Erk1 /2, P38 MAPK en Akt; De uitdrukking van gefosforyleerd Erk1 /2, P38 MAPK en Akt werd hersteld door overexpressie van Nrp1. In AGS cellen geïnfecteerd met miR-338 of getransfecteerd met SiNRP1, de eiwitniveaus van fibronectine, vimentine, N-cadherine en slak daalden, maar de expressie van E-cadherine werd verhoogd. De expressie van mesenchymale markers in miR-338-cellen tot expressie werd hersteld tot normale niveaus door opnieuw Nrp1 expressie. In vivo Citation:. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) MicroRNA-338 remt groei, invasie en uitzaaiing van maagkanker door zich te richten Nrp1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10.1371 /journal.pone.0094422 Editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan Ontvangen: 18 oktober 2013; Aanvaard: 16 maart 2014; Gepubliceerd: 15 april 2014 Copyright: © 2014 Peng, et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. Dit werk werd gesteund door het project van Science and Technology Committee in het district Shapingba Chongqing (201.302). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie Neuropilins, waaronder neuropilin1 (Nrp1) en neuropilin2 (NRP2) zijn multifunctionele niet-tyrosine-kinase receptoren die eerst werden geïdentificeerd op basis van hun cruciale rol in het zich ontwikkelende zenuwstelsel [1]. Nrp1 en Nrp2 hebben 44% homologie en delen vele structurele en biologische eigenschappen. Nrp1 bestaat voornamelijk in bloodvesselendothelia en NRP2 komt voornamelijk voor in lymfevaten [2], [3]. Latere onderzoeken geïdentificeerd NRP-1 als een receptor voor de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) -A isovorm VEGF-165 zowel endotheelcellen en sommige tumorcellen [4], [5]. Onderzoek heeft aangetoond dat Nrp1 is opwaarts gereguleerd in meerdere tumortypen en wordt uitgedrukt in verschillende tumor vasculatures [3], [6], wat suggereert dat Nrp1 speelt een cruciale rol in tumorprogressie. Vroeg onderzoek blijkt dat Nrp1 kunnen hebben voor de groei van tumoren als een coreceptor van VEGFR [5]. Wetenschappers ontdekten later dat Nrp1 zou kunnen stimuleren tumorangiogenesis, versnellen tumorgroei en beteugelen tumor apoptose zonder VEGFR [7]. Nrp1 een coreceptor van andere groeifactoren, die verduidelijkt waarom VEGF kan signaleren door middel neuropilins in afwezigheid van VEGFR-1 of VEGFR-2 [8] zijn [9]. Als een coreceptor van TβRI /TβRII, kan Nrp1 tumor apoptose te beteugelen en te versnellen tumorgroei via zowel canonieke en niet-canonieke signalering [10]. Nrp1, als co-receptor van PDGFR /cMet, kan stimuleren tumorangiogenesis via p38MAPK en ERK signalering [11]. Als stroomopwaarts regulerende genen van Nrp1, de transcriptiefactoren sp1 /3 en AP1 kan de expressie van Nrp1 reguleren [ ,,,0],12]. Sommige onderzoek heeft aangetoond dat butyraat onderdrukt de expressie van neuropilin I colorectale cellijnen door remming van Sp1 transactivatie [13]. MicroRNAs (miRNAs) niet-coderende RNA-moleculen ongeveer 21-23 nucleotiden lang die genexpressie op post-transcriptioneel niveau [14], [15], [16]. miRNA expressie profilering analyses hebben een wereldwijde down-regulatie van volwassen miRNA niveaus in primaire menselijke tumoren ten opzichte van normale weefsels [17], [18] onthuld. Aldus kan miRNAs functioneren als tumor suppressors of oncogenen en ontregelde miRNA expressie kan bijdragen tot tumorcelmetastase. Het blijft onduidelijk of miRNAs de expressie van Nrp1 kan reguleren; Daarom hebben we geprobeerd om de doelstelling van miRNAs Nrp1 bepalen. Extra functies van Nrp1 kunnen worden ontdekt door het bestuderen van het doel miRNAs van Nrp1. Human Tissue Monsters en cellijnen In deze studie gebruik gemaakt van verse weefsels, waaronder 41 menselijke maag-samples kanker en 24 monsters van aangrenzend normaal slijmvliezen afgeleid van 41 patiënten die een operatie tussen 2012 en 2013. Deze studie ondergingen in de Tweede Affiliated