PLoS ONE: mikrornk Let-7f Sprječava Invazija tumora i metastaze ciljajući MYH9 u ljudske želučane Cancer

Sažetak

Pozadina pregled

mikroRNA (miRNAs) su važni regulatori koji igraju ključnu ulogu u nastanku tumora i progresija tumora. Prethodno izvješće je pokazalo da članovi neka-7 obitelji mogu djelovati kao tumor smetnji u mnogim raka. Kroz Mirna polje, otkrili smo da su neka-7f je regulirani u vrlo metastaziranja raka želuca staničnim linijama GC9811-P i SGC7901-M, u usporedbi s njihovim roditeljskim staničnim linijama, GC9811 i SGC7901-NM; Međutim, mehanizam nije bio jasan. U ovom istraživanju, istražujemo da li neka-7f djeluje kao supresor tumora na inhibiraju invaziju i metastaziranje u želučanim raka. Pregled

Metodologija /Glavni pregled

Real-time PCR pokazale smanjenu razinu neka-7f ekspresija u metastatskim želučanom tkivu karcinoma i staničnih linija koje su potencijalno veoma metastatski. Cell invazija i migracija bili su značajno umanjena u GC9811-P i stanične linije SGC7901-M nakon transfekcije s neka-7f-oponaša. Nude miševi s modelima sa raka želuca potvrdio da neka-7f mogao spriječiti želučane metastaza raka in vivo nakon transfekcije strane lentivirus pGCsil-GFP- neka-7f. Reporterski testovi pokazali da neka-7f direktno veže na 3'UTR MYH9, koji kodira za miozina IIA, i real-time PCR i Western blot-navodi se kako neka-7f regulirani izražavanje miozina IIA u mRNA i proteina . pregled

Zaključci /Značaj pregled

Naša studija je pokazala da prekomjerna ekspresija neka-7f kod raka želuca može spriječiti invaziju i migraciju stanica želuca raka kroz izravno ciljanje tumorskih metastaza-povezana gena MYH9. Ovi podaci ukazuju na to da neka-7f može biti novi terapijski kandidat za rak želuca, s obzirom na njegovu sposobnost da se smanji invaziju i metastaziranje stanica pregled

Izvor:. Liang S, On je L, Zhao X, Miao Y, Gu Y, Guo C, et al. (2011) mikrornk Let-7f inhibira Invazija tumora i metastaze ciljajući MYH9 u ljudskoj raka želuca. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10,1371 /journal.pone.0018409 pregled

Urednik: Donald Gullberg, Sveučilište u Bergenu, Norveška pregled

Primljeno: 27. rujna 2010. godine; Prihvaćeno: 7. ožujka 2011; Objavljeno: 18. travanj 2011 pregled

Copyright: © 2011 Liang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 30801330, broj 30871143, broj: 81030044)) i Nacionalnog Basic Research programa Kine (br 2010CB529300, br 2010CB529306). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je najčešći zloćudni tumor probavnog sustava u istočnoj Aziji, istočnoj Europi i dijelovima srednje i Južne Amerike, te je drugi vodeći uzrok smrti od raka povezane s [1]. Rasprostranjena metastaza je bio glavni razlog za tužan ishod GC pacijenata. Metastaza je složen, multi-korak proces u kojem stanice raka seliti iz primarne neoplazme s udaljenog mjesta [2]. Postupak započinje kada primarna tumorske stanice napadaju susjedna tkiva, a nakon toga stanice koje ulaze u krvotok (intravasation), premještanjem kroz krvne žile, koja izlazi iz krvnih žila (ekstravazacije) u okolni parenhima tkiva inicijaciju mikrometastaza i konačno proliferirajućih tvore makroskopska sekundarni tumori [3]. Jedan od ključnih regulatora koji su uključeni u ovaj proces je mikrornk (Mirna) [4]. Pregled

