PLOS NËMMEN: MicroRNA Loosst-7f bremst entholl Missiounen an Metastasen vun MYH9 gezielt an Human Gastric Cancer

Wat VerfÜgung

Background VerfÜgung

MicroRNAs (miRNAs) si wichteg Legislateuren datt wichteg Roll an tumorigenesis Leeschtung an entholl Werdegang. A virdrun Rapport huet déi Famill loosse-7 dës Memberen als entholl suppressors zu vill Cancers Akt kann. Duerch miRNA onerfëllt, hunn mir déi loosse-7f war an der héichgradeg metastatic Potential gastric Kriibs Zell Linnen GC9811-P an SGC7901-M downregulated, wou mat hiren Elteren Zell Linnen Verglach, GC9811 an SGC7901-NM; allerdéngs war de Mechanismus net kloer. An dëser Etude, kucken mer ob mer-7f Akten als entholl suppressor Invasioun an Metastasen an gastric Cancers zu inhibit. VerfÜgung

Methodik /Principal VerfÜgung

Real-Zäit Hinnen alleguer zougedréckt ofgeholl Niveau vun loosse-7f Ausdrock vun metastatic gastric Kriibs Stoffer an Zell Linnen déi potenziell héich metastatic sinn. Zell Invasioun a Migratioun sech zu GC9811-P an SGC7901-M Zell Reien transfection mat loosse-7f-mimics vill leider. Sauna Mais mat xenograft Modeller vun gastric Kriibs confirméiert datt loosse-7f gastric Kriibs Metastasen zu VIVO der transfection vun der lentivirus pGCsil-GFP- loosse-7f inhibit konnt. Luciferase reporter assays bewisen, dass mer-7f Photo'en direkt un der 3'UTR vun MYH9, déi Coden fir myosin IIA, an real-Zäit Hinnen alleguer a Western weider uginn blotting datt loosse-7f den Ausdrock vun myosin IIA um mRNA an FAQ Niveauen downregulated Invasioun an Migratioun vun gastric Kriibs Zellen duerch direkt gezielt entholl Metastasen-verbonne Gentherapie MYH9 inhibit konnt. VerfÜgung

Konklusiounen /Grousses VerfÜgung

Eis Etude bewisen, dass overexpression vun am gastric Kriibs loosse-7f. Dës Donnéeë virschloen, datt mer-7f engem Roman therapeutesch Kandidat fir gastric Kriibs kann, kritt seng Fähegkeet Zell Invasioun an Metastasen ze reduzéieren VerfÜgung

Fro:. Liang S, Hien L, Zhao X, Y Miao, Gu Y, Yinan C, et al. (2011) MicroRNA Loosst-7f bremst entholl Missiounen an Metastasen vun MYH9 gezielt an Human Gastric Cancer. PLoS NËMMEN 6 (4): e18409. Doi: 10.1371 /journal.pone.0018409 VerfÜgung

Redakter: Donald Gullberg, Universitéit vu Bergen, Norwegen VerfÜgung

Arnaque: 27. September 2010; Akzeptéiert: 7. Mäerz 2011; Publizéiert: April 18, 2011 VerfÜgung

Copyright: © 2011 Liang et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Etude gouf vun der National Natural Science Foundation of China (Nr 30801330, Nr 30871143, Nr 81030044)) an der National Grondakommes Research plangen vu China (Nr 2010CB529300, Nr 2010CB529306) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Gastric Kriibs (GC) ass déi gemeinsam gastrointestinal malignancy am Osten Asien, an Osteuropa, an Deeler vun Central a Südamerika, an ass den zweete Spëtzekandidat Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doudesfäll [1]. Verbreet Metastasen huet eng grouss Grond fir de net dat Resultat vun GC Patienten goufen. Metastasen ass eng komplex, Multi-Schrëtt Prozess woubäi Kriibs Zellen aus der Primärschoul Patient zu enger wäiter Standuert opgeholl [2]. De Prozess fänkt wann Primärschoul entholl Zellen bascht Otemschwieregkeeten violéieren, gefollegt vun Zellen an d'Blutt Baach (intravasation) am Gaang, duerch d'vasculature translocating, Sortie vum Blutt kritt (extravasation) an der Géigend Otemschwieregkeeten parenchyma, micrometastases domat an endlech macroscopic Secondaire proliferating zu Form erhéijen [3]. Ee vun de kriteschen Reglementatioun, dass an dësem Prozess bedeelegt ass eng microRNA (miRNA) [4]. VerfÜgung

