Фон
<р> MicroRNAs (микроРНК) являются важными регуляторами, которые играют ключевую роль в онкогенеза и опухолевой прогрессии. В предыдущем докладе показал, что элементы позволяют 7-семьи могут выступать в качестве супрессоров опухолей во многих видов рака. Через микроРНК массив, мы обнаружили, что пусть-7F была подавлена в высоко метастатических потенциальных линий клеток рака желудка GC9811-P и SGC7901-М, по сравнению с их родительских клеточных линий, GC9811 и SGC7901-НМ; Однако, механизм не был ясен. В данном исследовании мы исследуем ли давайте-7F действует как подавитель опухоли ингибировать инвазию и метастазирование в желудочном рака.
Выводы /Значение
<р> Наше исследование показало, что избыточная экспрессия LET-7F при раке желудка может ингибировать инвазию и миграцию клеток рака желудка путем непосредственно ориентированных на метастазирование опухолей-ассоциированных генов MYH9. Эти данные свидетельствуют о том, что давайте-7f может быть новым терапевтическим кандидатом для рака желудка, учитывая его способность уменьшать инвазию клеток и метастазирование
<р> Образец цитирования:. Лян S, L Он, Чжао X, мяо Y, Y Гу, Го С. и др. (2011) микроРНК Let-7f Угнетает Опухоль инвазии и метастазированию Нацеливаясь MYH9 в человека рака желудка. PLoS ONE 6 (4): e18409. DOI: 10.1371 /journal.pone.0018409
<р> Редактор: Дональд Галлберг, Университет Бергена, Норвегия
<р> Поступило: 27 сентября 2010 года; Принято: 7 марта 2011 года; Опубликовано: 18 апреля, 2011
<р> Copyright: © 2011 Liang и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
Финансирование:. Это исследование Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 30801330, № 30871143, № 81030044)) и Национальной программы фундаментальных исследований Китая (№ 2010CB529300, No. 2010CB529306). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка (GC) является наиболее распространенным желудочно-злокачественности в Восточной Азии, Восточной Европе, и в некоторых районах Центральной и Южной Америке, и является второй ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний [1]. Широкое распространение метастаз является одной из основных причин печального исхода больных GC. Метастазы представляет собой сложный, многоступенчатый процесс, при котором раковые клетки мигрируют из первичной опухоли в удаленном месте [2]. Процесс начинается, когда первичные опухолевые клетки проникают прилегающую ткань, а затем клетки, входящих в поток крови (intravasation), транслокации через сосудистую сеть, выходящая из кровеносных сосудов (кровоизлияние) в окружающие паренхиматозной ткани, инициирующий микрометастазов и, наконец, пролиферирующих с образованием макроскопического вторичный опухоли [3]. Одним из важнейших регуляторов, которые вовлечены в этот процесс является микроРНК (миРНК) [4].
MicroRNAs (миРНК) представляют собой класс эндогенных и малых некодирующих регуляторных РНК, которые регулируют гены в пост- транскрипционном уровне [5]. Зрелые микроРНК могут быть расшифрованы с помощью РНК-полимеразы II и генерируются из последовательной обработки первичных транскриптов микроРНК по Drosha и Dicer; затем они служат в качестве посттранскрипционные регуляторов экспрессии генов посредством дополнительного спаривания оснований к мессенджеров РНК [6]. Многие отчеты показывают, что микроРНК играют ключевую роль в различных биологических процессах, в том числе клеточной дифференцировки, пролиферации, апоптоза, стрессоустойчивости, жировой обмен, онкогенеза и метастазирования опухоли [7], [8], [9].
<Р> Выпускаемое-7 семья законсервированным семейство микроРНК. Пусть-7 первоначально наблюдалась в Элеганс нематоды Caenorhabditis [10], а также четырнадцать членов были найдены до настоящего времени [11]. В последнее время было обнаружено, уменьшить в различных форм рака уровни экспрессии многих членов давайте-7-семьи. Например, пусть-7 подавляются при раке легкого, меланома, головы и шеи плоскоклеточный рак, в то время как избыточная экспрессия пусть-7 может ингибировать рост раковых клеток [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Несколько онкогены, такие как РАН, MYC и HMGA2, являются прямыми объектами пусть-7 [19], [20], [21]. Пусть-7F является одним из членов семьи LET-7. Предыдущие исследования показали, что пусть-7F является повышающей регуляции в первичного рака молочной железы и стимулирует ангиогенез [22]; деактивация в PAH [23] была вызвана хронической гипоксии или monocrotaline у крыс, а уровень был снижен в плазме везикул с немелкоклеточным раком легких пациентов [24]. Кроме того, пусть-7F может повлиять на клеточную пролиферацию путем пристреливать Калликреин связанных с пептидазы (KLKs), семейство сериновых протеаз, которые были показаны, чтобы быть дизрегуляции в нескольких злокачественных опухолей, включая рак яичников [25].