mikroRNA (miRNAs) su klasa endogenih i malih non-coding regulatorne RNA koji reguliraju gene u post- razini transkripcije [5]. Zreli miRNAs može prepisao RNA polimeraze II i generiraju iz sekvencijalnog preradu primarnih Mirna transkripata od strane Drosha i kockar; onda oni služe kao posttranskripcijsko regulatori ekspresije gena kroz komplementarne sparivanja baza na messenger RNA [6]. Mnogi izvještaji pokazuju da miRNAs imaju ključnu ulogu u različitim biološkim procesima, uključujući staničnu diferencijaciju, proliferaciju, apoptoze, otpornosti na stres, metabolizam masti, tumorogeneze i metastaziranja tumora [7], [8], [9]. Pregled

dopustite-7 obitelj je sačuvana obitelj miRNAs. Neka-7 izvorno zabilježeno je u nematoda Caenorhabditis elegans [10], i četrnaest članova su pronađeni do sada [11]. Nedavno, pronađeni su razinu ekspresije mnogih članova neka-7-obiteljske treba smanjiti na razne vrste raka. Na primjer, neka-7 regulirani kod raka pluća, melanoma, te glave i vrata pločastih karcinoma, dok prekomjerna ekspresija neka-7 može spriječiti rast stanica raka [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Nekoliko onkogeni, kao što RAS, myc i HMGA2, neposredni su ciljevi neka-7 [19], [20], [21]. Neka-7f je jedan član neka-7 obitelji. Prethodne studije su pokazale da neka-7f je viša u primarni karcinom dojke i potiče angiogenezu [22]; regulacija u PAH [23] je uzrokovano kroničnim hipoksijom ili monocrotaline u štakora, a razina je smanjena u plazmi vezikule NSCLC bolesnika [24]. Dodatno, neka-7f utječe na staničnu proliferaciju ciljajući kalikreina vezane peptidaza (KLKs), porodica serin proteaze za koje je pokazano da se dereguliran u nekoliko malignih bolesti, uključujući karcinom jajnika [25]. Pregled

laboratorij je prethodno identificirali skupinu različito izraženi miRNAs između GC9811 i GC9811-P stanica kroz high-profile mikrornk čip analize koje sadrže neka-7f [26]. Tijekom daljnje karakterizacije neka-7f u različitim staničnim linijama raka, otkrili smo da su neka-7f funkcionira kao metastaza valova. Pojačana ekspresija malo-7f može suzbiti GC stanica invaziju i migraciju in vitro i in vivo. Do Bioinformatika analiza, utvrdili smo da je MYH9, koji kodira teški lanac miozin II a koji su uključeni u promociju migracije stanica raka ili invazije, kao navodni neka-7F metu. Naknadne eksperimenti su potvrdili da je neka-7f može smanjiti regulaciju ekspresije miozin II a ciljajući 3'UTR MYH9, koji pruža mogući cilj za GC liječenje. Pregled

materijali i postupci

skup tkiva pregled

Primarni želučani tumorskih tkiva, susjedne ne-tumorske želučani tkiva i udaljene metastaze želučani tkiva dobiveni su od pacijenata koji su se podvrgnuli operaciji na Xijing bolnici bolesti probavnog sustava u Xi'an, Kina. Svi uzorci su klinički i patološki pokazala da se pravilno označeni. Pacijenti koji nude uzorke za istraživanje potpisali informirani pristanak oblike. Pregled

Kultura stanica pregled

ljudske stanične linije raka želučani GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M konzervirani su u našem vlastitom laboratoriju i bili su u RPMI1640 (HyClone), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma. (FBS; Gibco), 100 jedinica /ml penicilina i 0.1 mg /ml streptomicina na 37 ° C u vlažnoj 5% inkubatoru ugljičnog dioksida pregled

ekstrakcija RNA i real-time PCR pregled

QRT-PCR za određivanje razine ekspresije potencijalnih neka-7f ciljnih gena. Ukupna RNA je ekstrahirana iz tkiva ili stanica u kulturi pomoću Trizol reagensa (Invitrogen Life Technologies). Komplementarne DNA (cDNA) generirano je pomoću TaqMan reverzne transkripcije Kit (Applied Biosystems). Real-time PCR analize su izvedene sa TaqMan Micro-RNA Assay kompleta (Applied Biosystems). Primer za neka-7f je kupljen od Ambion (MI0000437). Primer za MYH9 slijed je dizajniran pomoću programa Primer Express (verzija 1.5). Primer-MYH9 slijed: (Naprijed) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 '(unatrag) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All protokoli su provedeni u skladu s uputama proizvođača. Razina izraz neka-7f normalizirana je 5S (naprijed: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 '; pregled