MicroRNAs (miRNAs) sinn eng Klass vu endogenous a kleng Net-coding reglementaresche RNAs, déi Genen am post- regléieren transcriptional Niveau [5]. Mature miRNAs kann duerch RNS polymerase II ausserdeem ginn an sinn ab dem mi Ofwécklung vun der Primärschoul miRNA gët vun Drosha an Dicer generéiert; si déngen dann als posttranscriptional Reglementatioun vun der Gentherapie Ausdrock duerch ergänzen huel Mariage zu Messenger RNAs [6]. Vill Rapporten weisen datt miRNAs Schlëssel Rollen an verschidde biologesch Prozesser Leeschtung, dorënner Zell dat, Prolifératioun, apoptosis, Stress Resistenz, Fett ukuerbelt, tumorigenesis, an entholl Metastasen [7], [8], [9]. VerfÜgung

déi loosse-7 Famill ass eng conserved Famill vun miRNAs. Loosst-7 war ursprénglech am nematode Caenorhabditis elegans observéiert [10], a véierzéng Memberen hunn zu Datum fonnt ginn [11]. Viru Kuerzem, huet den Ausdrock Niveaue vu ville loosse-7-Familljemembere fonnt an eng Villfalt vun Cancers reduzéiert gin. Zum Beispill, loosse-7 ass zu haett Kriibs downregulated, melanoma, an de Kapp a Hals squamous carcinoma, iwwerdeems overexpression vun loosse-7 kann Kriibs Zell Wuesstem [12], [13], [14], [15], [16 inhibit ], [17], [18]. Puer oncogenes, wéi RAS, MYC, an HMGA2, sinn direkt Ziler vun loosse-7 [19], [20], [21]. Loosst-7f ee Member vun der loosse-7 Famill ass. Virdrun Studien hunn, datt mer-7f gewise gëtt weider-reglementéiert Primärschoul Broscht Kriibs an ënnerstëtzt angiogenesis [22]; downregulation zu Muppen [23] war vun chronescher hypoxia oder monocrotaline an deër ëmmer, an de Niveau war an Plasma vesicles vun NSCLC Patienten [24] ofgeholl. Ausserdeem, kann loosse-7f Zell Prolifératioun Afloss vun Kallikrein-Zesummenhang peptidases (KLKs), eng Famill vu serine proteases gezielt dass, dorënner spillt Kriibs an e puer malignancies gin dysregulated gewise goufen [25]. VerfÜgung

Eis Labo hutt virdrun e Grupp vun differentially ausgedréckt miRNAs tëscht GC9811 an GC9811-P Zellen duerch héich-Profil microRNA Chip identifizéiert Analysë datt enthale loosse-7f [26]. An der weiderer characterization vun loosse-7f zu verschiddenen Kriibs Zell Linnen, hunn mir déi loosse-7f Funktiounen als Metastasen suppressor. Déi verstäerkte Ausdrock vun loosse-7f kann GC Zell Invasioun an Migratioun kënschtlech oofgesinn an VIVO. Vun Bioinformatik Analyse, identifizéiert mir dass MYH9, déi engem myosin IIA schwéier Ketten an d'Promotioun vun Kriibs Zell Migratioun oder Invasioun, wéi eng putative loosse-7f Zil- Équipe encodes. Kierzunge Experimenter bestätegt, datt mer-7f kann duerch gezielt 3'UTR vun MYH9 myosin IIA Ausdrock downregulate, déi eng méiglech Zil fir GC behandelt gëtt. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

Ray Kollektioun VerfÜgung

primär gastric entholl Stoffer, bascht Net-entholl gastric Stoffer an fernen metastatic gastric Stoffer sech vu Patiente kritt deen Agrëff bei der Xijing Hospital vun Digestive Krankheeten Xian, China mécht. All Echantillon waren klinesch an pathologically dës korrekt Bezeechnung ze ginn. Patienten Echantillon fir d'Etude stellt ënnerschriwwen Awëllegung Formen. VerfÜgung

Zell Kultur VerfÜgung

De Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M an eisem eegene Laboratoire conserved sech a sech cultured zu RPMI1640 (HyClone), deen mat 10% an et Bovine serum. (FBS; GIBCO), 100 Unitéiten /ml penicillin, an 0,1 mg /ml streptomycin bei 37 ° C an enger humidified 5% Kuelendioxid incubator VerfÜgung

RNS erauszéien a real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung

qRT-Hinnen alleguer war standing den Ausdrock Niveau vun Potential loosse-7f Zil- Genen ze bestëmmen. Total RNS war vun Stoffer oder cultured Zellen mat TRIZOL reagent (Invitrogen Life Technologies) ofgebaut. Ergänzen DNA (cDNA) war mat engem TaqMan Réckproduktioun Transkriptioun Kit (Obwuel Biosystems) entsteet. Real-Zäit Hinnen alleguer analyséiert goufen mat enger TaqMan Mikro-RNS Assay Kit (Obwuel Biosystems) gesuergt. Primer vun loosse-7f war vun Ambion (MI0000437) kaaft. Primer vun MYH9 Haaptrei war mat Primer Express Software (Version 1.5) entworf. D'primer-MYH9 Haaptrei: (Stiermer) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 "(Réckproduktioun) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All Ëmwelt- sech no den Instruktioune vum Fabrikant duerchgefouert. Den Ausdrock Niveau vun loosse-7f war normalized zu 5s (Stiermer: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 '; VerfÜgung

