PLOS ONE: microARN-338 inhibe el crecimiento, invasión y metástasis de cáncer gástrico por la expresión de orientación NRP1

Extracto

NRP1 como receptores multifuncionales no tirosina quinasa juega un papel crítico en la progresión tumoral. MicroARNs (miRNAs) son una clase importante de genes dominantes que están involucrados en una variedad de funciones biológicas, en particular el cáncer. No queda claro si los miRNAs pueden regular la expresión de NRP1. El objetivo de este estudio fue identificar miRNAs que podrían inhibir el crecimiento, invasión y metástasis de cáncer gástrico mediante la expresión de orientación NRP1. Hemos encontrado que la expresión de miR-338 se redujo en líneas celulares de cáncer gástrico y en tejidos de cáncer gástrico. Por otra parte, se encontró que miR-338 inhibe la migración de células de cáncer gástrico, la invasión, la proliferación y promueve la apoptosis mediante la expresión de orientación NRP1. Como un regulador aguas arriba de NRP1, miR-338 se dirige directamente a NRP1. La expresión forzada de miR-338 inhibe la fosforilación de Erk1 /2, MAPK p38 y Akt; sin embargo, la expresión de Erk1 fosforilada /2, MAPK p38 y Akt fue restaurada por la sobreexpresión de NRP1. En las células AGS infectadas con miR-338 o transfectadas con SiNRP1, se redujeron los niveles de proteína de fibronectina, vimentina, N-cadherina y caracol, pero se aumentó la expresión de E-cadherina. La expresión de marcadores mesenquimales en células de miR-338 que expresan fue restaurado a su nivel normal en la restauración de la expresión NRP1. In vivo
, miR-338 también se redujo el crecimiento del tumor y suprimió D-MVA por la orientación NRP1. Por lo tanto, concluimos que miR-338 actúa como un nuevo gen supresor de tumores en el cáncer gástrico. miR-338 puede disminuir los comportamientos migratorios, invasivos, proliferativas y de apoptosis, así como EMT cáncer gástrico, atenuando la expresión de NRP1

Visto:. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) microARN-338 inhibe el crecimiento, invasión y metástasis de cáncer gástrico por la expresión de orientación NRP1. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10.1371 /journal.pone.0094422

Editor: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán

Recibido: 18 Octubre, 2013; Aceptado: March 16, 2014; Publicado: 15 Abril, 2014

Derechos de Autor © 2014 Peng, et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el proyecto de la Comisión de Ciencia y Tecnología en el distrito de Shapingba de Chongqing (201302). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Neuropilins, incluyendo neuropilin1 (NRP1) y neuropilin2 (NRP2), son receptores no tirosina-kinasa multifuncionales que primero fueron identificados en base a sus papeles críticos en el sistema nervioso en desarrollo [1]. NRP1 y NRP2 tienen 44% de homología y comparten muchas propiedades estructurales y biológicas. NRP1 existe principalmente en bloodvesselendothelia, y NRP2 se encuentra principalmente en los vasos linfáticos [2], [3]. Investigaciones posteriores identificaron NRP-1 como un receptor para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) -A isoforma VEGF-165 tanto en las células endoteliales y algunas células tumorales [4], [5]. La investigación ha demostrado que NRP1 está regulado en varios tipos de tumores y se expresa en diferentes vasculatures tumorales [3], [6], lo que sugiere que NRP1 desempeña un papel fundamental en la progresión tumoral. Las primeras investigaciones revelaron que NRP1 podría afectar el crecimiento de tumores como un co-receptor de VEGFR [5]. Los científicos encontraron que más tarde podría impulsar NRP1 tumorangiogenesis, acelerar el crecimiento tumoral y la apoptosis tumoral acera sin VEGFR [7]. NRP1 puede ser un co-receptor de otros factores de crecimiento, que aclara la razón por VEGF puede señal a través de neuropilins en ausencia de VEGFR-1 o VEGFR-2 [8], [9]. Como co-receptor de TβRI /TβRII, NRP1 puede frenar la apoptosis tumoral y acelerar el crecimiento del tumor a través de la señalización tanto canónica y no canónica [10]. NRP1, como un correceptor del PDGFR /CMET, puede impulsar a través de tumorangiogenesis p38MAPK y ERK señalización [11].