Reverse: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3'). Razina izraz MYH9 je normaliziran to18S (Naprijed: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 '; pregled

Reverse: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') PCR i prikupljanje podataka učinjena su na iCycler (Bio-Rad).. Svaki uzorak je tri puta pregled

Vector gradi i lentivirus proizvodnje pregled

pri-neka-7f slijed izgrađena je kako slijedi:. (Forward) HSA-neka-7f-1 Xhol AKO GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (unatrag) HSA-neka-7f-1 BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Sekvenca je pojačan i kloniran u pGCsil-GFP vektor (GENECHEM) za generiranje pGCsil-GFP- neka-7f. Negativna kontrola je PGŽ FU-RNAi-NC-LV. Virus pakiranja je izvedena u HEK 293T stanica nakon kotransfekcijom 20 ug pGCsil-GFP pusti 7F vektor s 15 ug plazmida pakiranja pHelper 1,0 vektora i 10 ug ovojne plazmida pHelper 2,0 vektor korištenjem LipofectAMINE 2000 (Invitrogen). Virusi su sakupljene 48 h nakon transfekcije, te su određene virusne titre. Pregled

Oligonukleotid gradnja pregled

neka-7f oponaša, neka-7f inhibitora i negativna kontrola siRNA nukleotida su chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co, Ltd). Oligonuklcotidi koji su korišteni u ovim studijama bili ima-neka-7f oponaša: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 '; pregled

oponaša negativna kontrola: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3', ima-neka-7f inhibitor: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 '. MircoRNA inhibitora negativna kontrola: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 '

Cell transfekcija

Stanice su uzgajane do 80% do 90% spajanja nakon nasađene u ploče sa 6 jažica, a transfektirane su s lipofektaminom 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA), u skladu s uputama proizvođača. Za prolazne transfekcije, stanice u svakoj jažici 6 jažica su transficirane s inhibitorom 12,5 ul Mirni ili 7,5 ul Mirni mimičkih oligonukleotide. Nakon 48 sati transfekcije, stanice su skupljene za daljnje pokuse. Za stabilno transfektiranih stanica, stanice su transfektirane s lentivirus na 30% -50% pokrivenosti. Ciljne stanice (1 × 10 ^{4), uključujući i GC 9811-P i SGC7901-M stanice, bilo je inficirano s 1 x 10 6 rekombinantni jedinice lentivirusom transformacijom u prisutnosti 6 ug /ml polibrena (GENECHEM) . pregled}

test invazije pregled

invazivni sposobnost stanica ispitana je pomoću Transwells (8 um veličina pora, Corning Costar Corp). A Transwells bili stavljeni u 24 jažica. Prvo, doda se 0,1 ml Matrigel (50 ug /ml, BD Biosciences), na površinu ploče i inkubirane kroz 2 sata, a zatim se supernatant ukloni. Svježe tripsinizirane i isprane stanice (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NMR, SGC7901 M) suspendira se u RPMI1640 koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma. Zatim 100 ul stanične suspenzije (1 × 10 ^{5 stanica) doda se u gornju komoru svake umetka koji je prevučena Matrigel. Dalje, 450 ul RPMI1640 koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma doda se u donji odjeljak i stanice su ostavljene da se invaziju za 24 h-48 h na 37 ° C u CO s 5% _{2 vlažnom inkubatoru. Nakon inkubacije, stanice su fiksirane s 95% apsolutnog alkohola i obojeni Kristal violet bojom. Stanice na gornjoj površini filtera su uklonjene sa štapićem obloženim vatom, a stanice koje su izvršile invaziju u donjoj površini filtra su izbrojene i promatrani pod invertiranog mikroskopa (Olympus Corp. Tokyo, Japan) na × 200 povećanjem više od deset slučajnih polja u svaku jažicu. Svaki pokus je proveden u tri primjerka. Pregled}}