Réckproduktioun: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3'). Den Ausdrock Niveau vun MYH9 war normalized to18S (Stiermer: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 '; VerfÜgung

Réckproduktioun: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') Hinnen alleguer an Daten Kollektioun sech op eng iCycler (Bio-Rad) gesuergt.. All Prouf war zu triplicate Laf VerfÜgung

Vecteure gesond a Lentivirus Production VerfÜgung

D'pri-loosse-7f Haaptrei gebaut huet wéi follegt:. (Stiermer) kann awer och sin-loosse-7f-1-Xho WANN GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG , (Réckproduktioun) kann awer och sin-loosse-7f-1- BamH asetzen CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. D'Haaptrei huet Kick an gekloonten nees pGCsil-GFP Vecteure (GENECHEM) pGCsil-GFP- loosse-7f ze generéieren. Negativ Kontroll war PGC FU-RNAi-NC-LV. Virus Verpackungen war zu HEK 293T Zellen no der cotransfection vun 20 μg pGCsil-GFP-loosse-7f Vecteure mat 15 μg vun de Verpackungen plasmid pHelper 1.0 Vecteure an 10 μg vun der Enveloppe plasmid pHelper 2.0 Vecteure benotzt Lipofectamine 2000 (Invitrogen) gesuergt. Viren waren 48 h der transfection gesammelt, an Haren titers bestëmmt goufen. VerfÜgung

Oligonucleotide Konstruktioun VerfÜgung

loosse-7f mimics, loosse-7f inhibitor an negativ Kontroll siRNA oligonucleotides sech chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., Ltd). D'oligonucleotides an dës Studien gebraucht goufen huet-loosse-7f mimics: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 '; VerfÜgung

Mimics negativ Kontroll: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 ", huet-loosse-7f inhibitor: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 ". MircoRNA inhibitor negativ Kontroll: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 'VerfÜgung

Zell transfection VerfÜgung

BTS zu 80% bis 90% Niewebaach cultured sech no an 6-gutt Placke rakommen ginn an huet mat Lipofectamine 2000 (Invitrogen transfected. , Karlsbad CA) no der Taktik vum Produzent. Fir flüchteg transfection, Zellen an all gutt vun enger 6-gutt zappen sech mat 12,5 μl miRNA inhibitor oder 7.5 μl miRNA rescht oligonucleotides transfected. No 48 h vu transfection, goufen Zellen fir weider trotzdeem recoltéiert. Fir stably transfected Zellen, goufen Zellen mat lentivirus bei 30% -50% confluency transfected. Target Zellen (1 × 10 4), dorënner GC 9811-P an SGC7901-M Zellen, infizéierte mat 1 × 10 6 recombinant lentivirus-transducing Unitéiten an der Präsenz vun 6 μg /ML polybrene (GENECHEM) . VerfÜgung

Missiounen assay VerfÜgung

d'invasiv Fähegkeet vun der Zellen Transwells assayed war benotzt (8-μm, Corning ëmsou Verletzung pore Gréisst). D'Transwells sech an der Plaque 24-gutt no. Éischt, 0,1 ml Matrigel (50 μg /ml, BD Biosciences) war op der Plack Uewerfläch kommen an fir 2 h incubated, an dann war d'supernatant geläscht. Frësch trypsinized an Katakombe Zellen (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) waren an RPMI1640 mat 1% An et Bovine serum gespaart. Dunn 100 μl vun der Zell Ophiewe (1 × 10 5 Zellen) war an der ieweschter ëmkomm vun all Neiegkeet notéiert, datt mat Matrigel bedeckt war. Next, war an der ënneschter unzekräizen notéiert 450 μl vun RPMI1640 10% An et Bovine serum wouvun, an huet d'Zellen fir 24 h-48 h op 37 ° C an engem 5% CO _{2 humidified incubator ze violéieren erlaabt. No incubation, goufen d'Zellen mat 95% absolute Alkohol an Kierchefënster mat glaskloer mauve fest. Zellen op der ieweschter Uewerfläch vun der filter sech mat der Koteng Swab ofgegruewen an d'Zellen, datt an der leschter Uewerfläch vun der filter huet gezielt a Radioberäich ënnert en Inverted microscope (Olympus Corp. Tokyo, Japan) op × 200 Vergréisserung iwwer zéng eruewert hat zoufälleg Felder an all gutt. All Experimenter war zu triplicate gesuergt. VerfÜgung}