Hospital van Chongqing Medical University werd uitgevoerd volgens het 'Biomedical wetenschappelijk onderzoek met mensen ethische beoordeling (Voorlopig) 'regeling van het ministerie van Volksgezondheid en de Verklaring van Helsinki betreffende de ethische beginselen voor medisch-wetenschappelijk onderzoek met mensen. Alle monsters werden verkregen met de geïnformeerde toestemming van de patiënten en de experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Tweede Affiliated Hospital van Chongqing Medical University. Alle deelnemers gaven schriftelijk toestemming om deel te nemen aan deze studie De SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 en de N87 cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , USA), en de GES-1 cellijn werd gekocht van de Type Culture Collection van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). De cellijnen werden gekweekt in RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en werden geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO2. de primers voor miR-338-3p en U6 werden geproduceerd met behulp van de miScript Primer Assay kit (Qiagen Düsseldorf Duitsland). De sequenties van de miRNAs die in deze studie waren als volgt: miR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG en U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. De omgekeerde primers werden gebruikt in de reverse transcriptiestap. Totale miRNA werd geëxtraheerd uit gekweekte cellen en menselijke weefselmonsters gebruikt RNAiso voor kleine RNA (TaKaRa Bio, Otsu, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Poly-A staart toegevoegd aan miR-338 en U6 met de miRNA Reaction Buffer Mix (TaKaRa Bio), en cDNA werd gesynthetiseerd uit 5 ng totaal RNA met de miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (TaKaRa Bio). Real-time PCR werd uitgevoerd in een CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) met SYBR Premix Ex Taq II (Bio TaKaRa). De PCR-omstandigheden waren 95 ° C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 5 s en 60 ° C gedurende 30 s. De gegevens werden genormaliseerd tegen de U6 snRNA. Na amplificatie werd een smeltcurve analyse uitgevoerd om de specificiteit van het product te bevestigen. De sequentie van ORF Nrp1 werd geamplificeerd uit genomisch DNA geïsoleerd uit de cel AGS lijn, en het gebied van de ORF Nrp1 cDNA werd vervolgens gesubkloneerd in de GV230 vector (GeneChem Corporation, Shanghai, China) .De plasmide werd getransfecteerd in AGS en MKN45 cellen met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-vier uur na transfectie, de cellen werden gebruikt voor een reddings experiment. AGS cellen die stabiel werden getransfecteerd met Nrp1 werden geselecteerd met behulp van 2 ug /ul puromycine (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrijk) 48 uur na de transfectie. De menselijke miR-338 gen werd met PCR geamplificeerd uit genomisch DNA en normaal gekloneerd in een lentivirale vector. De lentivirussen werden gegenereerd door cotransfectie van HEK293T cellen met plasmiden pGC-LV, pHelper 1,0 en 2,0 pHelper gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virussen werden geoogst 48 uur na transfectie en infectie werden uitgevoerd in de aanwezigheid van 2 mg /ml polybreen (GeneChem Corporation). Controle miRNA viruse werd gekocht van GeneChem Corporation (Shanghai, China). AGS cellen die stabiel waren geïnfecteerd met miR-338 werden geselecteerd met behulp van 2 ug /ul puromycine (Invitrogen) 48 uur na de infectie. Nrp1 expressie door AGS cellen werd het zwijgen opgelegd door het transfecteren van de volgende gerichte siRNA sequenties (Sangon Biotech, Shanghai, China) met Lipofectamine 2000 (Invitrogen);: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (indien niet gespecificeerd, siRNAwerd gebruikt). Controle siRNA (sic) werden gegenereerd door de invoering van 4 base substituties in Nrp1 targeting-sequentie (GATAGGTCATGACTGCCC). Achtenveertig