migracija stanica pregled

Sposobnost GC9811, GC9811-P, SGC7901-nm i SGC7901-M stanice seliti se otkriti pomoću Transwells [8-um pora veličina, Corning Costar Corp]. A Transwells bili stavljeni u 24 jažica. Svježe tripsinizirane i isprane stanice su suspendirane u RPMI1640 koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma. 5 × 10 ^{4 stanica /jažici su smješteni u gornjem komori svakog umetka (BD Biosciences, NJ), u ne-obloženih membranom. 450 ul RPMI1640 koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma doda se u donje komore. Nakon inkubacije tijekom 24 h-48 h na 37 ° C u CO s 5% _{2 vlažnom inkubatoru, stanice su fiksirane s 95% apsolutnog alkohola i obojeni Kristal violet bojom. Stanice u unutarnjoj komori su uklonjene pamučnom krpom i stanice pričvršćeni na donjoj strani membrane, su izbrojene i promatrani pod invertiranog mikroskopa (Olympus Corp. Tokyo, Japan) na x 200 povećanje deset slučajnih polja za svaku jažicu , Svaki eksperiment izveden trostruko. Pregled}}

In vivo ispitivanje metastaza

Za in vivo testovima metastaza, stabilne stanične linije GC9811-P i SGC7901-M su sakupljene iz tikvica za kulturu tkiva nakon transfekcije s lentivirus pGCsil-GFP- pusti 7f i kontrolu pGCsil-GFP korištenjem tripsina i isprane tri puta s PBS. Zatim 2 × 10 ^{6 stanice su suspendirane u 0.2 ml RPMI1640 seruma za svakog miša (šest u svakoj skupini, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 tjedana starosti), a stanice se ubrizgava u repnu venu. Nakon četiri tjedna nakon injekcije, miševi su žrtvovani. Tkivo jetre je opaženo golim okom, i izbrojen je broj vidljivih tumora u površini jetre. Tkiva jetre podijeljeni su u serijskim sekcija, fiksne sa fosfat-puferiranom neutralnom formalinu, obojeni s hematoksilinom i eozinom i ispituje histološki. Goli miševi su bili manipulirani i zbrinute u skladu s NIH Animal Care and Use Odbora smjernica u eksperimentu životinja Center of Vojnomedicinsku Sveučilišta Četvrte (Xi'an, Shanxi Province, NR Kina). Pregled}

luciferaze Test

Kako bi istražili da li izraz MYH9 je regulirana neka-7f, dual-Reporterski je analiza provedena. 3 'UTR MYH9 sadrži neka-7f mjesta vezanja su povećani pomoću PCR. Pojačanje MYH9 koristiti slijedećih primera: (Forward) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(unatrag) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3' pregled

Kao negativna kontrola, mutirani veznih mjesta na 3'-UTR slijed (pomoću reverzni komplement vezanja) umnožen primjenom primera: (naprijed) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 '(reverse) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3'. Proizvodi su isušene preko agaroza gel elektroforeze, i kloniran u luciferaznog reporter PsiCHECK vektor (Promega, Madison, WI). Svi konstrukti su potvrđene sekvencioniranjem. Prijava faze GC9811-P stanice su posađene u 24 jažica i transfektirano s Let-7f inhibitora ili kontrole, i izvjestitelja luciferaze pomoću Lipofektamin ™ 2000 (Invitrogen), slijedeći upute. Nakon 48 sati inkubacije, krijesnice i Renilla luciferaze se mjeri sa sustavom reporter ispitivanje s dvostrukom luciferaze (Promega). Pregled