Zell Migratioun VerfÜgung

D'Kapazitéit vun GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, an SGC7901-M Zellen ze opgeholl gouf benotzt Transwells fonnt [8-μm pore Gréisst, Corning ëmsou Verletzung]. D'Transwells sech an der Plaque 24-gutt no. Frësch trypsinized an Katakombe Zellen sech am RPMI1640 mat 1% An et Bovine serum gespaart. 5 × 10 4 Zellen /gutt an d'Top ëmkomm vun all Neiegkeet (BD Biosciences, NJ), mat der Net-Beschichtete Membran plazéiert goufen. 450 μl vun RPMI1640 10% An et Bovine serum wouvun war an der ënneschter CHAMBERS notéiert. No incubating fir 24 h-48 h op 37 ° C an engem 5% CO _{2 humidified incubator, goufen Zellen mat 95% absolute Alkohol fix a mat glaskloer mauve Kierchefënster. D'Zellen am zentrale Chamber sech mat enger Koteng Swab ofgegruewen an un déi ënnescht Säit vun der Membran verbonnen Zellen sech um × 200 Vergréisserung iwwer zéng ënnerschiddleche Beräicher an all gutt ënner engem Inverted microscope (Olympus Corp. Tokyo, Japan) gezielt an Radioberäich . All Experimenter zu triplicate gesuergt huet. VerfÜgung}

An VIVO Metastasen assay VerfÜgung

Fir d'zu VIVO Metastasen assays, déi stabil Zell Linnen GC9811-P an SGC7901-M sech aus Otemschwieregkeeten Kultur Kréi der transfection recoltéiert mat der lentivirus pGCsil-GFP- loosse-7f an pGCsil-GFP Kontroll trypsin benotzt an Katakombe dräimol mat PBS. Dunn 2 × 10 6 Zellen sech zu 0,2 ml serum-gratis RPMI1640 fir all Maus (sechs vun all Grupp, Fale BALB /c-Nu /Nu, 6-8 Wochen aal) Sursis, an d'Zellen sech an der heijen Schwäif äusseren. No véier Wochen Sprëtzen, huet de Mais geaffert. Liewer Otemschwieregkeeten war mat bloussem A gesi ginn, an d'Zuel vun siichtbar erhéijen an der Liewer Uewerfläch gezielt gouf. Der Liewer Stoffer sech an Serien Rubriken agedeelt, mat phosphate-gefiermt neutral formalin fix, Kierchefënster mat hematoxylin an eosin an iwwerpréift histologically. Sauna Mais sech manipuléiert an Refuge fir no NIH Déieren Care an Benotzt Comité Direktiven am fonnt Déieren Center vun der véierter Military Medical University (Xian, Shanxi Province, PR China). VerfÜgung

Luciferase Reporter Assay

Fir ze kucken, ob MYH9 Ausdrock vun loosse-7f, engem Ofwaassersystem-luciferase reporter assay standing gereegelt gouf. Déi 3 "UTR vun MYH9 wouvun loosse-7f bindend Site war vun Hinnen alleguer Kick. Amplification vun MYH9 benotzt dëse primers: (Stiermer) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(Réckproduktioun) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3' VerfÜgung

Als negativ Kontroll, de mutated bindend Site vun der 3'-UTR Haaptrei (mat de Géigendeel komplementar vun der bindend Site) war mat der primers Implikatioune: (Stiermer) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 "(Réckproduktioun) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3 '. Produkter sech via agarose gelies electrophoresis Erhéijung, an an der luciferase reporter PsiCHECK Vecteure gekloonten (Promega, Madison, allem). All gesond sech duerch sequencing ubelaangt. Log Phase GC9811-P Zellen sech rakommen an 24-och Telleren an cotransfected mat Loosst-7f inhibitors oder Kontroll, an luciferase gemellt benotzt Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), folgende d'Uweisungen. No 48 h vu incubation, war Liichtkäfer an Renilla luciferase Aktivitéit mat de duebel luciferase reporter assay System (Promega) gemooss. VerfÜgung

