PLoS One: a mikro-RNS-Let 7f gátolja a tumor invázió és metasztázis által célzás MYH9 az emberi gyomorban Cancer

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

A mikroRNS (miRNS) fontos szabályozói, hogy kulcsfontosságú szerepet játszanak a tumorok és tumor progresszióját. Egy korábbi jelentés kimutatta, hogy hagyja-7 családtagok működhet tumorszupresszorokkal számos rák. Keresztül miRNS tömb, azt találtuk, hogy a let-7f ben downregulált a nagyon metasztázisos potenciálját gyomor rákos sejtvonalak GC9811-P és SGC7901-M, összehasonlítva a szülői sejtvonalakat, GC9811 és SGC7901-NM; Azonban a mechanizmus nem volt egyértelmű. Ebben a tanulmányban azt vizsgáljuk, hogy hagyja-7f cselekmények tumorszuppresszorként gátlására invázió és metasztázis gyomorrák. Katalógusa

Módszertan /fő katalógusa

Real-time PCR kimutatta csökkent szintje let-7f expresszió metasztatikus gyomor rákos szövetekben és sejtvonalakban, amelyek potenciálisan nagyon metasztázisos. Sejtek invázióját és a migráció jelentősen károsodott GC9811-P és SGC7901-M sejtvonalak transzfekció után hagyja-7f-utánozza. Nude egerek xenograftmodellekben gyomorrák megerősítette, hogy hagyja-7f gátolhatja gyomorrák metasztázis in vivo transzfekció után a lentivírus pGCsil-GFP- let-7f. A luciferáz riporter méréseink igazolták let-7F közvetlenül kötődik a 3'UTR a MYH9, amely kódolja miozin IIA, és a valós idejű PCR és Western blot jelezte továbbá, hogy hagyja, hogy-a 7f downregulált expressziójának miozin IIA az mRNS és fehérje szinten .

Következtetések /Jelentés katalógusa

a tanulmány kimutatta, hogy túltermelése let-7f gyomorrákban gátolhatják invázió és a migráció a gyomorrák sejtek révén közvetlenül megcélzó tumor metasztázis-asszociált gén MYH9. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a let-7f lehet egy új terápiás jelölt gyomorrák, mivel a képessége, hogy csökkentik a sejt invázió és metasztázis.

bevezető hivatkozás: Liang S, Ő L, Zhao X., Miao Y, Gu Y, Guo C, et al. (2011) a mikro-RNS-Let 7f gátolja a tumor invázió és metasztázis által célzás MYH9 Humán gyomorrákban. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10,1371 /journal.pone.0018409 katalógusa

Vágó: Donald Gullberg, University of Bergen, Norvégia katalógusa

Beérkezett: szeptember 27, 2010; Elfogadva: március 7, 2011; Megjelent: április 18, 2011 katalógusa

Copyright: © 2011 Liang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 30801330, 30871143 számú, No. 81030044)) és a Nemzeti Alap Research Program Kína (No. 2010CB529300, No. 2010CB529306). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) a leggyakoribb emésztőrendszeri rosszindulatú Kelet-Ázsiában, Kelet-Európában, és részei Közép-és Dél-Amerikában, és a második vezető oka a rák összefüggő halálesetek [1]. Elterjedt áttét volt a fő oka a lehangoló eredményét GC betegeknél. Metastasis egy komplex, többlépéses folyamat, amelynek során a rákos sejtek vándorolnak az elsődleges daganat, hogy egy távoli helyen [2]. A folyamat akkor kezdődik, amikor a primer tumor sejteket támadják szomszédos szövet, majd a sejteket belép a véráramba (intravasation), transzlokációs keresztül az érrendszer, kilépő vérerek (extravazáció) a környező szövetekbe parenchyma, kezdeményezése mikrometasztázisok és végül proliferáló alkotnak makroszkopikus másodlagos daganatok [3]. Az egyik kritikus szabályozók, hogy részt ebben a folyamatban a mikroRNS (miRNS) [4]. Katalógusa