Como los genes de regulación aguas arriba de NRP1, los factores de transcripción SP1 /3 y AP1 puede regular la expresión de NRP1 [ ,,,0],12]. Algunas investigaciones han demostrado que el butirato suprime la expresión de neuropilina I en líneas celulares de colon a través de la inhibición de la transactivación Sp1 [13].

Los microARN (miRNA) son no codificantes moléculas de ARN de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud que regular la expresión génica a nivel post-transcripcional [14], [15], [16]. miARN expresión de perfiles de análisis han puesto de manifiesto una baja regulación mundial de los niveles de miARN maduro en tumores humanos primarios en relación con los tejidos normales [17], [18]. Por lo tanto, los miRNAs puede funcionar como supresores de tumores u oncogenes y genes miARN expresión desregulada puede contribuir a la metástasis de las células tumorales. No queda claro si los miRNAs pueden regular la expresión de NRP1; Por lo tanto, nuestro propósito es determinar los miRNAs objetivo de NRP1. Funciones adicionales de NRP1 pueden ser descubiertos mediante el estudio de los miRNAs objetivo de NRP1.

Materiales y Métodos

muestras de tejido humano y líneas celulares

Este estudio se utilizaron tejidos frescos, incluyendo 41 muestras humanas de cáncer gástrico y 24 muestras de tejidos de las mucosas normales adyacentes derivados de 41 pacientes que se sometieron a cirugía en el Segundo hospital Afiliado de la Universidad médica de Chongqing entre 2012 y 2013. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con el 'la Investigación Biomédica en Revisión de Ética humanos (provisional) "regulación del Ministerio de Salud y la Declaración de Helsinki sobre los Principios éticos para las investigaciones médicas en seres humanos. Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento informado de los pacientes y los experimentos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Chongqing. Todos los participantes por escrito el consentimiento para participar en este estudio informaron

El SGC-7901, HGC-27, AGS, líneas de células MKN-45 y N87 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , EE.UU.), y la línea celular GES-1 se adquirió de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 (Hyclone, Logan Utah, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO2.

Primers, el aislamiento de ARN y la detección de los genes miARN

los cebadores para miR-338-3p y U6 se produjeron utilizando el kit miScript Primer Ensayo (Qiagen Düsseldorf Alemania). Las secuencias de los miRNAs utilizados en este estudio fueron los siguientes: MIR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG y U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Los cebadores inversos también se utilizaron en la etapa de transcripción inversa. miRNA total fue extraído de células cultivadas y muestras de tejido humano usando RNAiso para Small RNA (Takara Bio, Otsu, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. colas de poli-A se añadieron a miR-338 y U6 con la reacción miRNA Buffer Mix (Takara Bio), y luego cDNA fue sintetizado de 5 ng de RNA total usando el miARN PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara Bio). PCR en tiempo real se realizó en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad) con SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara Bio). Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s. Los datos se normalizaron contra el U6 snRNA. Después de la amplificación, se realizó un análisis de la curva de fusión para confirmar la especificidad de los productos.

plásmidos de expresión pcDNA y transfección del plásmido

La secuencia ORF de NRP1 se amplificó a partir de ADN genómico aislado de la célula AGS luego la línea, y la región ORF del ADNc NRP1 se subclonó en el vector GV230 (GeneChem Corporation, Shanghai, china) .El plásmido se transfectó en células AGS y MKN45 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty y cuatro horas después de la transfección, el se utilizaron células para un experimento de rescate. Se seleccionaron las células AGS que fueron transfectadas establemente con NRP1 usando 2 ug /ul puromicina (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia) 48 h después de la transfección.

miARN clonación de genes y la expresión ectópica

La gen humano miR-338 se amplificó por PCR a partir de ADN genómico normal y se clonó en un vector lentiviral. Los lentivirus se generaron por la co-transfección de células HEK293T con plásmidos PGC-LV, pHelper 1.0 y 2.0 pHelper utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los virus se cosecharon 48 h después de la transfección, y las infecciones se realizaron en presencia de 2 mg /ml de polibreno (GeneChem Corporation). Control de miARN viruse se adquirió de GeneChem Corporation (Shanghai, China). Se seleccionaron las células AGS que fueron establemente infectadas con el miR-338 usando 2 ug /ul puromicina (Invitrogen) 48 h después de la infección.