Western Blot VerfÜgung

BTS sech zweemol mat Äis-kal PBS gewäsch a knappen an Ripa Prellbock (50 mm Tris-HCl pH 7.4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mm héich, 1 mm leupeptin, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) mat frësch protease inhibitor Cocktail dobäi (Roche) fir 15 min op Äis, centrifuged dann bei 13.000 Ziichter fir 10 min an der supernatants sech gesammelt. Zéng micrograms vun all Prouf war mat 6% SDS-PAGE geléist an transferéiert op engem nitrocellulose Membran (Bio-Rad, Hercules, CA). D'Bande ware mat 10% nonfat dréchen Mëllech an Tris-gefiermt Salins-0,1% Tween-20 incubated der nonspecific bindend Siten a mat enger Primärschoul antibody incubated zu Spär: Kanéngchen polyclonal anti-Mënsch myosin IIA (verdënntem 1:500; Zell sécher Technology ) Iwwernuechtung bei 4 ° C. No rewarming an wäschen dräi Mol widderholl, 15 min fir jidfereng, goufen d'Schläimhait mat horseradish-peroxidase-conjugated anti-Kanéngchen Secondaire antibody (Santa Cruz Déi), verdënntem fir zwou Stonnen am Raum incubated Temperatur 1:2000. D'Bande huet mat enger verstäerkter chemiluminescence System (Amersham Biosciences) fonnt. VerfÜgung

Immunohistochemistry VerfÜgung

Zwee Otemschwieregkeeten flamenden Ofgrond sech aus SHANXI CHAOYING CO Biotechnologie kaaft., LTD. One war gastric Kriibs Otemschwieregkeeten iwwereneestëmmen bascht normal Mo. Otemschwieregkeeten, déi aner gastric Kriibs Otemschwieregkeeten iwwereneestëmmen lymph Node Metastasen .Tissue flamenden Ofgrond huet sech zu 60 ° C dewaxed fir 2 h, héich Temperatur antigen Erhuelung fir 10 bedeit, rehydrated, zu 10% incubated normal Geess serum fir 1 h, dann mat Kanéngchen incubated polyclonal anti-Mënsch myosin II A (verdënntem 1:100; Zell sécher Technology) Iwwernuechtung bei 4 ° C. D'drënner waren am PBS dräimol fir 5 min all gewäsch. Stoffer sech an Geess anti-Kanéngchen serum (DAKO) fir 1 h, rinsed mat PBS incubated. Sektiounen benotzt botzt an counterstained mat hematoxylin fonnt. D'staining Intensitéit huet e véier Schrëtt Skala Faarwen benotzt (0, 1+, 2+, oder Iwwer 3) an de Prozentsaz vun positive Zellen war vun dräi verschiddene pathologists (0 = keen ugeholl, 1 = &Si besteet; 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = > 70% vun entholl Zellen). Duerchschnëtt all Deeler Fändelen sech dann an véier Kategorien gruppéiere: negativ (kee Magnéitfeld staining wann Verglach zu nonspecific Hannergrond staining évaluéiert, schwaach (+), moderéiert (++) oder staark (+++) an am Verglach mat Mann-Whitney Test

statistique Analys VerfÜgung

t-Test (two-tailed) d'Student, One-Manéier ANOVA a Mann-Whitney Test déi kënschtlech an VIVO Daten benotzt SPSS 12,0 Software (Chicago, IL ze analyséieren agestallt goufen , USA) P Wäert &Si besteet;. 0,05 war den statistesch relevant definéiert * P VerfÜgung &Si besteet;. 0,05; ** P VerfÜgung &Si besteet;. 0,01 VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

den Niveau vun loosse-7f Ausdrock war ofgeholl dacks zu Mënsch GC metastatic Zell Linnen an Stoffer VerfÜgung

Mir der mRNA Ausdrock Niveau vun op zwee Puer Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen, GC9811, GC9811 loosse-7f iwwerpréift hunn -P an SGC7901-NM, SGC7901-M. Als zu Dorënner 1A gewisen, Ausdrock vun loosse-7f niddreg am GC Zellen, GC9811-P an SGC7901-M, mat héich metastatic Potential, iwwerdeems loosse-7f méi war absolut ausgedréckt an der GC Zellen, GC9811 an SGC7901-NM, mat niddereg metastatic Potential. Fir weider d'Roll validéieren vun loosse-7f zu Metastasen gastric Kriibs Zellen, am Verglach mir den Ausdrock Niveau vun loosse-7f zu frësch Mënsch gastric Kriibs Otemschwieregkeeten uplanzen mat Investitiounen aus aacht Persounen (Table S1), ze normal gastric Stoffer (NG), Primär- gastric Kriibs Stoffer (GC) an fernen metastatic gastric Kriibs Stoffer (MC), respektiv, vun real-Zäit Hinnen alleguer. Intriguingly, et war bemierkenswäert downregulation vun loosse-7f an MC an GC, am Verglach zu loosse-7f Ausdrock vun NG (Dorënner 1B). Mir gesinn, dass entweder den Verloscht vun oder ofgeholl Ausdrock vun loosse-7f an erhéijen an hir metastatic Stoffer schéinen Eck Metastasen zu gastric Kriibs Stoffer. D'Resultater proposéiert all déi Ausdrock vun loosse-7f negativ ganz enk mat ofgeholl GC Investitiounen soll war an eventuell eng kruzial Roll an agebousst Prozesser Leeschtung. Mir hunn also Medeziner a bewosst konzeptuellen Beweiser fir eng metastatic Säitewiessel zu Kriibs Entwécklung gëtt, datt fir d'Expressioun vun loosse-7f zu Kriibs Entwécklung eng Schlësselroll mobiliséiert. VerfÜgung