<Р> Наши лаборатории ранее идентифицировали группу дифференциально выраженных микроРНК между GC9811 и GC9811-P клеток через громкому чип микроРНК анализа, которые содержат пусть-7е [26]. При дальнейшей характеристике LET-7F в различных линиях раковых клеток, мы обнаружили, что пусть-7F функции, как метастаза подавитель. Усиленная экспрессия выпускаемой-7F может подавлять GC вторжение и миграцию клеток в пробирке и в естественных условиях. В результате анализа биоинформатики, мы определили, что MYH9, который кодирует тяжелую цепь миозина IIA, участвующих в развитии миграции раковых клеток или вторжения, как мнимого пусть-7f цели. Последующие эксперименты подтвердили, что пусть-7F может миозина выражение подавляют IIA путем пристреливать 3'UTR из MYH9, которая обеспечивает возможную мишень для лечения GC.
Коллекция тканей
<р> Первичные желудочные ткани опухоли, примыкающие неопухолевой желудка тканей и отдаленных метастазов желудка ткани были получены от пациентов, перенесших операцию на Xijing больнице болезней пищеварительного тракта в г. Сиань, Китай. Все образцы были клинически и патологически показано, что правильно маркированы. Пациенты предлагают образцы для исследования подписали формы информированного согласия.
Выделение РНК и ПЦР в реальном времени
<р> QRT-ПЦР проводили, чтобы определить уровни экспрессии потенциальных давайте-7F генов-мишеней. Суммарную РНК экстрагировали из тканей или культивированных клеток с использованием реагента TRIzol (Invitrogen Life Technologies). Комплементарной ДНК (кДНК) получали с использованием набора TaqMan с обратной транскрипцией (Applied Biosystems). ПЦР в реальном времени анализ проводили с помощью набора TaqMan Micro-РНК анализа (Applied Biosystems). Грунтовка выпускаемой-7F был приобретен у Ambion (MI0000437). Грунтовка MYH9 последовательности была разработана с использованием программного обеспечения Primer Express, (версия 1.5). Грунтовка-MYH9 последовательность: (Вперед) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 'протоколы (Reverse) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All были проведены в соответствии с инструкциями изготовителя. Уровень экспрессии LET-7F нормализовалось к 5S (вперед: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 ';
<р> Реверс: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3'). Уровень экспрессии MYH9 нормализовалось to18S (Вперед: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ';
<р> Реверс: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') ПЦР и сбора данных были выполнены на прибора Icycler (Bio-Rad).. Каждый образец был запущен в трех экземплярах
Vector конструкты и Лентивирус Продукция
<р> ИРП-пусть-7F последовательность построена следующим образом:. (Forward) HSA-пусть-7F-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (Reverse) HSA-пусть-7f-1- BamH ИК CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Последовательность амплифицировали и клонировали в pGCsil-GFP вектор (GENECHEM) для генерации pGCsil-GFP- пусть-7F. Отрицательный контроль был PGC FU-RNAi-NC-LV. Вирус упаковка была выполнена в НЕК 293Т после котрансфекции 20 мкг pGCsil-GFP-пусть-7f вектора с 15 мкг плазмидной упаковки pHelper 1,0 Вектор и 10 мкг огибающей плазмиды pHelper 2,0 Вектор с использованием Липофектамин 2000 (Invitrogen). Вирусы собирали через 48 ч после трансфекции, и определяли титры вируса.