Western blot pregled

Stanice su isprane dva puta s ledeno hladnim PBS i sastrugane u RIPA pufera (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptina, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) svježe doda koktel inhibitora proteaze (Roche) na 15 minuta na ledu, a zatim centrifugirana pri 13000 rpm kroz 10 min i supernatanti se skupe. Deset mikrograma svakog uzorka je otopljeno koristeći 6% SDS-PAGE i prenesen na nitroceluloznu membranu (Bio-Rad, Hercules, CA). Opsezi su inkubirani s 10% -tnim nemasnim suhim mlijekom u Tris-puferiranoj fiziološkoj otopini-0,1% Tween-20 i blokiraju nespecifičnih vezajućih mjesta i inkubiraju s primarnim antitijelima zečjeg poliklonskog anti-humani miozin IIA (razrijeđen 1:500 Cell Signalling Technology ) preko noći na 4 ° C. Nakon rewarming i ponoviti ispiranje tri puta, 15 minuta za svaku od njih, membrane se inkubiraju s hren-peroksidazom-konjugirani anti-kunić sekundarnim protutijelom (Santa Cruz Biotechnology), razrijeđena 1:2000 tijekom dva sata na sobnoj temperaturi. Bendovi su detektirani pomoću poboljšane sustav hemiluminiscenciju (Amersham Biosciences). Pregled

Imunohistokem pregled

Dva polja tkiva nabavljeni su od Shanxi CHAOYING Biotehnologija CO., LTD. Jedan je bio rak želuca tkiva i uparen susjedni normalno tkivo želudac, a drugi je rak želuca tkiva i uparen limfnog čvora metastaza .Tissue nizovi su odvoštiti na 60 ° C tijekom 2 sata, na visokoj temperaturi oporavka antigen 10 minuta, rehidratirano, inkubirane u 10% normalni kozji serum tijekom 1 h, zatim inkubirane sa zečjim poliklonskim anti-humanog miozin II A (razrijeđen 1:100, Cell Signaling Technology) preko noći na 4 ° C. Rezovi su isprani u PBS tri puta po 5 minuta svaki. Tkiva su inkubirani u kozjim anti-zečjim serumom (DAKO) u trajanju 1 h, ispere s PBS. Sekcije su detektirane DAB, uz kontrastnu boju hematoksilin. Intenzitet bojenja je zabio pomoću četiri koraka skale (0, 1+, 2+ ili 3+) i postotak pozitivnih stanica je procijenjena na tri različita patologa (0 = nema, 1 = < 1%, 2 = 1 10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = > 70% tumorskih stanica). Ukupno prosjeku postigli su zatim grupirane u četiri kategorije: negativno (ne može se detektirati bojenje kada ocjenjuje u odnosu na nespecifične pozadine bojenje, slab (+), umjerena (++) ili jaki (+++) i uspoređene pomoću Mann-Whitney testa

Statistička analiza pregled

t-test (dvosmjerni), One-way ANOVA i Mann-Whitney test je korišten za analizu in vitro i in vivo podataka pomoću SPSS 12.0 softvera (Chicago, IL , SAD) P vrijednost. < 0.05 je definirana kao statistički značajna * P pregled. < 0,05; ** P pregled. < 0,01 pregled

Rezultati pregled

razina neka-7F izraza često je smanjen u ljudski GC metastatskim stanicama i tkivima pregled

Mi smo ispitali razinu ekspresije mRNA neka-7f u dva para ljudskih staničnih linija raka želuca, GC9811, GC9811 P i SGC7901-NMR, SGC7901-M. Kako je prikazano na slici 1A, ekspresija neka-7f su niža u GC stanicama, GC9811-P i SGC7901-M, s visokom metastaziranja, a neka-7f je više visoko izražene u GC stanicama, GC9811 i SGC7901-NM, s niskim metastaziranja. Kako bi se dodatno potvrditi ulogu neka-7f u želučanom stanice raka metastaza, dok je razina ekspresije neka-7f u svježem ljudskih jedinki s metastazama želučanog raka tkiva iz osam osoba (Tablica S1), u normalnim želučanog tkiva (NN), primarna želučani tkiva raka (GC) i udaljene metastaze želučani tkiva raka (MC), odnosno, u realnom vremenu, PCR. Zanimljivo, tamo je bio izvanredan podreguliranje neka-7f u MC i GC, u odnosu na neka-7f izraz u NG (Slika 1B). Uočili smo da je bilo gubitak ili smanjena ekspresija neka-7f u tumorima i njihove metastaze tkiva rezultirao pojačanom metastaza u želučanog tkiva raka. svi Rezultati su pokazali da je izražavanje neka-7f negativno korelirana vrlo blisko s smanjen GC metastaza i može igrati ključnu ulogu u patološkim procesima. Time smo pod uvjetom kliničku i staničnu konceptualni dokaze za metastatski prekidač u razvoju raka koji sugerira ključnu ulogu za izražavanje neka-7f u razvoju raka. Pregled