A mikroRNS (miRNS) egy osztály az endogén és a kis, nem kódoló RNS-ek szabályozó, amely szabályozza a gének a poszt- transzkripciós szinten [5]. Érett miRNS lehet az RNS-polimeráz-II és generálja a szekvenciális feldolgozást a primer miRNS transzkriptumok által Drosha és kockajátékos; aztán szolgálnak poszttranszkripciós szabályozók génexpresszió révén kiegészítő bázis párosítás messenger RNS [6]. Sok jelentések azt mutatják, hogy a miRNS-ek kulcsszerepet játszanak a különféle biológiai folyamatokban, beleértve a sejtek differenciálódását, proliferáció, apoptózis, a stressz ellenállás, a zsíranyagcserét, tumorigenezis és metasztázis [7], [8], [9]. Katalógusa

a let-7 család egy konzervált család miRNS. Let-7 eredetileg megfigyelhető a fonalféreg Caenorhabditis elegans [10], és a tizennégy tagok úgy találták, hogy dátum [11]. Nemrégiben, a kifejezés szintje sok let-7-család tagjai voltak csökkenteni kell a különböző rákos megbetegedések. Így például legyen-7 downregulált a tüdőrák, melanoma, és a fej és a nyak pikkelyes karcinóma, míg overexpressziója let-7 képes gátolni a rákos sejtek növekedését, [12] [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Számos onkogének, például ras, myc és HMGA2, közvetlen célpontjai let-7 [19], [20], [21]. Let-7f egyik tagja let-7 család. Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a let-7f up-szabályozott primer emlőrák és elősegíti az angiogenezist [22]; downregulációját PAH [23] okozta krónikus hypoxia vagy monokrotalin patkányokban, és a szintje csökkent a plazma hólyagocskák NSCLC betegeknél [24]. Ezen túlmenően, let-7f hatással lehet a sejtproliferáció célzásával Kallikrein kapcsolódó peptidázok (KLKs), egy család a szerin-proteázok, amelyek kimutatták, hogy diszreguláit több rosszindulatú folyamatok, beleértve a petefészek-rák [25].

labor korábban azonosítottak egy csoportja eltérő expressziót miRNS között GC9811 és GC9811-P-sejtek révén magas színvonalú mikroRNS chip elemzések, amelyek a let-7f [26]. A további jellemzését Let-7f különböző rákos sejtvonalak, azt találtuk, hogy a let-7f funkcionál metasztázisszuppresszor-. A fokozott expressziójának let-7f elnyomhatja GC sejtek invázióját és a migráció in vitro és in vivo. By bioinformatikai elemzés azt állapította meg, hogy MYH9, amely kódolja a miozin nehéz lánc IIA részt vesz a promóciós rákos sejtek migrációját vagy invázió, egy feltételezett let-7f cél. Későbbi kísérletek igazolták, hogy hagyja-7f lehet lecsökkenteni miozin IIA kifejezés megcélozva 3'UTR a MYH9, amely lehetséges célpontja GC kezelés. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Tissue gyűjtemény katalógusa

Elsődleges gyomor daganatos szövetek szomszédos nem-daganatos gyomor szövetek és távoli metasztatikus gyomor szöveteket szereztünk átesett betegek műtét a Xijing Kórház Digestive Diseases Xi'an, Kína. Minden mintát klinikai és patológiai kimutatták, hogy megfelelően felcímkézve. Betegek kínál mintákat a vizsgálat aláírt tájékozott beleegyezés formája. Katalógusa

Sejtkultúra katalógusa

Az emberi gyomor rákos sejtvonalak GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M-konzervált saját laboratóriumban és tenyésztettünk RPMI1640 (Hyclone), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS; Gibco), 100 egység /ml penicillinnel és 0,1 mg /ml sztreptomicinnel, 37 ° C-on, nedvesített, 5% szén-dioxid inkubátorban.