uur na transfectie werd Nrp1 expressie onderzocht door immunoblotting. PsicheckTM A-2 Dual-Luciferase miRNA doelwit expressievector werd gebruikt voor 3'UTR luciferase assays (Sangon Biotech, Shanghai, China). De doelstelling van oncogen miRNA-338 werd geselecteerd op basis van de online microRNA doeldatabase http://www.microrna.org/microrna/home.do. De primer sequenties voor het wild-type 3'UTR waren als volgt: forward: 5'CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 'en reverse 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3'. Omdat er twee bindingsplaatsen in de Nrp1 3'UTR, ontwierpen we twee primersequenties voor de mutant 3'UTR. Voor een mutant 3'UTR, de primer sequenties waren als volgt: forward: 5'GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'en reverse: 5'GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3'. Voor de andere mutant 3'UTR De primersequenties waren als volgt: voorwaarts: 5'- GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'en reverse: 5'GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. Voor de luciferase assay Lipofectamine 2000 werd gebruikt om cellen MKN45 cotransfect de HSA-miR-338 en PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA doelwit expressievectoren die wildtype of mutant doelsequenties. De vuurvlieg luciferase activiteit werd gemeten met de Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI, USA) 18 uur na transfectie, en de resultaten werden genormaliseerd tegen Renilla luciferase. Elk reporterplasmide werd ten minste drie keer getransfecteerd (op verschillende dagen), en elk monster werd getest in drievoud. De getransfecteerde cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten bij een dichtheid van 1 x 10 4 cellen /putje. Een MTT oplossing (20 pl van 5 mg /ml MTT) werd toegevoegd aan de cultures (voor een totaal volume van 200 ul) en gedurende 4 pet 37 ° C. Na het verwijderen van het kweekmedium werden de resterende kristallen opgelost in DMSO, en de absorptie bij 570 nm werd gemeten. Voor de kolonievorming assay werden cellen uitgezaaid met een lage dichtheid (1000 cellen /plaat) en men laat groeien tot kolonies zichtbaar. De cellen werden daarna gekleurd met Giemsa, en kolonies werden geteld. Voor de transwell migratie assays, 10 x 10 4 cellen werden in de bovenste kamer met een niet-bekleed membraan (24-well inzetstuk; 8 mm poriegrootte, BD Biosciences). Voor de invasie assays, 2 × 10 5 cellen werden in de bovenste kamer met een Matrigel-gecoate membraan (24-well insert; 8 mm poriegrootte; BD Biosciences). Voor beide testen, werden de cellen uitgeplaat in een serumvrij medium, en medium aangevuld met 10% serum werd gebruikt als een chemoattractant in de onderste kamer. De cellen werden gedurende 16 uur bij 37 ° C en 5% CO2 in een weefselkweek incubator. Na 16 uur werden de niet-gemigreerde /niet-binnendringende cellen van de bovenzijde van de transwell membraanfilter inzetstukken verwijderd met wattenstaafje doekjes. De gemigreerde /binnengedrongen cellen aan de onderkant van de inserts werden gekleurd met Giemsa en de cellen werden geteld. antilichamen tegen fibronectine, vimentine, N-cadherine, E-cadherine, SLAK en GAPDH werden gekocht van Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Fosfo-Erk1 /2, fosfo-Akt, en fosfo-p38MAPK werden gekocht bij Abcam (Cambridge, UK), en de totale Erk1 /2, Akt en p38MAPK waren van BD Biosciences (USA). Een antilichaam tegen Nrp1 werd verkregen van R &D Systems (Minneapolis, MN, USA) en HRP (horseradish peroxidase) geconjugeerd geit anti-muis IgG en HRP-geconjugeerd geit anti-konijnen IgG werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology immunoblotting Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit de getransfecteerde cellen met behulp RIPA lysisbuffer (Beyotime, China) volgens de instructies van de fabrikant. Na de hele cellen eiwitextracten werden gekwantificeerd met