Expresión Génica Knockdown por la interferencia del ARN

expresión NRP1 por AGS las células fueron silenciados por la transfección de las siguientes secuencias de siRNA dirigidos (Sangon Biotech, Shanghai, china) con Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (donde no se especifica, se utilizó siRNA). Control de siRNAs (sic) se generaron mediante la introducción de sustituciones de bases en 4 NRP1 secuencia de dirección (GATAGGTCATGACTGCCC). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, la expresión NRP1 fue examinado por inmunotransferencia.

Luciferase reportero de ensayo

Se utilizó un vector de expresión diana Dual-Luciferase miRNA PsicheckTM-2 para los ensayos de luciferasa 3'UTR (Sangon Biotech, Shanghai, china). El oncogén objetivo de los genes miARN-338 fue seleccionada sobre la base de la base de datos destino http://www.microrna.org/microrna/home.do microRNA en línea. El primer secuencias de la UTR 3 'de tipo silvestre fueron los siguientes: hacia adelante: 5'-CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG 3' y revertir 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3 '. Debido a que hay dos sitios de unión en la NRP1 3'UTR, se diseñaron dos primer secuencias de los mutantes 3'UTR. Por un mutante 3'UTR, las secuencias de los cebadores fueron los siguientes: hacia adelante: 5'-GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'y revertir: 5'-GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3'. Por otro mutante 3'UTR, las secuencias de los cebadores fueron los siguientes: hacia adelante: 5'-GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'y revertir: 5'-GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. Para el ensayo de luciferasa, Lipofectamine 2000 se utilizó para co-transfectar células MKN45 con el hsa-miR-338 y los vectores de expresión diana Dual-Luciferase miRNA PsicheckTM-2 que contienen de tipo salvaje o secuencias diana mutantes. La actividad de luciferasa de luciérnaga se midió usando el ensayo de luciferasa Dual (Promega, Madison, WI, EE.UU.) 18 h después de la transfección, y los resultados se normalizaron en contra luciferasa de Renilla. Cada plásmido reportero se transfectó al menos tres veces (en días diferentes), y cada muestra se ensayó por triplicado.

viabilidad celular y Clonability Ensayos

Las células transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 x 10 ^{4 células /pocillo. Se añadió una solución de MTT (20 ul de 5 mg /ml MTT) a los cultivos (para un volumen total de 200 ul) y se incubó durante 4 sombrero 37 ° C. Después de la eliminación del medio de cultivo, los cristales restantes se disolvieron en DMSO, y se midió la absorbancia a 570 nm. Para el ensayo de formación de colonias, las células se sembraron a una baja densidad (1000 células /placa) y se dejaron crecer hasta que las colonias visibles aparecieron. Las células fueron teñidas con Giemsa y se contaron las colonias.}

migración y la invasión ensayos

Para los ensayos de migración transwell, 10 × 10 ^{4 células se sembraron en la cámara superior con una membrana no recubierto (inserto de 24 pocillos; 8 mm de tamaño de poro; BD Biosciences). Para los ensayos de invasión, 2 × 10 5 células se sembraron en la cámara superior con una membrana recubierta con Matrigel (inserto de 24 pocillos; 8 mm de tamaño de poro; BD Biosciences). Para ambos ensayos, las células se sembraron en un medio libre de suero, y se usó un medio suplementado con 10% de suero como un quimioatrayente en la cámara inferior. Las células se incubaron durante 16 horas a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador de cultivo de tejidos. Después de 16 h, las células no migradas /no invasora se retiraron de los lados superiores de los insertos de filtro de membrana Transwell utilizando hisopos con punta de algodón. Las células /invadidos migrado en los lados inferiores de las piezas de inserción se tiñeron con Giemsa y se contaron las células.}