RNS extrakció és valós idejű PCR-

qRT-PCR-t végeztünk annak megállapítására, az expressziós szintek a potenciális let-7f célgének. Teljes RNS-t extraháltunk a szövetekből, vagy tenyésztett sejtek TRIZOL reagenssel (Invitrogen Life Technologies). Komplementer DNS (cDNS) használatával létrehozott egy TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time PCR analízist egy TaqMan Micro-RNS Assay kit (Applied Biosystems). Primer let-7f vásároltunk a Ambion (MI0000437). Primer a MYH9 szekvencia volt a célja a Primer Express szoftver (1.5 verzió). A primer-MYH9 sorrendben: (Előre) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 "(Fordított) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All protokollok szerint végeztük, a gyártó utasításai szerint. Az expressziós szintje let-7f normalizáltuk 5S (Forward: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 '; katalógusa

Fordított: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3). Az expressziós szintjének MYH9 volt normalizált to18S (Forward: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ';

Fordított: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3'). A PCR és az adatgyűjtés végeztünk egy iCycler (Bio-Rad). Minden mintát három párhuzamosban. Katalógusa

vektor konstrukciókat és Lentivírus Production katalógusa

A pri-let-7f szekvenciát a következő módon: (Előre) HSA-let-7f-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (Reverse) HSA-let-7f-1- BamHI IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. A szekvenciát amplifikáltuk és klónoztuk pGCsil-GFP vektor (GENECHEM) generálására pGCsil-GFP- let-7f. Negatív kontrollként PGC FU-RNSi-NC-LV. Virus csomagolás végeztük HEK 293T-sejtek együttes transzfekciója után 20 ug pGCsil-GFP-let-7f vektor 15 ng a csomagolás plazmid pHelper 1.0 vektor és 10 ng a boríték plazmid pHelper 2.0 Vector Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vírusok gyűjtöttünk 48 órával a transzfekció után, és a vírus titereket. Katalógusa

oligonukleotid építőipari katalógusa

let-7f utánozza, legyen-7f inhibitor és negatív kontroll siRNS oligonukleotid chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., Kft). A használt oligonukleotidok ezen vizsgálatokban már-let-7f utánozza: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 '; katalógusa

utánozza negatív kontroll: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 ", van-let-7f inhibitor: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 ". MircoRNA inhibitor negatív kontroll: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 '.

Cell transzfekció

A sejteket 80% -os és 90% -os összefolyásig, miután oltottuk 6-lyukú lemezekre és transzfektáltunk Lipofectamine 2000 (Invitrogen , Carlsbad, CA) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A tranziens transzfekció, a sejteket minden lyukban egy 6 mérőhelyes lemez transzfektáltunk 12,5 ul miRNS inhibitor vagy 7,5 ul miRNS utánozzák oligonukleotidok. 48 óra múlva a transzfekciós, a sejteket összegyűjtöttük a további kísérletezést. A stabilan transzfektált sejtek, sejteket transzfektáltunk a lentivírus 30% -50% -os összefolyásig. A célsejteket (1 × 10 ^{4), beleértve a GC 9811-P és SGC7901-M sejtek, fertőztünk 1 × 10 6 rekombináns lentivírus-transzdukáló egység jelenlétében 6 ng /ml polibren (GENECHEM) .}

inváziós vizsgálati eljárás

az invazív képességét a sejtek alkalmazásával vizsgáltuk Transwells (8-um pórusméret, Corning Costar Corp.). A Transwells kerültek be a 24 lyukú lemezeken. Először is, a 0,1 ml Matrigel (50 ug /ml, BD Biosciences) adtunk rá a lemez felületén, és 2 órán keresztül inkubáljuk, majd a felülúszót eltávolítjuk. Frissen tripszinezett és mosott sejteket (GC9811, GC9811-P, SGC7901 nm-es, SGC7901-M) szuszpendáltunk RPMI1640, amely 1% magzati szarvasmarha szérumot. Ezután 100 ul sejt-szuszpenziót (1 × 10 ^{5 sejt) adtunk a felső kamrába az egyes betétkés hogy vontuk Matrigel. Ezután 450 ul RPMI1640, amely 10% magzati borjú-szérumot adtunk be az alsó rekeszbe, és a sejteket hagyjuk támadják 24 H-48 órán át 37 ° C-on, 5% CO _{2 párásított inkubátorban. Az inkubálás után a sejteket fixáltuk 95% abszolút alkoholt, és megfestettük kristályibolyával. A sejteket a felső felületén a szűrőt eltávolítjuk a vattacsomót, és a sejteket, hogy betört az alsó felület a szűrő megszámoltuk, és leképezett alatt egy invertált mikroszkóp (Olympus Corp. Tokyo, Japán) a × 200 nagyításnál több mint tíz véletlenszerűen mezők minden egyes lyukba. Mindegyik kísérletet három párhuzamosban végeztük.}}

