PLOS ONE: MicroRNA Låt-7F hämmar tumörinvasion och metastas genom att rikta MYH9 i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

MicroRNAs (miRNA) är viktiga regulatorer som spelar nyckelroller i tumörbildning och tumörprogression. En tidigare rapport har visat att låta-7 familjemedlemmar kan fungera som tumörsuppressorer i många cancerformer. Genom miRNA array, fann vi att låta-7F var nedregleras i de mycket metastatisk potential magsäckscancer cellinjer GC9811-P och SGC7901-M, jämfört med deras föräldracellinjer, GC9811 och SGC7901-NM; Men mekanismen var inte klart. I denna studie undersöker vi om låt-7F fungerar som en tumörsuppressor att hämma invasion och metastas i gastric cancer.

Metodik /Principal

Realtids-PCR visade minskade nivåer av låt-7f uttryck i magsäckscancer vävnader och cellinjer som är potentiellt mycket metastaserande. Cellinvasion och migration signifikant nedsatt i GC9811-P och SGC7901-M cellinjer efter transfektion med låt-7f-härmar. Nakna möss med xenograft-modeller av magcancer bekräftade att låta-7F kan hämma magcancer metastaser in vivo efter transfektion av lentivirus pGCsil-GFP- låt 7f. Luciferas reporter analyser visade att låta-7F direkt binder till 3'UTR av MYH9, som kodar för myosin IIA, och realtids-PCR och Western Blotting ytterligare indikerade att låta-7F nedreglerade expression av myosin IIA vid mRNA och proteinnivåer .

slutsatser /Betydelse

Vår studie visade att överuttryck av låt 7f i magcancer kunde hämma invasion och migrering av gastric cancerceller genom direkt inriktning på tumörmetastaser associerade genen MYH9. Dessa data tyder på att låta-7f kan vara en ny terapeutisk kandidat för magcancer, med tanke på dess förmåga att minska cellinvasion och metastas

Citation. Liang S, han L, Zhao X, Miao Y, Gu Y, guo C, et al. (2011) MicroRNA Låt-7F hämmar tumörinvasion och metastas genom att rikta MYH9 i Human magcancer. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10.1371 /journal.pone.0018409

Redaktör: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Mottagna: 27 september, 2010. Accepteras: 7 mars 2011. Publicerad: 18 april 2011

Copyright: © 2011 Liang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (nr 30.801.330, nr 30.871.143, nr 81.030.044)) och National Basic Research Program of China (nr 2010CB529300, nr 2010CB529306). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer (GC) är den vanligaste gastrointestinala malignitet i östra Asien, Östeuropa och delar av Central- och Sydamerika, och är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall [1]. Utbredd metastaser har varit en viktig orsak till den dystra resultat av GC patienter. Metastas är en komplex, flerstegsprocess, varigenom cancerceller migrerar från den primära tumör till en avlägsen plats [2]. Processen startar när primära tumörceller invaderar intilliggande vävnad, följt av celler som kommer in i blodströmmen (intravasering), transloka genom kärlsystemet, som kommer ut från blodkärl (extravasering) in i den omgivande vävnaden parenkym, initiera mikrometastaser och slutligen prolifererande att bilda makroskopiska sekundära tumörer [3]. En av de kritiska regulatorer som är involverad i denna process är en mikroRNA (miRNA) [4].

MicroRNAs (miRNA) är en klass av endogena och små icke-kodande regulatoriska RNA, som reglerar gener i Post- transkriptionsnivå [5]. Mogna miRNA kan transkriberas av RNA-polymeras II och genereras från sekventiell bearbetning av primär miRNA utskrifter av Drosha och Dicer; de sedan fungera som posttranskriptionell regulatorer av genuttryck genom komplementär basparning till budbärar-RNA [6]. Många rapporter visar att miRNAs spelar nyckelroller i olika biologiska processer, inklusive celldifferentiering, proliferation, apoptos, stresstålighet, fettförbränningen, tumörbildning, och tumörmetastas [7], [8], [9].

den låt-7 familj är en konserverad familj av miRNA. Låt-7 ursprungligen observerats i nematoden Caenorhabditis elegans [10], och fjorton medlemmar har hittat hittills [11]. Nyligen var de expressionsnivåer av många låt-7-familjemedlemmar befunnits att reduceras i en mängd olika cancerformer. Till exempel, låt-7 nedregleras i lungcancer, melanom, och huvud och hals skivepitelcancer cancer, medan överuttryck av låt-7 kan hämma tillväxten av cancerceller [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Flera onkogener, såsom RAS, MYC, och HMGA2, är direkta mål för låt-7 [19], [20], [21]. Låt-7f är en medlem av den låt-7 familj. Tidigare studier har visat att låta-7F är uppreglerat i primär bröstcancer och främjar angiogenes [22]; nedreglering i PAH [23] orsakades av kronisk hypoxi eller monocrotaline hos råttor, och nivån minskades i plasma vesiklar av NSCLC patienter [24]. Dessutom kan låta-7F påverkar celltillväxt genom att rikta kallikrein-relaterade peptidaser (KLKs), en familj av serinproteaser som har visat sig vara oreglerad i flera maligniteter, inklusive äggstockscancer [25].