de BCA eiwit assay, werden equivalente hoeveelheden van cellysaten opgelost door 10% SDS-polyacrylamidegel-elektroforese en werden overgebracht naar een polyvinylideen fluoride membraan, dat vervolgens in 5% vetvrije melk werd geblokkeerd TBST gedurende 1 uur bij 4 ° C. De blots werden vervolgens geïncubeerd met primaire antilichamen. Na incubatie met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen werden de eiwitbanden zichtbaar gemaakt met een verbeterde chemiluminescentie reagens (Millipore, Billerica, MA, USA). De volgende antilichaam verdunningen werden gebruikt: anti-fibronectine, 1:200; anti-vimentine, anti-E-cadherine en anti-N-cadherine, 1:1200; anti-slak en anti-GAPDH, 1:500; anti-fosfo-Erk1 /2, anti-fosfo-Akt, en anti-fosfo-p38MAPK, 1:2000; anti-Nrp1, 1:600; anti-totaal Erk1 /2, anti-Akt en anti-p38MAPK, 1:500; en HRP-geconjugeerd IgG, 1:7000. Xenograft Experimenten Male athymische naakt muizen 6 tot 8 weken oud werden verkregen van de Animal Experimenteel Centrum van Chongqing Medical University en waren gewend voor 2 weken. Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen van de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van Chongqing Medical University. Het protocol werd goedgekeurd door het Comité voor de ethiek van dierproeven van Chongqing Medical University. Alle operaties werden uitgevoerd onder natriumpentobarbital verdoving, en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. Gelijke aantallen AGS cellen (10 6) met geforceerde expressie van miR-338 of cont-miR, met of zonder Nrp1 restauratie gesuspendeerd in 100 pi PBS en subcutaan geïnjecteerd in de rechter achterste flank van elke muis (10 muizen per groep) .Tumor groei werd dagelijks gevolgd in elke groep. Het tumorvolume werd berekend met de formule V = 1/2 a x b2, waarbij a de langste as tumor, en b de kortste as tumor. De muizen werden 5 weken later gedood en de tumoren werden verdeeld in twee delen. Een deel werd gefixeerd in formol voor verdere immunohistochemische analyse, en het andere deel werd bewaard in liquidnitrogen voor westerse blotting of qRT-PCR. Tumoren bewaard in formaline werden in paraffine blokken geplaatst en gesegmenteerd op positief geladen microscoopglaasjes. De plakjes werden van paraffine ontdaan in xyleen, gehydrateerd in gegradeerde alcohol en voorbehandeld antigen herstel in citraatbuffer gedurende 20 min in een 98 ° C stomer (CD34 en Nrp1). De coupes werden geïncubeerd bij 4 ° C geïncubeerd met CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) en Nrp1 (1:100 R &D Systems). Immunokleuring werd uitgevoerd met behulp van de ultragevoelige S-P Detection Kit (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, China), en de kleur werd ontwikkeld met behulp van een DAB-kit (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, China) .Subsequently werden de secties tegengekleurd met hematoxyline. De dia's werden vervolgens gekleurd met H &. E om de morfologie te beoordelen Het kwantificeren van Immunohistochemische Stain Intensity Om de tumor microvaatje dichtheid te bepalen, vijf willekeurig gekozen helderveld microscopische beelden (vergroting 40 ×; area 0,89 mm 2) per monster werden verkregen zoals hierboven beschreven, en de positief gekleurde microvaatjes werden geteld met behulp van het programma ImageJ. Het rode kanaal, wat overeenkomt met CD34 kleuring, werd geïsoleerd en gedigitaliseerd in een binair beeld, met zwarte met vermelding van lood schepen en witte aangeeft dat er geen vlekken. Schepen met lumen werden digitaal gevuld, en een samengestelde D-MVA werd gekwantificeerd. Met behulp van de ImageJ programma, waren bruin gekleurde beelden die specifiek zijn voor DAB kleuring onttrokken door een kleur deconvolutie macro. Alle intensiteitswaarden binnen dezelfde groep werden gemiddeld om de verhoudingen tussen de verschillende groepen te berekenen. SPSS 17.0 software werd gebruikt voor de statistische analyse. De gegevens worden voorgesteld als de gemiddelden ± standaarddeviatie (s.d.). Groep vergelijkingen werden uitgevoerd met t-toets. De verschillen waren significant bij p <beschouwd;. 