A sejtmigrációt

Az a képesség, GC9811, GC9811-P, SGC7901 nm-es, és SGC7901-M sejtek vándorlását detektáltuk Transwells [8-um pórus méret, Corning Costar Corp.]. A Transwells kerültek be a 24 lyukú lemezeken. Frissen tripszinezett és mosott sejteket RPMI1640, amely 1% magzati szarvasmarha szérumot. 5 × 10 ^{4 sejt /lyuk helyeztünk a felső kamrában az egyes betétkés (BD Biosciences, NJ), a nem-bevont membránt. 450 ul RPMI1640, amely 10% magzati borjú-szérumot adtunk be az alsó kamrákat. Inkubálás után 24 óra-48 órán át 37 ° C-on, 5% CO _{2 párásított inkubátorban, a sejteket fixáltuk 95% abszolút alkoholt, és megfestettük kristályibolyával. A sejtek a belső kamrában eltávolítottuk egy vattacsomót és a sejteket csatolt az alsó oldalán a membrán megszámoltuk, és leképezett alatt egy invertált mikroszkóp (Olympus Corp. Tokyo, Japán) a × 200 nagyításnál több mint tíz véletlenszerűen mezők egyes lyukakhoz . Mindegyik kísérletet három párhuzamosban végeztük.}}

In Vivo metasztázis assay

Az in vivo metasztázis esszékben a stabil sejtvonalak GC9811-P és SGC7901-M gyűjtöttünk szövettenyésztő lombikokban való transzfekció után a lentivírus pGCsil-GFP- let-7f és vezérlés pGCsil-GFP tripszin alkalmazásával és háromszor mostuk PBS-sel. Ezután 2 × 10 ^{6 sejtet szuszpendáltunk 0,2 ml szérummentes RPMI 1640-nel minden egyes egér (hat minden csoportban, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 hetes kor), és a sejteket injektáltunk a farokvénába. Négy hét után az injekció, az egereket leöltük. Máj szövetet figyeltünk meg a szabad szemmel, és a szám a látható daganatok a májban felületi megszámláljuk. A máj szöveteiben osztottuk soros szakaszok, fixáltuk foszfáttal pufferolt semleges formalin, megfestettük hematoxilin és eozin és szövettani vizsgálatot. Csupasz egereket manipulált és gondozott NIH Animal Care and Use Committee iránymutatások kísérlet Animal Center negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem (Xi'an, Shanxi tartomány, Kína). Katalógusa}

luciferáz riporter vizsgálat

Annak vizsgálatára, hogy MYH9 expressziót szabályozza let-7F, kettős luciferáz riporter vizsgálatot végeztünk. A 3 'UTR MYH9 tartalmazó let-7f kötőhelyet amplifikáltuk PCR-rel. Amplifikálása MYH9 használt, az alábbi primerek: (Forward) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(Reverse) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3'

Negatív kontrollként, a mutált kötőhelye a 3'-UTR szekvencia (a reverz komplementere a kötőhely) amplifikáltuk a primereket: (Forward) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 '(Reverse) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3'. A termékeket regenerált keresztül agarózgél-elektroforézissel, és beklónoztuk a luciferáz riporter PsiCHECK vektorba (Promega, Madison, WI). Az összes konstrukciót szekvenálással ellenőriztünk. Log fázisú GC9811-P sejteket oltottunk 24 lyukú lemezekre és kotranszfektáltuk Let-7f inhibitorok vagy vezérlő, és a luciferáz riporter Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), követve az utasításokat. Az elegyet 48 óra inkubálás szentjánosbogár és Renilla luciferáz aktivitást azzal a kettős luciferáz riporter vizsgálati rendszer (Promega).