трансфекции клеток Invasion анализ Для исследования была ли экспрессия MYH9 регулируется LET-7F, двойной-люциферазы анализа репортера проводили. 3 'UTR из MYH9, содержащего сайт LET-7F связывания амплифицируют с помощью ПЦР. Усиление MYH9 использовали следующие праймеры: (Forward) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(обратный) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3' Статистический анализ Результаты уровень пусть-7f выражение часто уменьшается в человеческой GC линии метастатического клеток и тканей Для дальнейшего изучения механизма, с помощью которые позволяют-7F угнетает GC инвазии и метастазированию, мы проанализировали возможные метастазы связанных генов-мишеней вниз по течению опухоли в силикомарганца. Мы сосредоточились на выпускаемую-7F генов-мишеней, особенно те гены, которые были миграции и /или инвазии, связанные, и обнаружили, что миозин IIA, участвует в развитии миграции раковых клеток или вторжения, может быть ген-мишень выпускаемой-7F. В попытке определить, является ли миозин IIA регулируется LET-7F путем прямого связывания с его 3'-UTR, мы сконструировали полной длины дикого типа и мутантных фрагменты MYH9 мРНК 3'-UTR, и вставить их в область, расположенную непосредственно под ген люциферазы (фиг.5А). Впоследствии, пусть-7F мимические олигонуклеотиды котрансфицируют с различными люциферазы 3 'UTR конструкций в GC9811-P клеток. Мы обнаружили, что пусть-7F снижало относительную активность люциферазы в дикого типа 3 'UTR из MYH9 (Фиг.5В). Тем не менее, активность люциферазы резко сделал не падение в UTRs с мутантных сайтов связывания, по сравнению с аналогами MUT-типа (рис 5в). Эти данные подтверждают, что MYH9 является прямой мишенью пусть-7F. Обсуждение Выражение признательности
<р> Клетки культивировали до 80% до 90% слияния после того, высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали с Липофектамином 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для временной трансфекции клетки в каждую лунку 6-луночного планшета, трансфицируют с ингибитором микроРНК 12,5 мкл или 7,5 мкл микроРНК мимических олигонуклеотиды. После 48 ч трансфекции клетки собирали для дальнейших экспериментов. Для получения стабильно трансфицированных клеток, клетки трансфицировали лентивирусов на уровне 30% -50% сплошности. Клетки-мишени (1 × 10 4), в том числе GC 9811-P и SGC7901-M клетки, инфицировали 1 × 10 6 рекомбинантные лентивирусом трансдукции единиц в присутствии 6 мкг /мл полибрена (GENECHEM) .
<р> инвазивная способность клеток анализировали с использованием Transwells (8 мкм размер пор, Corning Costar Corp). В Transwells были введены в 24-луночные планшеты. Во-первых, 0,1 мл Матригель (50 мкг /мл, BD Biosciences) добавляли на поверхность планшета и инкубировали в течение 2 ч, а затем супернатант удаляли. Свеже трипсином и промытые клетки (GC9811, GC9811-р, SGC7901-НМ, SGC7901-М) суспендировали в RPMI 1640, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки. Затем 100 мкл суспензии клеток (1 × 10 5 клеток) добавляли в верхнюю палату каждой вставки, которая была покрытой Матригель. Затем 450 мкл RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки был добавлен в нижний отсек, а клетки ивазированной в течение 24 ч-48 ч при температуре 37 ° С в 5% CO <суб> 2 увлажненном инкубаторе. После инкубации клетки фиксировали 95% абсолютного спирта и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Клетки на верхней поверхности фильтра были удалены с ватным тампоном, и клетки, которые захватившие в нижнюю поверхность фильтра подсчитывали и получено при инвертированный микроскоп (Olympus Corp. Токио, Япония) при увеличении × 200 в течение десяти случайным поля в каждую лунку. Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах.
Миграция клеток
<р> Способность GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM и SGC7901-М клеток мигрировать была обнаружена с помощью Transwells [8 мкм пор размер, Corning Costar Corp]. В Transwells были введены в 24-луночные планшеты. Свеже трипсином и промытые клетки суспендировали в RPMI 1640, содержащей 1% сыворотки плода коровы. 5 × 10 4 клеток /лунку были помещены в верхней камере каждой вставки (BD Biosciences, NJ), с непокрытой мембраной. 450 мкл RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки добавляли в нижнюю часть камеры. После инкубации в течение 24 ч-48 ч при температуре 37 ° С в 5% CO <суб> 2 увлажненном инкубаторе клетки фиксировали 95% абсолютного спирта и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Клетки во внутренней камере были удалены с помощью ватного тампона, и клетки, прикрепленные к нижней стороне мембраны, были подсчитаны и получено при инвертированный микроскоп (Olympus Corp. Токио, Япония) при × 200 с увеличением более десяти случайных полей в каждую лунку , Каждый эксперимент проводили в трех повторностях.