Los anticuerpos

Los anticuerpos contra fibronectina, vimentina, N-cadherina, E-cadherina, CARACOL y GAPDH fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (CA, EE.UU.). Fosfato ERK1 /2, fosfo-Akt, y fosfato p38MAPK se adquirieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido), y el total de Erk1 /2, Akt, y p38MAPK eran de BD Biosciences (EE.UU.). Un anticuerpo contra NRP1 se adquirió de I +; D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.), y HRP (peroxidasa de rábano picante) conjugado con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón y HRP-conjugado de cabra anti-IgG de conejo se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology

Immunoblotting

proteína total se extrajo de las células transfectadas utilizando tampón de lisis RIPA (Beyotime, china) según las instrucciones del fabricante. Después de que los extractos de proteínas de células enteras se cuantificaron utilizando el ensayo de proteína BCA, cantidades equivalentes de lisados ​​celulares se resolvieron por electroforesis en SDS gel de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno, que después se bloqueó en leche 5% sin grasa en TBST durante 1 hora a 4 ° C. Las transferencias se incubaron con anticuerpos primarios. Después de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, las bandas de proteína se visualizaron utilizando un reactivo de quimioluminiscencia (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Se utilizaron las siguientes diluciones de anticuerpos: anti-fibronectina, 1:200; anti-vimentina, anti-E-cadherina y anti-N-cadherina, 1:1200; anti-caracol y anti-GAPDH, 1:500; anti-fosfato ERK1 /2, anti-fosfo-Akt, y anti-fosfo-p38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; total anti-ERK1 /2, anti-Akt, y anti-p38MAPK, 1:500; y conjugado con HRP IgG, 1:7000.

Los experimentos de xenoinjertos

ratones desnudos atímicos macho de 6 a 8 semanas de edad se obtuvieron del Centro Experimental Animal de la Universidad Médica de Chongqing y se aclimataron durante 2 semanas. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Chongqing. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad Médica de Chongqing. Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Igual número de células AGS (10 ^{6) con la expresión forzada de miR-338 o cont-MIR, con o sin restauración NRP1, se suspendieron en 100 l de PBS y se inyecta por vía subcutánea en el flanco trasero derecho de cada ratón (10 ratones por grupo) crecimiento .Tumor se controló diariamente en cada grupo. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula V = 1/2 a × b2, donde a es el eje más largo del tumor y b es el eje más corto del tumor. Los ratones fueron sacrificados 5 semanas más tarde y los tumores se dividen en dos partes. Una parte se fijó en formol para su posterior análisis inmunohistoquímico, y la otra parte se conserva en nitrógeno líquido para el Western Blot o QRT-PCR.}

La inmunohistoquímica

Los tumores conservados en formalina se colocaron en bloques de parafina y seccionada en portaobjetos de microscopio con carga positiva. Las secciones se deparaffinized en xileno, hidratado clasificado en el alcohol, y tratan previamente para la recuperación de antígenos en tampón de citrato durante 20 min en un 98 ° C vapor (CD34 y NRP1). Las secciones se incubaron a 4 ° C durante la noche con CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) y NRP1 (1:100 R & D Systems). La inmunotinción se realizó utilizando el Kit ultrasensible S-P detección (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, China), y el color se desarrolló utilizando un kit DAB (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, China) .Subsequently, las secciones se counterstained con hematoxilina. Las diapositivas fueron teñidas con H &. E para evaluar la morfología

La cuantificación de las manchas de inmunohistoquímica Intensidad

Para determinar la densidad microvascular tumoral, seleccionados al azar cinco imágenes microscópicas de campo claro (ampliación de la zona 40 ×; 0,89 mm ^{2) por muestra se obtuvieron como se ha descrito anteriormente, y los microvasos teñidas positivamente se contaron usando el programa ImageJ. El canal de rojo, que corresponde a la tinción de CD34, se aisló y digitalizada en una imagen binaria, con lo que indica negro vasos manchados e indicando blanco sin manchas. Los buques con lúmenes se llenaron digitalmente, y un compuesto de D-MVA se cuantificó. Utilizando el programa ImageJ, imágenes de color marrón específicos para la tinción DAB se extrajeron mediante una macro color de deconvolución. Todos los valores de intensidad de un mismo grupo se promediaron para calcular las proporciones entre los diferentes grupos.}

software de análisis estadístico

SPSS 17,0 se utilizó para el análisis estadístico. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (S. D.). Grupo comparaciones se realizaron mediante la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron significativas a p <. 0.05