Loosst-7f inhibited der invasiv an metastatic Fähegkeeten vun GC Zellen kënschtlech VerfÜgung

well loosse-7f Akten als agitator zu Invasioun an metastatic Prozesser, ze propagéieren mir d'Effete vun op manner-metastatic Zell Linnen loosse-7f ofgeholl a fräi loosse-7f op méi-metastatic Zell Linnen. Fir dat erreechen, sech kuerz interfering RNS (siRNA) oligonucleotides vun loosse-7f gebaut an agefouert an GC9811 Zellen an SGC7901 -NM Zellen fir Metastasen assays kënschtlech, wéi GC9811-loosse-7f-siRNA Zellen, SGC7901-NM-loosse-7f -siRNA Zellen a Kontroll Zellen. Soll, rescht-loosse-7f an negativ Kontroll oligonucleotides waren och gebaut an an GC9811-P Zellen an SGC7901-M Zellen fir Metastasen assays kënschtlech agefouert, wéi GC9811-P-loosse-7f-rescht Zellen, SGC7901-N-huet mer -7f-rescht Zellen a Kontroll Zellen. Ausschöpfung vun loosse-7f der Fähegkeet vun GC9811 Zellen ze opgeholl a violéieren duerch d'matrigel-Beschichtete Schläimhait oder d'Net-matrigel-Beschichtete Schläimhait Richtung serum-haltege mëttelfristeg an enger geännert Boyden Chambre assay (Dorënner 2A) bedeitend leider. Fräi Meenungsäusserung vun loosse-7f der Fähegkeet vun GC9811-P Zellen vill Trupen zu opgeholl a violéieren duerch matrigel-Beschichtete Schläimhait oder Net-matrigel-Beschichtete Schläimhait Richtung serum-haltege mëttelfristeg an enger geännert Boyden Chambre assay (Dorënner 2B), wou am Verglach mat der Kontroll Zellen. Ähnlech Resultater goufen am SGC7901-NM Zellen (Dorënner 3A) an SGC7901-M Zellen (Dorënner 3B), während loosse-7f Knockout am GC Zell Linnen schéinen héich Invasioun an Migratioun Tariffer. VerfÜgung

Loosst-7f bremst fonnt entholl Invasioun an Metastasen an enger Sauna Maus xenograft Modell VerfÜgung

GC9811-P oder SGC7901-M transfected entholl Zellen mat der lentivirus pGCsil-GFP- loosse-7f oder negativ Kontroll pGCsil-GFP an Sauna Mais heijen sech an d 'Mais huet véier Wochen no der inoculations geaffert. D'Zuel vun metastatic nodi war an der Sauna Mais mat der pGCsil-GFP- loosse-7f transfected Zellen heijen dramatesch reduzéiert, wann am Verglach zu den negativen Kontrollen (Dorënner 4A, 4B). Dës Donnéeë staarke Beweis datt-7f loosse kann entholl Invasioun an Metastasen zu VIVO inhibit. VerfÜgung

Loosst-7f downregulates myosin IIA Ausdrock vun direkt gezielt seng 3 'UTR VerfÜgung

Fir weider de Mechanismus Entdeckung vun wat loosse-7f Hien GC Invasioun an Metastasen, mir Potential afgerappt entholl Metastasen-Zesummenhang Zil- Genen vun silico analyséiert. Mir Schwéierpunkt op loosse-7f Zil- Genen, besonnesch déi Genen, déi stattfonnt huet an /oder Invasioun-dinn, an fonnt dass myosin IIA, an der Promotioun vun Kriibs Zell Migratioun oder Invasioun Équipe, kéint d'Zil Gentherapie vun loosse-7f ginn. An en Effort ob myosin IIA ze bestëmmen ass reegelen loosse-7f duerch direkt bindend fir hir 3 'UTR, gebaut mir Wëllschwäin-Typ an Mann- Fragmenter vun MYH9 mRNA 3 voll-Längt' UTR, an hin se an der Regioun direkt matgeholl vun engem luciferase reporter Gentherapie (Dorënner 5A). Duerno, loosse-7f rescht oligos sech Co-transfected mat verschiddene luciferase 3 'UTR gesond an GC9811-P Zellen. Mir hu fonnt, datt mer-7f der famill luciferase Aktivitéit am Wildwest-Typ 3 'UTR vun MYH9 (Dorënner 5B) ofgeholl. Allerdéngs huet luciferase Aktivitéit net staark an der UTRs mat Mann- bindend Siten erof, wann am Verglach zu den Mut-Typ garantéieren (Dorënner 5C). Dës Donnéeë Ënnerstëtzung datt MYH9 direkt Zilscheif vun loosse-7f ass. VerfÜgung