Western Blot

A sejteket kétszer mostuk jéghideg PBS-sel és kaparjuk RIPA-pufferben (50 mM Tris-HCl, pH = 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA-t, 1 mM leupeptin, 1 mM fenil-metil-fluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) frissen hozzáadott proteáz inhibitor koktél (Roche) 15 percig jégen, majd centrifugáltuk 13.000 rpm-en 10 percig, majd a felülúszókat összegyűjtöttük. Tíz mikrogramm egyes minták rezolválhatók 6% -os SDS-PAGE és átvittük nitrocellulóz membránra (Bio-Rad, Hercules, CA). A sávokat inkubáltuk 10% zsírmentesített száraz tejet Tris-pufferelt sóoldatban, 0,1% Tween-20, hogy blokkolja a nemspecifikus kötőhelyeket és inkubáljuk egy primer antitest: nyúl poliklonális anti-humán miozin IIA (hígított 1:500; Cell Signaling Technology ) egy éjszakán át 4 ° C-on. Miután felmelegítés és ismételt mosás háromszor, 15 perc mindegyiknek a membránokat inkubáltuk torma-peroxidázzal konjugált anti-nyúl másodlagos ellenanyagot (Santa Cruz Biotechnology), hígított 1:2000 két órán át szobahőmérsékleten keverjük. A sávokat detektálni kemilumineszcenciás rendszert (Amersham Biosciences). Katalógusa

Az immunhisztokémiai katalógusa

Két szövet array vásároltuk SHANXI CHAOYING BIOTECHNOLÓGIAI CO., LTD. Az egyik gyomorrák szövet és kiegyenlített szomszédos normál gyomor szövet volt, a másik a gyomorrák szövet és kiegyenlített nyirokcsomó-metasztázist .Tissue tömböket arra viaszmentesített 60 ° C-on 2 órán át, magas hőmérsékleten antigén visszanyerését 10 perc, rehidratált, inkubáltuk 10% normál kecske szérummal 1 órán át, majd inkubáltuk nyúl poliklonális anti-humán miozin II a (hígított 1:100; Cell Signaling Technology) egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten. A tárgylemezeket PBS-ben mostuk háromszor 5 percig minden egyes. A szöveteket inkubáltuk kecske anti-nyúl szérummal (DAKO) inkubáltuk 1 órán át, öblítjük PBS-sel. A metszeteket detektáltuk DAB és kontrasztfestést hematoxilinnal. A festődés intenzitása pontoztuk egy négy lépéses skála (0, 1+, 2+ vagy 3+), és a pozitív sejtek százalékos aránya a becslések szerint három különböző patológusok (0 = nincs, 1 = < 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = > 70% tumor sejtek). Összesen átlagos pontszámokat ezután négy csoportba sorolhatók: negatív (nincs kimutatható festés során értékelték, mint a nem-specifikus háttér festés gyenge (+), közepes (++) vagy erős (+++), és összehasonlítottuk Mann-Whitney tesztet.

Statisztikai elemzés katalógusa

t-próba (kétfarkú), egyutas ANOVA és Mann-Whitney tesztet alkalmaztunk, hogy elemezze az in vitro és in vivo adatok SPSS 12.0 szoftver (Chicago, IL , USA). P érték < 0,05 definiáltuk statisztikailag szignifikánsnak. * P katalógusa < 0,05; ** P katalógusa < 0,01. katalógusa

Eredmények katalógusa

a szint let-7f kifejezést gyakran csökkent humán GC metasztatikus sejtvonalak és szövetek katalógusa

Megvizsgáltuk a mRNS expressziós let-7f két pár emberi gyomor rákos sejtvonalak, GC9811, GC9811 -P és SGC7901 nm-es, SGC7901-M. Amint az 1A ábrán látható, kifejezése let-7f alacsonyabb volt a GC-sejtek, GC9811-P és SGC7901-M, a magas metasztatikus potenciállal, míg a let-7f több volt, erősen expresszálódik a GC-sejtek, GC9811 és SGC7901-NM, alacsony metasztatikus potenciállal. Hogy még inkább megerősítik a szerepét hagyja-7f gyomorrákban sejtek áttét, összehasonlítottuk az expressziós szintek let-7f friss humán gyomorrák szövetmintából áttétekkel nyolc egyének (táblázat S1), a normál gyomor szövetek (NG), a primer gyomorrák szövetek (GC) és a távoli áttétes gyomorrák szövetekben (MC), illetve real-time PCR. Érdekes módon, nem volt méltó downregulációját let-7f MC és GC képest, hogy hagyja-7f kifejezést NG (1B). Azt tapasztaltuk, hogy sem a veszteség vagy csökkent expressziója let-7f daganatokban és metasztatikus szövetek fokozta áttét gyomorrák szövetekben. Az eredmények minden azt javasolta, hogy a kifejezés a let-7f negatívan korrelált szorosan csökkent GC áttétek és játszhat fontos szerepet a kóros folyamatokat. Mi már így előírt klinikai és celluláris fogalmi bizonyíték egy áttétes kapcsolót rák kialakulásában, amely arra utal, hogy kulcsfontosságú szerepet a kifejezés a let-7f a rák kialakulásához. Katalógusa