0.05 Resultaten MIR Selection Om te worden opgenomen in onze verdere analyse, eiwit targets van Nrp1 moesten worden concordantly voorspeld door ten minste drie van de vier volgende voorspelling instrumenten: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan /index.html) en miRDB (mirdb.org/miRDB/). Op basis van de januari 2012 release versie, vonden we 11 microRNAs die potentieel doelwit Nrp1. We hebben eerder geïdentificeerde verschillende miRNAs abnormaal uitgedrukt in maagcarcinoom met een genchip [19] (Tabel 1). Op basis van bovenstaande twee, we voorspelden een upstream miRNA van Nrp1: miR-338 miR-338 is down-Regulated bij maagkanker weefsels en cellijnen Om de rol van miR verkennen. -338 in de maag de ontwikkeling van kanker bij de mens, meten we de niveaus van expressie in 41 menselijke maag-samples kanker en 24 aangrenzende normale slijmvlies monsters. Volgens een qRT-PCR analyse, werd het niveau van miR-338 expressie significant verminderd bij de tumorweefsels in vergelijking met de aangrenzende normale mucosa weefsels (fig. 1A). Daarnaast werd miR-338 expressie verminderd bij maagkanker cellijnen (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 en N87) in vergelijking met de normale maagslijmvlies cellijn (GES1) (Figuur 1B). Deze resultaten suggereren dat miR-338 is down-gereguleerd bij maagkanker cellen, een bevinding die de maag de ontwikkeling van kanker bij de mens van belang kunnen zijn. Nrp1 is geweest rapporteerde een belangrijk molecuul dat maagkanker migratie en invasie drives. Met behulp van voorspelling gereedschappen, we voorspeld dat de doelstelling van miRNA Nrp1 was miR-338. Om verder te bevestigen dat miR-338 rechtstreeks richt oncogen Nrp1, voerden we luciferase reporter assays om te onderzoeken of miR-338 interageert direct met de doelgroep oncogene Nrp1. We identificeerden twee potentiële bindingsplaatsen voor miR-338 in het 3'UTR van het Nrp1 mRNA. Bepalen of Nrp1 wordt geregeld door miR-338 door directe binding aan de 3'UTR van Nrp1 geconstrueerd we een reeks 3'UTR fragmenten, inclusief de volledige lengte wild-type Nrp1 3'UTR, een bindingsplaats mutant 1 en een bindingsplaats 2 mutant (Fig. 2A). Deze fragmenten werden vervolgens in de psiCHECK2 luciferase reporterplasmide. We vonden dat de co-transfectie van miR-338 en het wildtype Nrp1 3'UTR veroorzaakte een significante daling van luciferase eenheden in vergelijking met de controles. Echter, de co-transfectie van miR-338 en de mutant NRP13'UTR geen afname van luciferase-eenheden (fig. 2B) veroorzaken. Deze resultaten suggereren dat miR-338 targets Nrp1 direct. Om de functionele betekenis van miR-338 overexpressie te onderzoeken bij maagkanker, we besmet zijn de maagkanker cellijnen AGS en MKN45 met LV-HSA-mir-338. Vergeleken met de expressie van miR-cont werd miR-338 aanzienlijk overexpressie in de AGS en MKN45 cellijnen na infectie met LV-HSA-mir-338 (Figuur 3A). We vonden ook dat, in vergelijking met cont-miR de expressie van Nrp1 nam significant neerwaarts gereguleerd in de AGS en MKN45 cellijnen na infectie met LV-HSA-mir-338 (Figuur 3B). De cellen met geforceerde expressie van miR-338 vertoonden aanzienlijk gedaald proliferatie in vergelijking met de cellen met geforceerde expressie van cont-miR (figuur 3C). Het miR-338-geïnfecteerde cellen vertoonden ook verminderd kolonievorming vermogen: het aantal foci in de miR-338-tot expressie brengende cellen werd verminderd vergeleken met de cont-miR-geïnfecteerde cellen (Figuur 3D). De transwell migratie en Matrigel invasie assays aangetoond dat miR-338 significante daling van de migratie en invasie capaciteiten van de AGS en MKN45 cellen (figuur 3E). De fluorescentie-geactiveerde celsortering