Resultados

MIR Selección

Para ser incluido en nuestro análisis posterior, dianas proteicas de NRP1 tuvieron que ser concordante predicho por lo menos tres de los siguientes cuatro herramientas de predicción: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan /index.html) y miRDB (mirdb.org/miRDB/). En base a la versión de lanzamiento enero de 2012, encontramos 11 microRNAs que potencialmente utilizado NRP1. Habíamos identificado previamente varios miRNAs anormalmente expresados ​​en el carcinoma gástrico utilizando un chip de genes [19] (Tabla 1). Sobre la base de los dos anteriores, que predijo un miARN aguas arriba de NRP1: miR-338

miR-338 es el regulado en el cáncer gástrico tejidos y líneas celulares

Para explorar el papel de los MIR. -338 en el desarrollo del cáncer gástrico humano, que mide sus niveles de expresión en 41 muestras de cáncer gástrico humano y 24 adyacentes muestras de mucosa normal. Según un análisis de QRT-PCR, el nivel de expresión de miR-338 se redujo significativamente en los tejidos tumorales en comparación con los tejidos adyacentes normales de la mucosa (Fig. 1A). Además, la expresión de miR-338 se redujo en las líneas celulares de cáncer gástrico (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 y N87) en comparación con la línea celular de la mucosa gástrica normal (GES1) (Figura 1B). Estos resultados sugieren que el miR-338 es el regulado en células de cáncer gástrico, un hallazgo que podría ser relevante para el desarrollo del cáncer gástrico humano.

miR-338 se dirige directamente a Oncogénicos NRP1

NRP1 ha sido informado de que una molécula importante que impulsa la migración cáncer gástrico y la invasión. El uso de herramientas de predicción, que predijo que el objetivo de miARN NRP1 era miR-338. Para confirmar aún más que el miR-338 se dirige directamente a NRP1 oncogén, se realizaron ensayos de reportero de luciferasa para examinar si el miR-338 interactúa directamente con su objetivo NRP1 oncogénico. Se identificaron dos posibles sitios de unión de miR-338 en el 3'UTR del ARNm NRP1. Para determinar si NRP1 está regulada por el miR-338 a través de la unión directa a la 3'UTR de NRP1, se construyó una serie de fragmentos 3'UTR, incluyendo los de larga duración de tipo salvaje NRP1 3'UTR, un sitio de unión 1 y mutante un sitio de unión 2 mutante (Fig. 2A). Estos fragmentos se insertaron entonces en el plásmido reportero de luciferasa psiCHECK2. Hemos encontrado que la co-transfección de miR-338 y la de tipo salvaje NRP1 3'UTR causó una disminución significativa en unidades de luciferasa en comparación con los controles. Sin embargo, la co-transfección de miR-338 y el mutante NRP13'UTR no causó una disminución en las unidades de luciferasa (Fig. 2B). Estos resultados sugieren que el miR-338 objetivos NRP1 directamente.

migración de células de miR-338 inhibe el cáncer gástrico, la invasión y proliferación y promueve la apoptosis por NRP1