Let-7f inhibiran invazivnih i metastatskih sposobnosti GC stanicama In vitro pregled

Zato neka-7f djeluje kao miješalicom u invaziji i metastatskih procesa, istražili smo učinke smanjene neka-7F na manje metastatskih staničnim linijama i povećana neka-7F o više-metastatskih staničnim linijama. Da bi se to postiglo, kratka ometa RNA (siRNA) oligonukleotidi neka-7f su izgrađene i uključene u GC9811 stanice i SGC7901 -NM stanica za metastaziranje pokusima in vitro, kao GC9811-neka-7f-siRNA stanice, SGC7901-NM-neka-7f -siRNA stanice i kontrolnih stanica. Istovremeno, mimic pusti 7f i negativni kontrolni Oligonukleotidi su također bio izrađen i uveden u GC9811-P stanica i SGC7901-M stanice za metastaza pokusima in vitro, kao što je GC9811-P pusti 7f-ličiti stanice SGC7901-N-ima neka -7f-oponašaju stanice i kontrolnih stanica. Iscrpljivanje neka-7f znatno umanjena sposobnost GC9811 stanicama migraciju i invaziju kroz Matrigel obložene membrane ili ne-Matrigel obložene membranama prema (slika 2a) koji sadrži serum medij u modificiranom komorni testu Boyden. Povećana ekspresija neka-7f značajno suprimira sposobnost GC9811-P stanicama migraciju i invaziju kroz Matrigel obložene membrane ili non-Matrigel obložene membrane prema medij koji sadržava serum u modificiranog Boyden Chamber analizi (slika 2B), u odnosu na kontrolne stanice. Slični rezultati su nađeni u SGC7901-NM stanice (slika 3A) i SGC7901-M stanica (Slika 3b), dok su neka-7f nokaut u staničnim linijama GC rezultiralo višim cijenama invazije i migracija. Pregled

Let-7f inhibira metastazirajući tumor u modelu ksenografta golog miša pregled

GC9811-p ili SGC7901-M tumorske stanice transfektirane s lentivirus pGCsil-GFP- pusti 7f ili negativna kontrola pGCsil-GFP ubrizgano je u gole miševe i u miševa su žrtvovani četiri tjedna nakon inokulaciju. Broj metastatske nodi bio je drastično snižen u gole miševe injektirane sa pGCsil-GFP- pusti 7f transfektiranih stanica, u usporedbi s negativnim kontrolama (Slika 4A, 4B). Ovi podaci pružaju čvrste dokaze da je neka-7f može spriječiti tumorske invazije i metastaziranja in vivo. Pregled