analyse (FACS) toonde dat de geforceerde expressie van miR-338 leidde tot maagkanker apoptose. Het percentage van de totale apoptotische cellen (vroege apoptotische + late apoptotische) met 11% aanzienlijk gestegen in reactie op de miR-338 overexpressie vergelijking met cont-miR overexpressie in AGS-cellen. Een stijging van 10% in het aantal apoptotische cellen werd waargenomen in de MKN45 cellen met miR-338 in vergelijking met overexpressie cont-miR (Figuur 3F). miR-338 kon de expressie van Nrp1 reguleren door direct remmen Nrp1 transcript of andere indirecte circuits, dus we vervolgens nagegaan of de vermindering van Nrp1 expressie de remming van maagkanker cel migratie, invasie en proliferatie waargenomen na de gedwongen uitdrukking van buitenspiegels zou kunnen verklaren 338. dus we genoodzaakt de expressie van miR-338 in AGS cellen samen met een construct die de Nrp1 coderende sequentie maar niet de 3'UTR van het Nrp1 mRNA. Dientengevolge dit construct leverde een Nrp1 mRNA die resistent miR-338 was. We vonden dat maagkanker celmigratie, invasie, proliferatie en apoptose werden gerestaureerd in de AGS cellijn met geforceerde miR-338 expressie en Nrp1 restauratie (figuur 3G-3J). Deze resultaten tonen aan dat miR-338 remt maagkanker cel migratie, invasie en proliferatie en bevordert apoptosis door zich te richten Nrp1. Als een niet- tyrosine-kinase receptor, Nrp1 kan licht verhogen de expressie van de fosforylering van Erk1 /2, Akt en p38MAPK bevorderen tumorcel proliferatie en metastase, alsook de apoptose en immuunreacties beteugelen. Omdat Nrp1 is een stroomafwaarts doel van miR-338, verondersteld dat miR-338 de expressie van de fosforylering van Erk1 /2, Akt en p38MAPK kunnen verminderen. We vonden dat de geforceerde expressie van miR-338 remde de fosforylering van Erk1 /2, maar het relatieve expressieniveau van totaal Erk1 /2 was niet significant veranderd. miR-338 kan ook de fosforylering van MAPK P38 en Akt (figuur 4A) verminderen. miR-338 kon de 3'UTR van het Nrp1 mRNA binden aan de fosforylatie van ERK1 /2, Akt en p38MAPK regelen; Maar we wisten niet of miR-338 de 3'UTRs van andere genen kunnen binden aan een gelijk effect te bereiken. Dus rescue experimenten uitgevoerd, en het herstel van Nrp1 expressie werd bevestigd door middel van een immunoblot analyse (Figuur 4B). We vonden dat de niveaus van fosforylatie Erk1 /2, Akt en p38MAPK werd niet significant beïnvloed in de AGS cellen met geforceerde miR-338 expressie en Nrp1 herstel (figuur 4C). Daarom concluderen wij dat miR-338 regelt de fosforylering van ERK1 /2, P38 MAPK en Akt via Nrp1. EMT is een belangrijk mechanisme geassocieerd met kanker invasiviteit en metastase. Het fenomeen van EMT wordt gedefinieerd als de overgang van epitheelcellen of mesenchymale fibroblastoid--achtige cellen. EMT wordt gekenmerkt door het verlies van epitheliale merkers en het verkrijgen van mesenchymale componenten. E-cadherine, occludin en cytokeratine zijn downregulated tijdens EMT, terwijl N-cadherine, vimentine, fibronectine en slak worden opgereguleerd. Nrp1 verbetert signalering via drie belangrijke routes die zijn gekoppeld aan EMT, d.w.z., TGF-β, Hh en HGF /cMet. Om de rol van Nrp1 bij het instandhouden van de mesenchymale fenotype van maag cellen vinden we neergehaald de expressie van Nrp1 door RNA interferentie (RNAi) (Fig. 5A) en onderzocht de expressie van mesenchymale markers zoals fibronectine, vimentine, N-cadherine en SNAIL, alsmede de epitheliale marker E-cadherine in AGS cellen. We vonden dat de expressieniveaus van fibronectine, vimentine, N-cadherine en slak verminderden maar de expressie van E-cadherine werd verhoogd in de Nrp1 uitgeputte tumorcellen (Fig. 5B). Het resultaat toont aan dat Nrp1 EMT proces kan rijden bij maagkanker. Omdat Nrp1 is een stroomafwaarts doelwit van miR-338, we ervan uitgegaan dat miR-338 de epitheliale fenotype van maagkanker kunnen bepalen. Om