Let-7f gátolta invazív és metasztatikus képességeit GC sejtek in vitro katalógusa

mivel a let-7f viselkedik, mint egy agitátor invázióban és áttétes folyamatok, megvizsgáltuk a hatásait csökkent let-7f a kevésbé metasztatikus sejtvonalak és a megnövekedett let-7f több metasztatizáló sejtvonalak. Hogy ezt, rövid interferáló RNS (siRNS) oligonukleotid let-7f épültek és be GC9811 sejtek és SGC7901 -NM sejtek metasztázis vizsgálatok in vitro, mint GC9811-let-7f-siRNS sejtek SGC7901-NM-let-7f -siRNA sejtek és kontroll sejtek. Egyidejűleg utánzó-let-7f és negatív kontroll oligonukleotidokat is kialakítani és be GC9811-P-sejtek és SGC7901-M sejtek metasztázis esszék, in vitro, mint GC9811-P-let-7f-utánzó sejtek SGC7901-N-megengedte -7f-utánzó sejtek és kontroll sejtek. Kiürülése let-7F szignifikánsan károsodott a képességét GC9811 sejtek vándorlását és megszállják keresztül a matrigel bevont membránok vagy a nem matrigel bevont membránok felé szérumot tartalmazó közegben egy módosított Boyden-kamra vizsgálat (2A ábra). Fokozott expressziója let-7F jelentősen elnyomja a képessége GC9811-P sejtek vándorlását és behatolnak Matrigel bevont membránok vagy nem matrigel bevont membránok felé szérumot tartalmazó közegben egy módosított Boyden-kamra vizsgálat (2b ábra), ha összehasonlítjuk a a kontroll sejtek. Hasonló eredményeket találtak SGC7901-NM-sejtek (3A) és SGC7901-M sejtek (3B), míg a let-7f kiütéssel GC sejtvonalak eredményezett nagyobb inváziós és migrációs ráták. Katalógusa

Let-7f gátolja tumor invázió és metasztázis egy csupasz egér xenograft modellben

GC9811-P vagy SGC7901-M tumorsejtek transzfektált lentivírus pGCsil-GFP- let-7f vagy negatív kontroll pGCsil-GFP injektáltunk csupasz egerekbe, és az egereket öltük után négy héttel oltásokat. Az a metasztázisok száma alapján nodi drámaian csökkent a csupasz egerekben beadni a pGCsil-GFP- let-7f transzfektált sejtek, ha összehasonlítjuk a negatív kontrollok (ábra 4a, 4b). Ezek az adatok meggyőzően bizonyította, hogy hagyja-7f képes gátolni a tumor invázió és metasztázis in vivo. Katalógusa

Let-7f downregulálja miozin IIA kifejezés közvetlenül megcélzó a 3 'UTR katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a mechanizmus amely hagyja-7f visszaszorítja GC invázió és metasztázis, elemeztük a lehetséges későbbi tumor metasztázis kapcsolatos célgének silico. Igyekeztünk az let-7f target gének, különösen azok a gének, amelyek a migráció és /vagy invázió kapcsolatos, és megállapította, hogy a miozin IIA, részt vesz a promóciós rákos sejtek migrációját vagy invázió, lehet a cél gén let-7f. Annak érdekében, hogy meghatározza, hogy a miozin IIA szabályozza let-7f közvetlen kötődését 3 'UTR, konstruáltunk teljes hosszúságú vad típusú és mutáns fragmensek MYH9 mRNS 3' UTR, és beillesztettük őket a régió közvetlenül downstream egy luciferáz riporter gént (5A ábra). Ezt követően, let-7f utánzó oligonukleotidok ko-transzfektáltunk különböző luciferáz 3 'UTR-konstrukciók GC9811-P sejtekben. Azt találtuk, hogy a let-7f csökkentette a relatív luciferáz aktivitást a vad-típusú 3 'UTR az MYH9 (5B, ábra). Azonban, a luciferáz aktivitás nem csökken erőteljesen az UTRs mutáns kötőhelyeket, ha összehasonlítjuk a MUT-típusú társaik (5C). Ezek az adatok alátámasztják, hogy MYH9 közvetlen cél let-7f. Katalógusa