Para examinar el significado funcional de la sobreexpresión de miR-338 en el cáncer gástrico, se infectaron las líneas celulares de cáncer gástrico AGS y MKN45 con LV-HSA-mir-338. En comparación con la expresión de co-MIR, MIR-338 se sobreexpresa significativamente en el AGS y líneas celulares MKN45 después de la infección con el LV-HSA-mir-338 (Figura 3A). También se encontró que, en comparación con el miR-CONT, la expresión de NRP1 fue significativamente las reguladas en el AGS y líneas celulares MKN45 después de la infección con el LV-HSA-mir-338 (Figura 3B). Las células con expresión forzada de miR-338 mostraron una disminución significativa la proliferación en comparación con las células con expresión forzada de co-MIR (Figura 3C). Las células infectadas por el miR-338 también mostraron disminución de la capacidad de formación de colonias: el número de focos en las células de miR-338 que expresan se redujo en comparación con las células infectadas por el MIR-CONT (Figura 3D). La migración transwell y ensayos de invasión de Matrigel demostraron que el miR-338 reduce significativamente las capacidades de migración y la invasión de las células AGS y MKN45 (Figura 3E). La fluorescencia de células activadas por la clasificación de análisis (FACS) mostró que la expresión forzada de miR-338 de plomo a la apoptosis de células de cáncer gástrico. El porcentaje de células apoptóticas totales (+ temprana de apoptosis tardía apoptótica) aumentó significativamente en un 11% en respuesta a la sobreexpresión de miR-338 en comparación con el miR-cont sobreexpresión en células AGS. Se observó un aumento del 10% en el número de células apoptóticas en las células MKN45 con sobreexpresión de miR-338 en comparación con el miR-CONT (Figura 3F). miR-338 podría regular la expresión de NRP1 inhibiendo directamente la transcripción NRP1 u otros circuitos indirectos, por lo que junto verificar si la reducción de la expresión NRP1 podría explicar la inhibición de la migración celular gástrica cáncer, invasión y proliferación observada después de la expresión forzada de miR 338. Por lo tanto, obligado a la expresión de miR-338 en células AGS junto con una construcción que contiene la secuencia de codificación de NRP1 pero que carecen de la 3'UTR del ARNm NRP1. Como resultado, esta construcción dio un ARNm NRP1 que era resistente a miR-338. Se encontró que la migración de células de cáncer gástrico, la invasión, la proliferación y la apoptosis fueron restaurados en la línea de células AGS con la expresión de miR-338 y la restauración forzada NRP1 (Figura 3G-3J). Esos resultados muestran que el miR-338 inhibe la migración de células de cáncer gástrico, la invasión y proliferación y promueve la apoptosis por la orientación NRP1.

Efecto de miR-338 en rutas de señalización en células AGS

Como no receptor de la tirosina-quinasa, NRP1 puede aumentar moderadamente la expresión de la fosforilación de Erk1 /2, Akt, y p38MAPK para promover la proliferación de células tumorales y la metástasis, así como para reducir la apoptosis y la respuesta inmune. Debido NRP1 será un objetivo de miR-338, se asumió que el miR-338 podría disminuir la expresión de la fosforilación de ERK1 /2, Akt, y p38MAPK. Se encontró que la expresión forzada de miR-338 inhibe la fosforilación de ERK1 /2, pero el nivel relativo de expresión total de Erk1 /2 no se alteró significativamente. miR-338 podría también disminuir la fosforilación de MAPK y Akt P38 (figura 4A). miR-338 podría obligar a la 3'UTR del ARNm NRP1 para regular la fosforilación de ERK1 /2, Akt y p38MAPK; Sin embargo, no sabemos si el miR-338 podría enlazar los 3'UTRs de otros genes para lograr el mismo efecto. Así se llevó a cabo el experimento de rescate, y la restauración de la expresión NRP1 se confirmó a través de un análisis de inmunotransferencia (Figura 4B). Se encontró que los niveles de fosforilación de ERK1 /2, Akt y p38MAPK no se alteraron de manera significativa en las células AGS con la expresión de miR-338 y la restauración forzada NRP1 (Figura 4C). Por lo tanto, llegamos a la conclusión que el miR-338 regula la fosforilación de ERK1 /2, P38 MAPK y Akt vía NRP1.