te bepalen of de moleculaire veranderingen typisch verlaagde EMT opgetreden in miR-338 tot expressie brengende cellen, onderzochten we de expressie van mesenchymale en epitheliale merkers in AGS cellen. De immunoblot analyse toonde dat de expressieniveaus van fibronectine, vimentine, N-cadherine en slak verminderden in de AGS cellen met de geforceerde expressie van miR-338. Bovendien is de gedwongen expressie van miR-338 verhoogde de expressie van E-cadherine in de AGS cellijn, terwijl de controle geïnfecteerde cellen bleven E-cadherine negatief. We vonden dat miR-338 gereguleerd de fosforylering van ERK1 /2, P38 MAPK en Akt via Nrp1; Daarom was het noodzakelijk om na te gaan of de miR-338 EMT kan regelen via Nrp1. De immunoblot analyse toonde dat de expressie van de bovengenoemde mesenchymale markers in de miR-338-cellen tot expressie werd hersteld tot het normale niveau door opnieuw Nrp1 expressie (Fig. 5C). In totaal hebben deze resultaten toonden aan dat miR-338 EMT kan remmen via Nrp1 bij maagkanker cellen. op basis van de waargenomen afname van migratie, invasieve en proliferatieve gedrag bij AGS en MKN45 cellen geïnfecteerd met LV-HSA-mir-338, vervolgens onderzochten we de rol van miR-338 in groei in vivo. We subcutaan geïnoculeerd naakt muizen met gelijk aantal (1 x 10 6 cellen per muis) of AGS cellen met de geforceerde expressie van miR-338 en miR-cont, met of zonder Nrp1 restauratie. Tumor incidentie werd tweewekelijks geëvalueerd, en tumoren verscheen in alle muizen. miR-338 expressie in het naakt muis tumoren werd gemeten met behulp van qRT-PCR, en we vonden dat miR-338 expressie in de tumoren die miR-338 (figuur 6A) tot overexpressie aanzienlijk toegenomen. De geforceerde expressie van miR-338 remde de tumorgroei in vivo, maar de overexpressie van Nrp1 kan tumorgroei (figuur 6B) herstellen. Vervolgens onderzochten we Nrp1 expressie in het naakt muis tumoren door western blot en immunohistochemie. We vonden dat Nrp1 expressie aanzienlijk gedaald in de tumoren die miR-338 overexpressie; echter, werd Nrp1 expressie gerestaureerd in de tumoren die Nrp1 (figuur 6C, 4D) tot overexpressie gebracht. Zo afgeleid we dat miR-338 remde tumorgroei door het terugdringen van Nrp1 expressie in vivo. Nrp1 kunnen tumorangiogenesis stimuleren; Daarom hebben we de hypothese dat de geforceerde expressie van miR-338 tumorangiogenesis zou remmen via NPR1. Immunohistochemische kleuring voor CD34 werd gebruikt om het aantal en morfologische kenmerken van bloedvaten in elke tumor te evalueren. De schepen werden geteld door het tellen van het aantal structuren met discrete kleuring binnen elk veld ongeacht grootte of doorgankelijkheid schip. De schepen in de tumoren die miR-338 overexpressie waren subjectief minder dan de cont-miR-overexpressie tumoren; Het aantal van de vaten werd hersteld in de tumoren die Nrp1 (figuur 6E) overexpressie. Het gedigitaliseerde microvasculaire gebied (D-MVA) geanalyseerd op maat en patency verblijf nemen in onze analyse van de tumorvasculatuur door een schatting van de geïntegreerde lumen stippellijn vermoedelijk de bloedstroom loodrecht op de tumor sectie. De D-MVA werd gereduceerd in de miR-338 overexpressie tumoren. Tot onze verbazing, vonden we dat Nrp1-overexpressie tumoren niet significant tonen verhoogde angiogenese, maar de daling van de D-MVA als gevolg van miR-338 overexpressie werd gerestaureerd in de tumoren die Nrp1 (figuur 6F en 6G) tot overexpressie gebracht. We speculeren dat Nrp1 expressie reeds maagkanker werd opgereguleerd, zodat verdere overexpressie Nrp1 niet significant toenemen tumorvasculatuur maar tumorvasculatuur die is verminderd met miR-338 herstellen. Deze resultaten gaven aan dat miR-338 vermindert tumorgroei en onderdrukt D-MVA door zich te richten Nrp1 in vivo. Met behulp van gen-chips en bioinformatica, we voorspeld dat de doelstelling van miRNA Nrp1 was miR -338. Onderzoek heeft