RT-PCR azt mutatta, hogy a kifejezés a MYH9 a GC9811 sejtek és SGC7901-NM transzfektált sejtek let-7f-utánozza a downregulált azokhoz képest transzfektált sejtek kontroll konstrukciók (5D ábra). Western blot eredmények azt mutatták, kifejezése miozin IIA GC9811 és SGC7901-NM transzfektált sejtek let-7f-utánozza a leszabályozott összehasonlítva a transzfektált negatív kontroll (5E ábra). Furthmore, Real-time PCR azt mutatja, hogy az mRNS relatív expresszióját MYH9 GC szövetek és távoli áttétes szövet vannak alulszabályozott összehasonlítva a normális szomszédos, nem rákos minták (6a ábra). Immunhisztokémia azt mutatta, hogy a kifejezés a miozin IIA GC nyirokcsomó-metasztázis up-szabályozott összehasonlítva az elsődleges GC szövet (2. táblázat; ábra a 6C, ábrán S1B), és ez akár szabályozott GC szövetben képest ahhoz illeszkedő szomszédos normál gyomor szövet (1. táblázat; 6B, ábra S1A) .Ezek az adatok azt mutatják, hogy hagyja-7f is alul szabályozzák a mRNS expressziója MYH9 és elnyomják fehérjeszintézist is. katalógusa

Vita katalógusa

a jelen tanulmányban kimutattuk, hogy hagyja-7f kifejezés áttétes GC sejtvonalak downregulált képest, hogy hagyja-7f kifejezést nem áttétes GC sejteket. Ektópiás expressziója és siRNS kiütése let-7f megerősítette invázió-szuppresszáló aktivitása in vitro és in vivo. Sőt, azt mutatják, hogy MYH9 közvetlen célpontja Let-7f, és ez a let-7f közvetített elnyomása MYH9 függ a 3'-UTR. Ezért ezek az eredmények kiemelik a jelentőségét let-7f, mint egy tumor szupresszor sejt invázió és metasztázis célzásával MYH9 gyomorrákban.

A legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy miRNS hathatnak aktivátorok vagy inhibitorok tumor metasztázis [27] . Például mikroRNS-10b [28], miR-373 és miR-520C [29], [30] ösztönözte a rákos sejtek migrációját és invázióját emlőrákban. Továbbá, a miR-155 elősegítheti a tumor invázió és metasztázis emlőrák által mTOR gátlása miatt csökken a célértéket, RhoA [31] és elősegítik a tumor invázió és metasztázis hasnyálmirigy vezeték karcinóma által represszáló expressziójának TP53INP1 [32]. A miRNS-200 család (miRNS-200a, miRNS-200b miRNS-200c, miRNS-141 és miRNS-429) is gátolja a tumor invázió és metasztázis szabályozásával EMT [33]. MiR-126 találtuk, hogy gátolják a sejtadhéziót, migrációs és behatolás részben keresztül elnyomása CRK egy in vitro modellben a nem kissejtes tüdő-karcinóma [34]. Kimutatták, hogy a miR-29c jelentősen csökken az erősen invazív és metasztázisos orrgarat-karcinóma [35]. MiR-218 gátolja az invázió és metasztázis gyomorrák megcélozva Robo1 receptor [26]. Bár sok vizsgálatot végeztek, hogy vizsgálja meg a mechanizmus a miRNS és a tumor metasztázis, a mechanizmus nem volt egyértelmű. A legfontosabb, hogy kevés vizsgálatot végeztek a mechanizmusokat GC metasztázis szabályozás mikroRNS. Katalógusa