Let-7f downregulates miozin IIA izraz izravno ciljanje svoje 3 'UTR

Kako bi se dodatno istražiti mehanizam koji neka-7f potiskuje GC invaziju i metastaziranje, analizirali smo potencijalne nizvodno metastaza tumora povezanih ciljnih gena u silico. Usredotočili smo se na pusti 7f ciljnih gena, posebno one gene koji su migracije i /ili invazija vezane, i utvrdili da miozin IIA, koji su uključeni u promociju migracije stanica raka ili napada, može biti meta gen neka-7f. U nastojanju da se utvrdilo da li miozin IIA regulirano je neka-7F putem direktnog vezanja na svoje 3 'UTR, konstruirali smo full-length divljeg tipa i mutiranih fragmente MYH9 mRNA 3' UTR, i umetnut ih u regiji neposredno nizvodno od reporter gena luciferaze (Slika 5A). Nakon toga, neka-7f oponašati oligonukleotide duge sutransficirana su s različitim luciferaze 3 'UTR konstruira u GC9811-P stanicama. otkrili smo da neka-7f smanjio relativne aktivnosti luciferaze u divljem tipu 3 'UTR od MYH9 (Slika 5B). Međutim, aktivnost luciferaze nije oštro pasti u UTRs s mutiranim veznih mjesta, u usporedbi s kolegama mut-tipa (Slika 5c). Ti podaci podupiru to MYH9 izravna meta neka-7F. Pregled

RT-PCR je pokazao da je ekspresija MYH9 u GC9811 stanicama i SGC7901-NM stanica s transfektiranim omogućuju-7f-oponaša se regulirani u odnosu na one stanice transfektirane s kontrolnim konstruktima (Slika 5D). Western hibridizacije rezultati su pokazali ekspresiju miozina IIA u GC9811 i SGC7901-NM stanice transficirane s neka-7f-oponaša su dolje regulirana u usporedbi s onima transfecirane negativnu kontrolu (Slika 5E). Furthmore, real-time PCR pokazuje da mRNA relativna ekspresija MYH9 u GC tkiva i dalekoj metastatskim tkiva su dolje regulirana u usporedbi s njihovim uobičajenim susjednih non-kancerogen uzoraka (slika 6a). Imunohistokemija je pokazala da je ekspresija miozina IIA u GC limfnog čvora metastaza doregulirana u usporedbi s primarnim GC tkiva (tablica 2; slika 6C Slika S1B), a to je viša u GC tkivu u usporedbi s uparen susjedni normalnom želuca tkiva (Tablica 1, Slika 6B Slika S1A) dužnici podaci pokazuju da je neka-7f može down-regulaciju ekspresije mRNA za MYH9 i može potisnuti proteina prijevod njega pregled

Rasprava pregled

. ova studija, pokazali smo da je neka-7f izraz u staničnim linijama metastatski GC je regulirani u odnosu na neka-7f izraz u ne-metastatskih GC stanicama. Izvanmaternične izražavanje i siRNA obaranje neka-7f potvrdio svoju invaziju suzbija djelovanje in vitro i in vivo. Osim toga, pokazali smo da MYH9 je izravna meta za neka-7F i to neka-7f posredovane suzbijanje MYH9 ovisi o njegovoj 3'-UTR. Prema tome, ovi rezultati ukazuju na značaj neka-7f kao supresor tumora u invaziju i metastaziranje stanica ciljajući MYH9 u rak želuca. Pregled

Nedavne studije pokazuju da miRNAs mogu djelovati kao aktivatori ili inhibitori metastaziranja tumora [27] , Na primjer, mikrornk-10b [28], Mir-373 i Mir-520c [29], [30] stimulira migraciju stanica raka i invaziju na rak dojke. Osim toga, Mir-155 mogu promovirati tumorske invazije i metastaziranja karcinoma dojke za snižavanje svoj cilj, RhoA [31] i promicati tumorske invazije i metastaza u gušterači kanala karcinoma od potiskujući ekspresiju TP53INP1 [32]. Mirna-200 obitelji (Mirna-200a, Mirna-200b, Mirna-200c, Mirna-141 i Mirna-429) može spriječiti tumorske invazije i metastaziranja reguliranjem EMT [33]. Mir-126 je nađeno da inhibiraju staničnu adheziju, migraciju i invaziju, dijelom kroz suzbijanje Crk u in vitro modelu na ne-malih stanica pluća [34]. Pokazano je da se miR-29c se znatno smanjuje u visoko invazivnog i metastatskog karcinoma nazofarinksa [35]. Mir-218 inhibira invaziju i metastaziranje raka želuca ciljanjem Robo1 receptora [26]. Iako su mnoge studije su učinili da istraži mehanizam Mirne i metastaziranja tumora, mehanizam nije bio jasan. Ono što je najvažnije, nekoliko studija su učinili na mehanizme regulacije GC metastaziranje mikrornk. Pregled