miR-338 Determina el fenotipo epitelial de cáncer gástrico

EMT es un mecanismo importante asociado con la invasividad del cáncer y la metástasis. El fenómeno de la EMT se define como la transición de las células epiteliales a células mesenquimales fibroblastoid- o similar. EMT se caracteriza por la pérdida de marcadores epiteliales y la adquisición de componentes mesenquimales. E-cadherina, ocludina y citoqueratina están regulados a la baja durante la EMT, mientras que la N-cadherina, vimentina, fibronectina y CARACOL se regula positivamente. NRP1 mejora la señalización a través de tres vías principales que se han vinculado a EMT, es decir, el TGF-β, Hh y HGF /cMet. Para encontrar el papel de NRP1 en el mantenimiento del fenotipo mesenquimal de células gástricas, derribaron la expresión de NRP1 por RNA de interferencia (RNAi) (Fig. 5A) y examinado la expresión de marcadores mesenquimales tales como fibronectina, vimentina, N-cadherina y caracol, así como el marcador epitelial E-cadherina, en las células AGS. Se encontró que los niveles de expresión de la fibronectina, vimentina, N-cadherina y CARACOL se redujeron, pero la expresión de E-cadherina se incrementó en las células tumorales NRP1-empobrecido (Fig. 5B). El resultado muestra que NRP1 puede conducir proceso de EMT en el cáncer gástrico. Debido NRP1 será un objetivo de miR-338, se asumió que el miR-338 podría determinar el fenotipo epitelial del cáncer gástrico. Para determinar si los cambios moleculares típicos de un EMT reducida se produjeron en células de miR-338 que expresan, se analizó la expresión de marcadores mesenquimales y epiteliales en células AGS. El análisis de inmunotransferencia mostró que los niveles de expresión de fibronectina, vimentina, N-cadherina y CARACOL se redujo en las células AGS con la expresión forzada de miR-338. Por otra parte, la expresión forzada de miR-338 aumentó la expresión de E-cadherina en la línea celular AGS, mientras que las células de control infectadas se mantuvieron negativos E-cadherina. Se encontró que el miR-338 regula la fosforilación de ERK1 /2, MAPK p38 y Akt a través de NRP1; Por lo tanto, era necesario determinar si el miR-338 podría regular la EMT a través de NRP1. El análisis de inmunotransferencia mostró que la expresión de los marcadores mesenquimales anteriores en las células de miR-338 que expresan fue restaurado al nivel normal mediante la restauración de la expresión NRP1 (Fig. 5C). En conjunto, estos resultados demuestran que el miR-338 podría inhibir la EMT a través de NRP1 en células de cáncer gástrico.

miR-338 reduce el crecimiento del tumor y suprime la D-MVA por orientación NRP1 En Vivo

a partir de los descensos observados en los comportamientos migratorios, invasivos y proliferativos en AGS y MKN45 células infectadas con LV-HSA-mir-338, el próximo investigó el papel de miR-338 en el crecimiento in vivo. Nos inocularon subcutáneamente ratones desnudos con igual número (1 × 10 ^{6 células por ratón) de células AGS con la expresión forzada de miR-338 o cont-MIR, con o sin restauración NRP1. la incidencia de tumores se evaluó cada dos semanas, y los tumores apareció en todos los ratones. la expresión de miR-338 en los tumores de ratones desnudos se midió usando QRT-PCR, y encontramos que el miR-338 expresión aumentó significativamente en los tumores que sobreexpresan el miR-338 (Figura 6A). La expresión forzada de miR-338 inhibió significativamente el crecimiento del tumor in vivo, pero la sobreexpresión de NRP1 podría restaurar el crecimiento del tumor (Figura 6B). A continuación, se analizó la expresión NRP1 en los tumores de ratones desnudos por western blot e inmunohistoquímica. Hemos encontrado que la expresión NRP1 disminuyó significativamente en los tumores que sobreexpresan el miR-338; Sin embargo, la expresión NRP1 fue restaurada en los tumores que sobreexpresan NRP1 (Figura 6C, 4D). Por lo tanto, inferimos que el miR-338 inhibe el crecimiento tumoral mediante la disminución de expresión NRP1 in vivo. NRP1 puede aumentar tumorangiogenesis; Por lo tanto, la hipótesis de que la expresión forzada de miR-338 inhibiría tumorangiogenesis través NPR1. Se utilizó tinción inmunohistoquímica para CD34 para evaluar el número y morfológicas características de los vasos sanguíneos dentro de cada tumor. Los vasos se enumeraron por recuento del número de estructuras con tinción discreta dentro de cada campo sin tener en cuenta el tamaño del vaso o de la permeabilidad. Los vasos en los tumores que sobreexpresan el miR-338 fueron subjetivamente menos de los tumores cont-miR-sobreexpresan; Sin embargo, el número de los vasos fue restaurada en los tumores que sobreexpresan NRP1 (Figura 6E). Se analizó el área microvascular digitalizada (D-MVA) para incorporar el tamaño del vaso y la permeabilidad en nuestro análisis de la vasculatura del tumor, proporcionando una estimación del área de la luz integrada y, presumiblemente, ortogonal el flujo de sangre a la sección de tumor. El D-MVA se redujo en los miR-338 tumores sobreexpresan. Para nuestra sorpresa, encontramos que los tumores sobreexpresan-NRP1 no lo hicieron significativamente muestran aumento de la angiogénesis, pero la reducción de D-MVA debido a la sobreexpresión de miR-338 fue restaurada en los tumores que sobreexpresan NRP1 (Figura 6F y 6G). Especulamos que la expresión NRP1 ya se upregulated en el cáncer gástrico, de modo aún más NRP1 overexpressed no puede aumentar significativamente la vasculatura del tumor, pero puede restaurar la vasculatura del tumor que se ha reducido por miR-338. Estos resultados indicaron que el miR-338 reduce el crecimiento del tumor y suprime D-MVA por la orientación NRP1 in vivo.}