A let-7f gén található 9q22.3, és részt vesz a különböző élettani és kórélettani folyamatok, például angiogenezis [36], immunocita differenciálás [37], replikatív öregedés [38], le a növekedést [39], pulmonális artériás hipertónia és karcinogenitás [23]. Let-7F downregulált több rosszindulatú. Egy jól jellemzett példa az vesesejtes karcinóma, amelyben let-7f downregulation vezetett jelentős csökkenése kallikrein (KLK) expressziós [40]. KLKs is megcélozható let-7f petefészekrák [25]. Papilláris pajzsmirigy rák, csökkentett expresszióját let-7f lehet egy alapvető molekuláris esemény RET /PTC malignus transzformáció [41]. Abban az esetben, primer emlőrákban azonban let-7f t serkentett, ha összehasonlítjuk a normál szomszédos tumor szövetekben [22]. Tanulmányunkban bemutattuk, hogy hagyja-7f is downregulált MC szövetek és GC sejtvonalak nagy metasztatikus potenciállal, és tovább fejleszthetők a mechanizmus, amellyel a let-7f csökkentette a tumor invázió és metasztázis. Katalógusa

MYH9 van a gént nem-izom miozin nehéz lánc IIA (NMHCIIA), amelynek mutációi felelősek egy komplex betegség nevű MYH9 kapcsolatos betegség, jellemző a kombinációja különböző fenotípusos jellemzői [42]. NMMHC-IIA, egy 1960-as aminosav polipeptid, a lefordított molekulatömege 220 kDa, ha egy hagyományos, nem-szarkomer miozin kifejezve legtöbb sejteket és szöveteket. Feladatai közé tartozik szerepeket citokinezist, sejtmotilitással és karbantartása sejtalak [43]. Számos tanulmány azt sugallják, hogy MYH9 /NMHC-IIA kulcsszerepe van a tumor-sejt invazív behavior.For például az EGF-függő foszforilezését a miozin-IIA nehéz lánc közvetlen szerepet közvetítésében motilitás és a kemotaxist MDA-MB-231 humán emlőrák-sejtek [44]. A miozin IIA tűnik, hogy egy jelentős celluláris célpontja mts1 [45], a kis kalcium-kötő fehérje metastasin-1, és a társ-lokalizálja a mts1 az élvonalban a vándorló rákos sejtek [46]; mts1 erős hatást gyakorol a szerelvény viselkedését miozin IIA és foszforilációja [47], [48]. Egy friss jelentés érinti MYH9 (NMHC-IIA), mint a cél az SRF, amely hozzájárul az invázió és metasztázis emlőrákban [49]. Adataink azt mutatják, hogy MYH9 a közvetlen cél a let-7F, amely gátolta invázió és metasztázis kötődve 3'UTR a MYH9, ami a downregulációját miozin IIA kifejezés. Katalógusa

Összefoglalva, vizsgálat azt mutatja, hogy hagyja-7f elnyomhatja az invázió és metasztázis gyomorrák által közvetlenül kötelező 3'UTR az MYH9, a cél. Bár még mindig sok, hogy megismerjék a szerepe legyen-7f gyomorrákban tumorogenezisben, hagyja-7f biztosít számunkra egy új potenciális célpontja gyomorrák kezelésére. Katalógusa

alátámasztó információk
ábra S1.
kifejezése MYH9 a gyomor tumor mintákban. (A) kifejezése MYH9 elsődleges gyomorrák (Ca) és a szomszédos normál szövetben gyomor (N) IHC. (B) kifejezése MYH9 elsődleges gyomorrák (Ca) és ahhoz illeszkedő nyirokcsomómetastasis szövet (M) IHC. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0018409.s001 katalógusa (TIF) hotelben táblázat S1.
klinikai és funkciók 8 friss gyomor tumor mintákban.
doi: 10,1371 /journal.pone.0018409.s002 katalógusa (DOC) hotelben

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Nagyon hálásak vagyunk Zheng Chen kiváló útmutatást a kísérlet során. katalógusa

• PLoS One: onkogén CagA Elősegíti Gyomor rák kockázatát keresztül aktiválása ERK jelátviteli: A eset-kontroll tanulmány
• PLoS One: Wnt /β-Catenin Jelzés Javítja a ciklooxigenáz-2 (COX2) transzkripciós aktivitást gyomorrákban Cells