neka-7f gen nalazi se na 9q22.3, a sudjeluje u raznim fiziološkim i patološkim procesima, uključujući angiogeneze [36], immunocyte diferencijacija [37], replikacije starenje [38], rast uhićenje [39], plućne arterijske hipertenzije i karcinogeneze [23]. Neka-7f je regulirani u nekoliko malignih bolesti. Visoko karakterizira primjer je karcinom bubrežnih stanica, u kojoj je neka-7f downregulation je dovelo do značajnog smanjenja u kalikreina (KLK) izraz [40]. KLKs također može biti usmjeren na neka-7f u raka jajnika [25]. U papilarnog karcinoma štitnjače, smanjuje ekspresiju neka-7f može biti bitan molekularni događaj u RET /PTC maligne transformacije [41]. U slučaju raka dojke primarni, međutim, neka-7f se regulira prema gore u odnosu na normalne susjedna tumorskih tkiva [22]. U našem istraživanju, pokazali smo da je neka-7f također regulirani u višestruki tkiva i GC staničnim linijama s visokim metastatskim potencijalom, a mi dalje istraživali mehanizam kojim neka-7f smanjuje tumorske invazije i metastaza. Pregled

MYH9 je gen za ne-mišićnih miozina teškog lanca IIA (NMHCIIA), čiji mutacije su odgovorni za složene poremećaja nazvanog MYH9 povezanih bolesti, naznačen time kombinacijom različitih fenotipskih značajki [42]. NMMHC-IIA, 1960 aminokiselina polipeptida s prevedene molekulske mase 220 kDa a, je uobičajena, non-sarcomeric miozin izražava u većini stanica i tkiva. Njegove funkcije uključuju uloge u citokineze, staničnu pokretljivost i održavanje oblika stanice [43]. Mnoge studije sugeriraju da MYH9 /NMHC-IIA ima ključnu ulogu u tumorskoj stanici invazivni behavior.For primjer, EGF-ovisnu fosforilaciju miozina-IIA teškog lanca ima izravnu ulogu u posredovanju pokretljivost i kemotaksiju na MDA-MB-231 čovjek stanice raka dojke [44]. Miozin IIA Čini se da je jedan od glavnih staničnih meta mts1 [45], mali protein veže kalcij metastasin-1, te ko-localizes s mts1 na vodećem rubu migraciju stanica raka [46]; mts1 utjecaji i montaža ponašanje od miozina IIA i njegove fosforilacije [47], [48]. U nedavnom izvješću podrazumijeva MYH9 (NMHC-Ha) kao meta SRF, što doprinosi invaziju i metastaziranje u raka dojke [49]. Naši podaci pokazuju da MYH9 je izravna meta neka-7f, koji inhibira invaziju i metastaziranje vežu 3'UTR MYH9, što je rezultiralo u silazni miozin IIA izražavanja. Pregled

Na kraju, naša studija pokazuje da neka-7f može suzbiti invaziju i metastaziranje raka želuca izravno vežu 3'UTR MYH9, svoj cilj. Iako još uvijek ima mnogo toga naučiti o ulozi neka-7f u želučanom tumorigenezi raka, neka-7f nam pruža novu potencijalnu metu za želučane liječenja raka. Pregled

popratne podatke
Slika S1.
izraz MYH9 u tumorskih uzoraka želučane. (A) Ekspresija MYH9 u primarni karcinom želuca (Ca) i susjedne normalnom tkivu želuca (N) na temelju IHC. (B) Izražavanje MYH9 u primarni karcinom želuca (Ca) i njezina uskladiti limfnih čvorova metastaze tkiva (M) by IHC pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s001 pregled (TIF) pregled Tablica S1. pregled kliničko ima u 8 svježih uzoraka želučane tumora. pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s002 pregled (DOC) pregled

Izvori pregled

Mi smo zahvalni Zheng Chen za izvrsnu vodstvo tijekom pokusa pregled