В естественных условиях метастаз анализа
<р> Для анализов метастазирование в естественных условиях, стабильные клеточные линии GC9811-P и SGC7901-M собирали из культуры тканей колбах после трансфекции лентивирусов pGCsil-GFP- пусть-7F и контролировать pGCsil-GFP с помощью трипсина и трижды промывали PBS. Затем 2 × 10 6 клеток суспендировали в 0,2 мл бессывороточной RPMI 1640 для каждой мыши (шесть в каждой группе, Fale BALB /C-Nu /Nu, 6-8 недель возраста), а клетки вводили в хвостовую вену. Через четыре недели после инъекции, мыши были пожертвованы. Ткань печени наблюдали невооруженным глазом, и количество видимых опухолей на поверхности печени подсчитывали. Ткани печени были разделены на серийных срезах, фиксированных с фосфатным буфером нейтральном формалине, окрашенных гематоксилином и эозином и исследовали гистологически. Голые мыши были подтасованы и уход в соответствии с NIH по уходу и использованию животных комитета руководящих принципов в эксперименте Центра животных Четвертого военного медицинского университета (г. Сиань, провинция Шаньси, КНР).
люциферазы Анализ <бр>
<р> В качестве отрицательного контроля, участок последовательности 3'-UTR мутантного связывания (с использованием обратной комплементарной сайта связывания), амплифицировали с использованием праймеров: (вперед) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 '(обратный) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3'. Продукты были утилизирован с помощью электрофореза в агарозном геле, и клонировали в люциферазы PsiCHECK векторе (Promega, Madison, WI). Все конструкции были проверены с помощью секвенирования. Вход фазы GC9811-P клетки высевали в 24-луночные планшеты и котрансфицируют с LET-7F ингибиторы или контроля, а также с использованием люциферазы репортеров Липофектамин ™ 2000 (Invitrogen), следуя инструкциям. После 48 часов инкубации, светлячка и Renilla активность люциферазы измеряли с двойной люциферазы системы репортер анализа (Promega).
вестерн-блот
<р> Клетки дважды промывали охлажденным на льду PBS и соскабливают в РИПА буфер (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1% (об /об) Тритона X-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ лейпептин, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4) со свежеприготовленными добавлен ингибитор протеаз (Roche) в течение 15 мин на льду, а затем центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 10 мин и собирали надосадочную жидкость. Десять микрограммов каждого образца была решена с использованием 6% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA). Полосы инкубировали с 10% обезжиренного сухого молока в Трис-солевом буфере-0,1% твин-20, чтобы блокировать сайты неспецифического связывания и инкубировали с первичным антителом: кроличьи поликлональные антитела против человеческого миозина IIA (разбавленный 1:500; Cell Signaling Technology ) в течение ночи при температуре 4 ° С. После того, как согревание и многократную стирку в три раза, через 15 мин для каждого из них, мембраны инкубировали с хрена, конъюгированным с пероксидазой анти-кроличьего вторичного антитела (Santa Cruz Biotechnology), разбавленный 1:2000 в течение двух часов при комнатной температуре. Полосы были обнаружены с помощью усовершенствованной системы хемилюминесценции (Amersham Biosciences).