Discusión

El uso de chips de genes y la bioinformática, que predijo que el objetivo de miARN NRP1 era MIR -338. La investigación ha demostrado que la expresión de miR-338 varía en diferentes tumores. Huang XH et al. mostró que el miR-338-3p suprime la invasión de células de cáncer de hígado mediante la focalización suavizado [20]. Por otra parte, en los melanomas, miR-193a, miR-338 y miR-565, se mostró a ser underexpressed en pacientes con una mutación BRAF [21]. A partir de estos datos, inferimos que el miR-338 podría actuar como un supresor de tumores. No hay literatura publicada acerca de si el miR-338 se underexpressed en el cáncer gástrico. En nuestro estudio, los niveles de expresión de miR-338 se midieron por primera vez en 41 muestras de cáncer gástrico humano y 24 muestras de tejidos de la mucosa normal adyacente. A continuación, evaluó la expresión de miR-338 en cinco líneas celulares de cáncer gástrico y en líneas celulares de mucosa gástrica normal. Se encontró que la expresión de miR-338 se redujo reguladas tanto en los tejidos tumorales y las líneas celulares de cáncer. Por otra parte, la sobreexpresión de miR-338 podría inhibir la migración de células de cáncer gástrico, la invasión y proliferación, y promover la apoptosis. Mientras tanto, esas cualidades tumorigénicos pueden ser completamente restaurados por NRP1 sobreexpresión. Además, los ensayos de reportero de luciferasa sugirieron que el miR-338 objetivos NRP1 directamente. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el miR-338 actúa como un supresor de tumores potencial en el cáncer gástrico, una función que se lleva a cabo mediante la disminución de la expresión de NRP1.

Como un receptor no tirosina-quinasa, NRP1 pueden aumentar moderadamente el expresión de la fosforilación de Erk1 /2, Akt, y p38MAPK. M Akagi et al. encontraron que la inhibición de NRP-1 redujo la expresión de la fosforilación de Erk1 /2, Akt, y p38MAPK [22]. Además las células, la investigación ha demostrado que la expresión de ERK1 /2 fosforilación fue hasta reguladas en NRP-1-sobreexpresan [23]. En este estudio, se encontró que sobreexpresa el miR-338 podría disminuir la expresión de la fosforilación de ERK1 /2, Akt, y p38MAPK, un efecto que fue revertido al restaurarse NRP1. La activación de ERK, Akt y p38MAPK en asociación con la supervivencia apoptosis resistencia /célula ha sido bien documentado en una variedad de sistemas modelo [24], [25], [26].

• PLOS ONE: Relación entre la condición de p53 y la respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer gástrico: un meta-Analysis
• PLOS ONE: Expresión de la familia de EGF en el cáncer gástrico: regulación a la baja de HER4 y su cáncer gástrico Activación ligando NRG4