Vårt lab har tidigare identifierat en grupp av differentiellt uttryckta miRNA mellan GC9811 och GC9811-P-celler genom hög profil mikroRNA chip analyser som innehåller låt-7F [26]. Under ytterligare karakterisering av låt-7f i olika cancercellinjer, fann vi att låta-7F fungerar som en metastas suppressor. Den förbättrade uttryck av låt-7F kan undertrycka GC cellinvasion och migration in vitro och in vivo. Genom bioinformatik analys, identifierade vi att MYH9, som kodar för en myosin IIA tung kedja inblandade i främjandet av cancer cellmigration eller invasion, som en förmodad låt 7f mål. Efterföljande experiment bekräftade att låta-7F kan nedreglera myosin IIA uttryck genom att rikta 3'UTR av MYH9, vilket ger ett möjligt mål för GC behandling.

Material och metoder

Tissue insamling

Primära gastric tumörvävnader, angränsande icke-tumör mag vävnader och avlägsna magsäcks vävnader erhölls från patienter som genomgick kirurgi vid Xijing-sjukhuset av Digestive sjukdomar i Xi'an, Kina. Samtliga prover kliniskt och patologiskt visat sig vara korrekt märkta. Patienter som erbjuder prover för studien undertecknades informerat samtycke former.

Cellodling

De humana magcancer-cellinjer GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M konserverades i vårt eget laboratorium och odlades i RPMI1640 (HyClone), kompletterat med 10% fetalt bovint serum. (FBS; GIBCO), 100 enheter /ml penicillin och 0,1 mg /ml streptomycin vid 37 ° C i en fuktad 5% koldioxidinkubator

RNA-extraktion och realtids-PCR

QRT-PCR utfördes för att bestämma expressionsnivåerna av potentiella låt-7f målgener. Totalt RNA extraherades från vävnader eller odlade celler med användning av TRIZOL-reagens (Invitrogen Life Technologies). Komplementärt DNA (cDNA) genererades genom användning av en TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time PCR analyser utfördes med en TaqMan Micro-RNA Assay kit (Applied Biosystems). Primer av låt-7F köptes från Ambion (MI0000437). Primer av MYH9 sekvens designades med hjälp av Primer Express Software (version 1.5). Primern-MYH9 sekvens: (Forward) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 '(bakåt) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All protokollen utfördes i enlighet med tillverkarens instruktioner. Uttrycksnivån för låt-7f normaliserades till 5S (Forward: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 ';

Omvänd: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3). Uttrycksnivån för MYH9 var normaliserade to18S (Framåt: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ';

Omvänd: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') PCR och datainsamling utfördes på en iCycler (Bio-Rad).. Varje prov kördes i tre exemplar

vektorkonstruktioner och Lentivirus Production

pri-låt-7F sekvensen konstruerades på följande sätt:. (Forward) HSA-låt-7f-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (bakåt) HSA-låt-7f-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Sekvensen amplifierades och klonades i pGCsil-GFP vektor (GENECHEM) för att generera pGCsil-GFP- let-7f. Negativ kontroll var pGC FU-RNAi-NC-LV. Virus förpackning utfördes i HEK 293T-celler efter samtransfektion av 20 mikrogram pGCsil-GFP-låt-7F vektor med 15 ug av packande plasmiden pHelper 1,0 Vector och 10 mikrogram av kuvertet plasmiden pHelper 2,0 Vector med hjälp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virus skördades 48 timmar efter transfektion, och virustitrar bestämdes.

Oligonucleotide konstruktion

låt-7f härmar, låt-7f hämmare och negativ kontroll siRNA oligonukleotider chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co, Ltd). De oligonukleotider som användes i dessa studier var har-låt-7F härmar: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ',

Mimics negativ kontroll: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 "har-låt-7f hämmare: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 '. MircoRNA inhibitor negativ kontroll: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 '

Cell transfektion

Celler odlades till 80% till 90% sammanflytning efter att ha blivit ympades i 6-brunnars plattor och transfekterades med Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA) enligt tillverkarens instruktioner. För transient transfektion ades celler i varje brunn i en 6-brunnars platta transfekterades med 12,5

• PLOS ONE: Onkogen CagA Främjar Gastric cancerrisken via aktivering av ERK signalvägar: en kapslad fall-kontroll Study
• PLOS ONE: Wnt /β-catenin Signa Förbättrar cyklooxygenas-2 (COX-2) transkriptionsaktiviteten i Gastric Cancer Cells