Immunohistochemistry
<р> Два массива ткани были приобретены у SHANXI Chaoying БИОТЕХНОЛОГИЯ CO., LTD. Один из них был желудка раковой ткани и соответствие с нормальной тканью желудка, другой желудка раковой ткани и соответствует узел метастазировании в лимфатические .Tissue массивы депарафинизации в 60 ° С в течение 2 ч, при высокой температуре восстановления антигена в течение 10 мин, регидратации, инкубировали в 10% нормальной козьей сывороткой в течение 1 ч, затем инкубировали с кроличьей поликлональной анти-человеческого миозина II A (разбавленный 1:100; Cell Signaling Technology) в течение ночи при температуре 4 ° с. Срезы промывали в PBS три раза в течение 5 минут каждый. Ткани инкубируют в козий анти-сывороткой кролика (DAKO) в течение 1 ч, промывали PBS. Срезы были обнаружены с помощью DAB и контрастному окрашиванию гематоксилином. Интенсивность окрашивания оценивали с использованием четырех шагового шкале (0, 1+, 2+ или 3+) и процент положительных клеток оценивалась тремя различными патологи (0 = нет, 1 = ≪ 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = > 70% опухолевых клеток). Всего средние баллы затем были сгруппированы в четыре категории: не отрицательный (не обнаружено окрашивание при оценке по сравнению с неспецифическим фоне окрашивания, слабый (+), умеренная (++) или сильный (+++) и сравнивали с использованием критерия Манна-Уитни <бр.>
<р> т-критерий Стьюдента (двусторонний), Односторонний ANOVA и тест Манна-Уитни были использованы для анализа в пробирке и в естественных условиях с использованием данных SPSS 12.0 программного обеспечения (Чикаго, Иллинойс , США) величина Р &л;. 0,05 определяли как статистически значимое * P
&л;. 0,05; ** P
&л;. 0.01
<р> Мы исследовали уровни экспрессии мРНК LET-7F в двух парах желудочных линий раковых клеток человека, GC9811, GC9811 -Р и SGC7901-NM, SGC7901-M. Как показано на рисунке 1А, экспрессия LET-7F была ниже в GC клетки, GC9811-P и SGC7901-М, с высоким метастатическим потенциалом, в то время был более высокий уровень экспрессии пусть-7F в GC клетки, GC9811 и SGC7901-NM, с низким метастатическим потенциалом. Для дальнейшей проверки роли LET-7F в желудочном раковых клеток метастазов, мы сравнили уровни экспрессии LET-7F в свежих желудочных образцах ткани рака человека с метастазами из восьми человек (таблица S1), к нормальным желудочных тканей (НГ), первичные желудочные раковые ткани (GC) и отдаленных метастазов желудка тканей рака (MC), соответственно, ПЦР в реальном времени. Интересно, что там был замечательный деактивация выпускаемой-7F в MC и GC, по сравнению с пусть-7F выражение в NG (Рисунок 1В). Мы наблюдали, что либо потерю или уменьшение экспрессии LET-7F в опухолях и их метастатические ткани приводит к повышенной метастаза в раковых тканях желудка. Результаты все предположили, что выражение LET-7F отрицательно очень тесно коррелирует с уменьшением GC метастазов и может играть жизненно важную роль в патологических процессах. Таким образом, мы при условии, клинические и клеточный концептуальное доказательство для метастатической переключателя в развитии рака, что наводит на мысль ключевую роль для выражения LET-7F в развитии рака.
Let-7F тормозил инвазивных и метастатических способности GC клеток в пробирке
<р> Поскольку LET-7F действует как агитатора в инвазии и метастатических процессов, мы исследовали влияние уменьшенного пусть-7F на менее метастатических клеточных линий и увеличение пусть-7F на более-метастатических клеточных линиях. Для достижения этой цели, коротких интерферирующих РНК (миРНК) олигонуклеотиды-7F пусть были построены и введены в клетки GC9811 и клетки SGC7901 -nm для метастазирования анализов в лабораторных условиях, в качестве GC9811-пусть-7F-миРНК клетки, SGC7901-NM-пусть-7F клетки -siRNA и контрольные клетки. Одновременно с этим, имитируют пусть-7F и отрицательные олигонуклеотиды управления также были построены и введены в GC9811-P клеток и SGC7901-М клеток для метастазирования анализов в лабораторных условиях, в качестве GC9811-P-пусть-7F-мимические клетки, SGC7901-N-дал -7f-имитируют клетки и контрольные клетки. Истощение пусть-7Ф значительно снижало способность клеток GC9811 мигрировать и вторгнуться через матригелем мембран или без матригелем мембран по отношению к среде, содержащей сыворотку в модифицированной камере анализа Бойденом (фиг.2А). Повышенная экспрессия LET-7f значительно подавлена способность GC9811-P клеток мигрировать и вторгнуться через матригелем мембран или без матригелем мембран по отношению к среде, содержащей сыворотку в модифицированной камере анализа Бойденом (Фигура 2В), по сравнению с контрольные клетки. Аналогичные результаты были получены в SGC7901-NM клеток (рис 3A) и клеток SGC7901-M (рис 3B), а пусть-7F Нокаут в линиях GC клеток привело к повышению темпов вторжения и миграции.
Let-7F угнетает инвазия опухоли и метастазирование в модели ксенотрансплантата мыши ню
<р> GC9811-P или SGC7901-М опухолевые клетки трансфицировали лентивирусов pGCsil-GFP- пусть-7F или отрицательный контроль pGCsil-GFP вводили голым мышам и мышам были умерщвлены через четыре недели после прививки. Число метастатических Nodi резко сократилось в голых мышей, которым инъецируют pGCsil-GFP- пусть-7F трансфицированных клеток, по сравнению с отрицательным контролем (рис 4A, 4B). Эти данные дают убедительные доказательства того, что LET-7F может ингибировать инвазию опухоли и метастаз в естественных условиях.