aangetoond dat de expressie van miR-338 varieert in verschillende tumoren. XH Huang et al. toonde aan dat miR-338-3p onderdrukt leverkanker cel invasie door zich te richten smoothened [20]. Bovendien, in melanomen, miR-193a, miR-338 en miR-565 gebleken dat ze underexpressed bij patiënten met een BRAF mutatie [21]. Uit deze gegevens we afleiden dat miR-338 kan fungeren als een tumor suppressor. Er is geen literatuur over de vraag of miR-338 is underexpressed bij maagkanker. In onze studie werden de expressieniveaus van miR-338 eerst gemeten in 41 menselijke maag kankermonsters en 24 monsters van aangrenzend normaal mucosa weefsels. Vervolgens evalueerden de expressie van miR-338 in vijf maagkanker cellijnen en normale maagslijmvlies cellijnen. We vonden dat de expressie van miR-338 werd down-gereguleerd in zowel de tumor weefsels en kankercellijnen. Bovendien kan de overexpressie miR-338 maagkanker celmigratie, invasie en proliferatie te remmen en apoptose bevorderen. Ondertussen kunnen de tumorigene kwaliteiten volledig worden hersteld door Nrp1 overexpressie. Bovendien, het luciferase reporter assays suggereerde dat miR-338 targets rechtstreeks Nrp1. Derhalve concluderen wij dat miR-338 werkt als een potentiële tumor suppressor bij maagkanker, een functie die wordt uitgevoerd door het terugdringen van de expressie van Nrp1. Als niet-tyrosine-kinase receptor, Nrp1 kan matig verhogen expressie van de fosforylering van Erk1 /2, Akt en p38MAPK. M Akagi et al. gevonden dat de remming van NHP-1 verminderde de expressie van de fosforylering van Erk1 /2, Akt en p38MAPK [22]. Bovendien heeft onderzoek aangetoond dat de expressie van ERK1 /2 fosforylering werd up-gereguleerd in NHP-1-overexpressie cellen [23]. In deze studie hebben we vastgesteld dat overexpressie miR-338 de expressie van de fosforylering van Erk1 /2, Akt en p38MAPK, een effect dat werd omgekeerd op Nrp1 herstel kan afnemen. De activering van ERK, Akt en p38MAPK samen met apoptose resistentie /celoverleving is goed gedocumenteerd in verschillende modelsystemen [24], [25], [26].
, miR-338 daalde eveneens tumorgroei en onderdrukte D-MVA door zich te richten Nrp1. Daarom concluderen we dat miR-338 fungeert als nieuw tumorsuppressorgen bij maagkanker. miR-338 kan migrerend, invasief, proliferatieve en apoptotische gedrag, en maagkanker EMT verlagen dempt de expressie van Nrp1
Materialen en methoden
Primers RNA isolatie en miRNA Detection
pcDNA expressieplasmiden en transfectie Plasmide
miRNA Gene Cloning en buitenbaarmoederlijke Expression
Gene Expression Knockdown door RNA-interferentie
Luciferase Reporter Assay
levensvatbaarheid van de cellen en Clonability Assays
migratie en invasie assays
Antibodies
Immunohistochemie
Statistische analyse
miR-338 Direct Doelen Oncogene Nrp1
miR-338 Remt Gastric Cancer Cell migratie, invasie en proliferatie en Bevordert apoptose door Nrp1
Effect van miR-338 op signaalwegen in AGS Cells
miR-338 Bepaalt de epitheliale fenotype van maagkanker
miR-338 Verlaagt tumorgroei en onderdrukt D-MVA door Targeting Nrp1 In Vivo
Discussie
Microben op de tong kunnen worden gebruikt om alvleesklierkanker te diagnosticeren
Onderzoekers van de Zhenjiang University School of Medicine, China heeft ontdekt dat verstoring van de microbiële samenstelling van de tongcoating kan dienen als biomarker voor alvleesklierkanker in e
De eerste bevindingen van het Human Microbiome Project leidden tot 'honderden vervolgonderzoeken'
Het Human Microbiome Project (HMP) is een initiatief ontwikkeld door de National Institutes of Health om het menselijke microbioom te karakteriseren bij zowel gezonde volwassenen als bij mensen met sp
Prikkelbare darmziekte verhoogt het risico op dementie
Wetenschappers hebben lang de link tussen de darm en de hersenen onderzocht. Nutsvoorzieningen, een nieuwe studie toont aan dat oudere volwassenen met chronische ontsteking van het spijsverteringskana