RT-Hinnen alleguer gewisen datt den Ausdrock vun MYH9 zu GC9811 Zellen an SGC7901-NM Zellen transfected mat loosse-7f-mimics ass downregulated Verglach zu deenen Zellen transfected mat Kontroll gesond (Dorënner 5D). Western blotting Resultater zougedréckt Ausdrock vun myosin IIA vun GC9811 an SGC7901-NM Zellen transfected mat loosse-7f-mimics sinn verwandelt-reegelen Verglach zu deenen transfected mat negativen Kontroll (Dorënner 5E). Furthmore, Real-Zäit Hinnen alleguer weist dass mRNA relativ Ausdrock vun MYH9 am GC Stoffer an fernen metastatic Otemschwieregkeeten sinn verwandelt-reegelen Verglach mat hir normal bascht Net-kriibserreegend uplanzen (Dorënner 6A). Immunohistochemistry gewisen, datt de Begrëff vun myosin IIA vun GC lymph Node Metastasen ass up-reegelen Verglach mat hirer Primärschoul GC Otemschwieregkeeten (Table 2; Dorënner 6C; Dorënner S1B), an et gëtt weider-reglementéiert GC Otemschwieregkeeten Verglach mat sengen reagéiert bascht normal Mo. Otemschwieregkeeten (Table 1; Dorënner 6B; Dorënner S1A) .These Donnéeën déi beweisen datt mer-7f kann erof-regléieren der mRNA Ausdrock vun MYH9 a kann FAQ Iwwersetzung vun et VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

géint an. de Moment studéieren, hien huet mir dat loosse-7f Ausdrock vun metastatic GC Zell Linnen downregulated war wéi an net-metastatic GC Zellen ze loosse-7f Ausdrock Verglach. Ectopic Ausdrock an siRNA knockdown vun loosse-7f bestätegt seng Invasioun-suppressing Aktivitéit kënschtlech an VIVO. Desweideren, weisen mir dat MYH9 engem direkten Zil fir loosse-7f an dëser loosse-7f mediated Ennerdréckung vun MYH9 ass op seng 3'-UTR ofhängeg ass. Dofir, Highlight dës Resultater d'Bedeitung vun loosse-7f als entholl suppressor zu Zell Invasioun an Metastasen vun MYH9 zu gastric Kriibs gezielt. VerfÜgung

rezenten Etuden weisen, datt miRNAs als activators oder inhibitors vun entholl Metastasen Akt kann [27] . Zum Beispill, microRNA-10b [28], Mir-373 an Mir-520c [29], [30] stimuléiert Kriibs Zell Wanderung an Invasioun an Broscht Kriibs. Zousätzlech Mir-155 kann entholl Invasioun an Metastasen zu Broscht Kriibs vun downregulating sengem Zil, RhoA [31] a förderen entholl Invasioun an Metastasen zu Bauchspaicheldrüs duct carcinoma vun repressing den Ausdrock vun TP53INP1 [32] förderen. D'miRNA-200 Famill (miRNA-200a, miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-141 an miRNA-429) kann entholl Invasioun an Metastasen vun der EMT Regulatioun [33] inhibit. Mir-126 gouf fonnt Zell Haftung, Migratioun an Invasioun deelweis duerch d'Ennerdréckung vun CRK an eng kënschtlech Modell vun Net-kleng-Zell haett carcinoma zu inhibit [34]. Et gouf gewisen, datt Mir-29c vill an héich invasiv an metastatic nasopharyngeal carcinoma reduzéiert ass [35]. Mir-218 bremst der Invasioun an Metastasen vun gastric Kriibs vun der Robo1 receptor gezielt [26]. Obwuel vill Studien de Mechanismus vun miRNA an entholl Metastasen ze ermëttelen, huet de Mechanismus net kloer gemaach goufen. Wichteg, hunn puer Studien iwwert d'Mechanisme vun GC Metastasen Regulatioun vun microRNA gemaach ginn. VerfÜgung