Let-7F миозина выражение подавляет IIA путем прямого ориентации его 3 'UTR
<Р> RT-PCR показали, что экспрессия MYH9 в клетках GC9811 и SGC7901-NM клетках, трансфицированных LET-7F-имитаторов подавляется по сравнению с теми клетками, трансфицированных с контрольными конструкциями (рис 5D). Вестерн-блоттинга результаты показали экспрессию миозина IIA в GC9811 и SGC7901-NM клетки, трансфицированные LET-7F-имитаторов вниз регулируемых по сравнению с теми трансфицировали с отрицательным контролем (рис 5E). Furthmore, ПЦР в реальном времени показывает, что относительное выражение мРНК MYH9 в GC тканей и отдаленных метастазов ткани вниз регулируется по сравнению с их нормальными соседними незлокачественных образцов (рис 6А). Иммуногистохимия показали, что экспрессия миозин IIA в GC метастазов в лимфатических узлах является повышающей регуляции по сравнению с его первичной ткани GC (таблица 2, рисунок 6С, рисунок s1b), и она повышающей регуляции в GC ткани по сравнению с его совпавшего с нормальной желудка ткани (таблица 1, рисунок 6В; Рисунок S1A) .Эти данные свидетельствуют о том, что давайте-7F может вниз регулировать экспрессию мРНК MYH9 и может подавлять белок перевод его
<р> В. в настоящем исследовании мы показали, что LET-7F экспрессию в линии метастатического GC клеток была подавлена по сравнению с пусть-7f выражение в неметастатической GC клеток. Эктопическая экспрессия и миРНК нокдаун LET-7F подтвердил свое вторжение, подавляющий активность в пробирке и в естественных условиях. Кроме того, мы покажем, что MYH9 является прямой мишенью для LET-7f и это пусть-7F опосредованной подавление MYH9 зависит от его 3'-UTR. Таким образом, эти результаты подчеркивают важность пусть-7F как подавитель опухоли в инвазии клеток и метастазирование путем ориентации MYH9 при раке желудка.
<Р> Последние исследования показывают, что микроРНК могут выступать в качестве активаторов или ингибиторов метастазирования опухолей [27] , Например, микроРНК-10b [28], микроРНК-373 и микроРНК-520C [29], [30] стимулировали миграцию раковых клеток и инвазию при раке молочной железы. Кроме того, микроРНК-155 может способствовать опухолевой инвазии и метастазирования при раке молочной железы с помощью downregulating своей цели, RhoA [31] и способствовать опухолевой инвазии и метастазирования в поджелудочной железе протоков железы, подавляя экспрессию TP53INP1 [32]. МикроРНК-200 семья (микроРНК-200а, микроРНК-200b, микроРНК-200c, микроРНК-141 и микроРНК-429) может ингибировать инвазию и метастазирование опухоли, регулируя EMT [33]. MIR-126 было обнаружено, ингибирует клеточную адгезию, миграцию и инвазию частично через подавление CRK в модели в пробирке не-мелкоклеточного рака легкого [34]. Было показано, что микроРНК-29c значительно снижается в высоко инвазивной и метастатической карциномы носоглотки [35]. MIR-218 ингибирует инвазию и метастазирование рака желудка путем воздействия на рецептор Robo1 [26]. Хотя многие исследования были проведены, чтобы исследовать механизм микроРНК и метастазирование опухоли, механизм не был ясен. Самое главное, что мало исследований было сделано на механизмах регуляции GC метастазирования по микроРНК.