D'loosse-7f Gentherapie ass um 9q22.3 läit, an ass an enger Rei vu gestallt an agebousst Prozesser Équipe, dorënner angiogenesis [36], immunocyte dat [37], replicative senescence [38], Wuesstem verhaft [39], hin arterial finanzéieren an carcinogenesis [23]. Loosst-7f zu puer malignancies downregulated ass. Eng héich charakteriséiert Beispill ass keen Auto Zell carcinoma, an déi loosse-7f zu engem groussen Verloscht am kallikrein (KLK) Ausdrock [40] gefouert downregulation. KLKs kann och duerch loosse-7f zu spillt Kriibs [25] cibléiert ginn. An papillary Schild Kriibs, reduzéiert Ausdrock vun loosse-7f vläicht e wesentleche molekulare Event am RET /PTC malignant Transformatioun [41] ginn. Am Fall vun der Primärschoul Broscht Kriibs, awer, loosse-7f upregulated war wéini normal bascht entholl Stoffer Verglach [22]. An eiser Etude, hien huet mir dat loosse-7f och an MC Stoffer an GC Zell Linnen mat héije metastatic Potential downregulated ass, a mir lant weider de Mechanismus vun deem loosse-7f reduzéiert entholl Invasioun an Metastasen. VerfÜgung

MYH9 ass der Gentherapie, fir Net-Fleesch myosin schwéier Kette IIA (NMHCIIA), dirigéiert Projet'en si responsabel fir eng komplex Stéierungen MYH9-Zesummenhang Krankheet genannt, duerch eng Kombinatioun vu verschiddene phenotypic Fonctiounen charakteriséiert [42]. NMMHC-IIA, engem 1960 Aminosaier polypeptide, mat engem iwwersat molekulare Gewiicht vun 220 kDa, ass eng konventionell, Net-sarcomeric am meeschte Zellen an Stoffer ausgedréckt myosin. Seng Funktioun och Rollen an cytokinesis, Zell motility, an Ënnerhalt vun Zell Form [43]. Vill Studien hindeit datt MYH9 /NMHC-IIA eng Schlësselroll an entholl Zell invasiv behavior.For Beispill huet, de EGF-ofhängeg phosphorylation vun der myosin-IIA schwéier Kette huet en direkten Roll motility an chemotaxis zu MDA-MB-231 Mënsch zu mediating Broscht Kriibs Zellen [44]. Myosin IIA ebenfalls e grousse bewosst Zilscheif vun mts1 ginn [45], de klenge Kalzium-verbindlech FAQ metastasin-1, a Co-localizes mat mts1 zu de féierende Wäitschoss Kriibs Zellen vun wanderen [46]; mts1 Afloss souwuel d'Versammlung Behuele vun myosin IIA a seng phosphorylation [47], [48]. Eng rezent Rapport implicates MYH9 (NMHC-IIA) als Zil vun SRF, déi zu Invasioun an Metastasen zu Broscht Kriibs dréit [49]. Eis Donnéeë weisen datt MYH9 der direkter Zilscheif vun loosse-7f ass, déi vun bindend der 3'UTR vun MYH9 Invasioun an Metastasen inhibited, déi an der downregulation vun myosin IIA Ausdrock virgedroen. VerfÜgung

An Conclusioun, eiser Etude weist datt mer-7f kann duerch direkt bindend der 3'UTR vun MYH9, säin Zil d'Invasioun an Metastasen vun gastric Kriibs oofgesinn. Obwuel et nach vill ze léieren iwwer d'Roll vun loosse-7f zu gastric Kriibs tumorigenesis ass, loosse-7f eis fir gastric Kriibs Behandlung mat engem neien potentiellen Zil stellt. VerfÜgung

Informatiounen Ennerstëtzung VerfÜgung Dorënner S1. Den Ausdrock vun MYH9 zu gastric entholl uplanzen VerfÜgung. (A) Expression vun MYH9 am primäre gastric Kriibs (Ca) a seng bascht normal Mo. Otemschwieregkeeten (N) vun IHC. (B) Expression vun MYH9 am primäre gastric Kriibs (Ca) a seng reagéiert lymph Node Metastasen Otemschwieregkeeten (M) vun IHC VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s001 VerfÜgung (TIF) VerfÜgung Table S1. VerfÜgung Clinicopathologic Fonctiounen an 8 frësch gastric entholl Echantillon. VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s002 VerfÜgung (Intrigue) VerfÜgung

Arbeschterlidder VerfÜgung

Mir sinn dankbar fir Zheng Chen fir excellent Orientatioun während der Experimenter VerfÜgung

• PLOS NËMMEN: Oncogenic CagA förderen Gastric Cancer Risk via Activating Erk sécher Weeër: Eng gemaach Case-Control Sécuritéit
• PLOS NËMMEN: Wnt /β-Catenin sécher Cyclooxygenase-2 (COX2) Transcriptional Aktivitéit zu Gastric Cancer Cells