<Р> Выпускаемое-7F ген расположен в 9q22.3, и участвует в различных физиологических и патологических процессов, в том числе ангиогенеза [36], иммуноцитом дифференциация [37], репликативное старение [38], задержка роста [39], легочная артериальная гипертензия и канцерогенеза [23]. Пусть-7F подавляется в нескольких злокачественных опухолей. Весьма отличающийся тем примером является почечно-клеточная карцинома, в котором пусть-7f понижающей регуляции привело к значительному снижению калликреина (КЛК) выражение [40]. KLKs также может быть мишенью LET-7F при раке яичников [25]. В папиллярного рака щитовидной железы, снижение экспрессии LET-7f может быть существенным молекулярным событием в RET /PTC злокачественной трансформации [41]. В случае первичного рака молочной железы, однако, давайте-7F был повышающей регуляции по сравнению с нормальными прилежащих тканей опухоли [22]. В нашем исследовании мы показали, что пусть-7f также подавляются в тканях МС и клеточных линий ГХ с высоким метастатическим потенциалом, и мы дополнительно изучить механизм, с помощью которого пусть-7F снижается инвазия опухоли и метастазирование.
<Р> MYH9 является ген немышечный тяжелой цепи миозина IIA (NMHCIIA), чьи мутации ответственны за сложное расстройство под названием MYH9-опосредованные заболевания, характеризующегося сочетанием различных фенотипических признаков [42]. NMMHC-IIA, 1960 полипептид аминокислоты, с переведенной молекулярной массой 220 кДа, является обычной, не саркомера миозин выражается в большинстве клеток и тканей. Его функции включают в себя роли в цитокинезе, подвижность клеток и поддержание формы клеток [43]. Многие исследования показывают, что MYH9 /НМУВ-IIA играет ключевую роль в опухолевой клетке инвазивной behavior.For например, EGF-зависимого фосфорилирования тяжелой цепи миозина-IIA играет непосредственную роль в опосредовании моторику и хемотаксис в MDA-MB-231 человека клетки рака молочной железы [44]. Миозин IIA, как представляется, главным сотовой мишенью MTS1 [45], небольшой кальций-связывающий белок metastasin-1, и совместно локализуется с MTS1 на переднем крае мигрирующих раковых клеток [46]; MTS1 влияет как на поведение сборки миозина IIA и его фосфорилирования [47], [48]. В недавнем докладе MYH9 (подразумевает НМУВ-IIA) в качестве мишени ОСР, что способствует инвазии и метастазирования при раке молочной железы [49]. Наши данные показывают, что MYH9 является прямой мишенью LET-7F, который ингибирует инвазию и метастазирование путем связывания 3'UTR из MYH9, что привело к понижающей регуляции экспрессии миозина IIA.
<Р> В заключение, наше исследование показывает, что пусть-7F может подавить инвазии и метастазирования рака желудка путем прямого связывания 3'UTR из MYH9, его цель. Хотя есть еще многое предстоит узнать о роли LET-7F в желудочном онкогенеза рака, давайте-7F дает нам новой потенциальной мишенью для лечения рака желудка.
Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Экспрессию MYH9 в желудочном образцах опухолей. (A) Выражение MYH9 в первичного рака желудка (Са) и прилегающей к ней нормальной ткани желудка (N) с помощью IHC. (B) Выражение MYH9 в первичного рака желудка (Са) и его соответствием метастазов в лимфатических узлах ткани (М) с помощью IHC
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s001
(TIF)
Таблица S1.
Клинико-патологические особенности в 8 свежих образцов желудочного опухолей.
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s002
(DOC)
<р> Мы благодарны Чжэн Чен за прекрасное руководство во время эксперимента
Состав и структура микробиома носоглотки связаны с тяжестью заболевания COVID-19
Изменение микробиома верхних дыхательных путей у детей, связанное с восприимчивостью к SARS-CoV-2
Повышение рисков биозащиты, создаваемых синтетической биологией
DeNovix объявляет победителя конкурса на спектрофотометр / флуорометр Platinum DS11 FX +
Органические яблоки обладают пробиотическими свойствами
Хорошие новости для людей, страдающих СРК, поскольку исследователи определяют «кишечный зуд».
Пробиотики могут иметь терапевтические преимущества для пациентов с биополярным расстройством.
Исследование системы здравоохранения Шеппарда Пратта в Балтиморе показало, что пробиотики могут служить потенциальным терапевтическим подходом к биполярному расстройству и другим психическим заболеван
Исследование показывает противовирусные эффекты куркумина
Куркумин, натуральное соединение, содержащееся в специи куркумы, может помочь устранить определенные вирусы, исследование нашло. Исследование, опубликованное в Журнал общей вирусологии показали, ч
Метабаркодирование ДНК может улучшить анализ рациона человека
Новое исследование показало, что метабаркодирование ДНК служит новым мощным инструментом для мониторинга потребления растений людьми. которые могут помочь исследователям лучше понять, что мы едим и ка