Plos ONE: MicroRNA Naj-7f zavira Tumor Invasion in metastaz z usmerjanjem MYH9 v človeške želodčne raku

Povzetek

Ozadje

MicroRNAs (miRNAs) so pomembni regulatorji, ki igrajo ključno vlogo v tumorigeneze in napredovanje tumorja. Prejšnja poročila so pokazale, da naj-7 družinski člani lahko delujejo kot tumorskih razbijal v mnogih raka. Skozi miRNA polja, smo ugotovili, da naj-7f je navzdol reguliranih v zelo metastatskih potencialnih želodčni rak celičnih linijah GC9811-P in SGC7901-M, v primerjavi z njihovimi starševskih celičnih linij, GC9811 in SGC7901-NM; Vendar mehanizem ni bil jasen. V tej študiji smo raziskali, ali naj-7F deluje kot zaviralnih da zavirajo invazijo in metastaze v želodcu raka.

Metodologija /Glavne

Real-time PCR pokazala znižane ravni pusti-7f izraz v metastatskim želodčne tkiv rakom in celične linije, ki so potencialno zelo metastatskega. Cell invazija in migracije so bile precej oslabljena v GC9811-P in celičnih linij SGC7901-M po transfekciji s pustijo-7f-posnema. Nude miši z ksenotransplantskih modele raka želodca je potrdil, da naj-7f lahko zavira želodčne metastaze raka in vivo po transfekciji ga lentivirusni pGCsil-GFP- pustiti-7f. Luciferazne reporter testi pokazali, da naj-7F neposredno veže na 3'UTR MYH9, ki kodira za miozin IIA, in v realnem času PCR in Western blot nadalje navedla, da naj-7f navzdol reguliranih izražanje miozin IIA na mRNA in koncentracije proteina .

Sklepi /Pomen

Naša raziskava je pokazala, da bi čezmernim pustiti-7f na raka želodca zavira invazijo in migracije želodčnih rakavih celic z neposredno usmerjeni na tumor metastaze, povezano genov MYH9. Ti podatki kažejo, da naj-7f lahko nova terapevtska kandidat za raka želodca, zaradi svoje sposobnosti, da zmanjšuje celic invazijo in metastaze

Navedba. Liang S, je L, Zhao X, Miao Y, Gu Y, Guo C, et al. (2011) MicroRNA Naj-7F zavira tumorska invazija in metastaz z usmerjanjem MYH9 v humani Rak želodca. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10,1371 /journal.pone.0018409

Urednik: Donald Gullberg, University of Bergen, Norveška

Prejeto: 27. september 2010; Sprejeto: 7. marec 2011; Objavljeno: 18. april 2011

Copyright: © 2011 Liang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (št 30801330, št 30871143, št 81030044)) in Nacionalni Temeljni raziskovalni program Kitajske (št 2010CB529300, št 2010CB529306). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je najpogostejši gastrointestinalni maligne bolezni v vzhodni Aziji, vzhodni Evropi in delih srednje in Južne Amerike, in je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka [1]. Razširjena metastaze je bil glavni razlog za žalostna izid bolnikov GC. Metastaze je kompleksna, večstopenjski proces, pri čemer rakave celice migrirajo iz primarnega neoplazme na oddaljeno lokacijo [2]. Proces se začne, ko primarne tumorske celice napadel sosednje tkivo, nato pa celice vstopajo v krvni obtok (intravazacijo), translociranje po žilah, ki izstopa iz krvnih žil (ekstravazacije) v okoliško tkiva parenhima je, sprožitvi micrometastases in končno proliferirajoče da se tvori makroskopski sekundarni tumorji [3]. Ena od ključnih regulatorjev, ki sodelujejo v tem procesu je microRNA (miRNA) [4].

MicroRNAs (miRNAs) so skupina endogenih in malih nekodiranih regulativnih RNA, ki regulirajo gene na kasnješe transkripcije ravni [5]. Mature miRNAs lahko prepisal RNA-polimerazo II in so ustvarjeni z zaporedno obdelavo primarnih miRNA prepisov s Drosha in Kocka; so nato služijo kot posttranscriptional regulatorji izražanja genov z dopolnilno osnovno seznanjanje z messenger RNA [6]. Mnoga poročila kažejo, da miRNAs igrajo ključno vlogo v različnih bioloških procesov, vključno s celično diferenciacijo, proliferacijo, apoptoza, odpornost na stres, presnovo maščob, tumorigeneze in tumorske metastaze [7], [8], [9].

družina naj-7 je ohranjeni družina miRNAs. Naj-7 je bil prvotno opazili v ogorčica Caenorhabditis elegans [10], in štirinajst članov je bilo ugotovljeno, da dan [11]. Pred kratkim je bilo ugotovljeno, ekspresijski nivoji mnogih pustiti-7-družinskim članom treba zmanjšati na različnih rakavih obolenj. Denimo,-7 je navzdol reguliranih v pljučnega raka, melanoma in glave in vratu ploščatoceličnim karcinomom, medtem čezmernim pustiti-7 lahko zavirajo rast rakavih celic [12], [13], [14], [15], [16 ], [17] [18]. Več onkogeni, kot RAS, myc in HMGA2, neposredne tarče naj-7 [19] [20] [21],. Naj-7f je eden od članov družine Ponovitev-7. Predhodne študije so pokazale, da naj-7f pripravljen regulirana v osnovnem raka na dojki in pospešuje angiogenezo [22]; downregulation v PAH [23] je bila posledica kronične hipoksije ali monocrotaline pri podganah, in raven se je zmanjšala v plazmi mehurčkov bolnikov z nedrobnoceličnim rakom pljuč [24]. Poleg tega lahko pustite-7f vpliva na proliferacijo celic z usmerjanjem, povezanih z kallikrein peptidaze (KLKs), družino serinskih proteaz, ki so pokazale, da se dysregulated v različnih malignih bolezni, vključno z rakom jajčnikov [25].

Naša lab so prej opredelila skupino različno izraženih miRNAs med GC9811 in GC9811-P celic skozi odmevnih microRNA čip analiz, ki jih vsebuje naj-7f [26]. Med nadaljnjo karakterizacijo Naj-7f v različnih raka celičnih linijah, smo ugotovili, da naj-7F funkcije kot metastaz supresorski. Okrepljeno izraz oddajal-7f lahko zavre GC celične invazije in migracije in vitro in in vivo. Z analizo bioinformatika, smo ugotovili, da MYH9, ki kodira miozin IIA težko verigo, ki sodeluje pri spodbujanju migracij rakave celice ali invazije, kot domnevni naj-7f cilja. Kasnejši poskusi so potrdili, da naj-7f lahko upocasnjujejo miozin IIA izraz z usmerjanjem 3'UTR MYH9, ki zagotavlja čim cilj za zdravljenje GC.

Materiali in metode

Zbirka Tissue

Primarni želodca tumorske tkiva, ki mejijo non-tumor želodca tkiva in daljni metastatskim želodčnih tkiva so bili pridobljeni pri bolnikih, ki so bili operirani v bolnišnici Xijing za bolezni prebavil v Xi'an, Kitajska. Vsi vzorci so bili klinično in patološko dokazano, da je pravilno označen. Bolniki, ki ponujajo vzorce za študije podpisal premišljene oblike soglasij.

celične kulture

človekovih želodca rakave celične linije GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M so ohranjena v lastnem laboratoriju in smo kultivirali v RPMI1640 (Hyclone), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma. (FBS; GIBCO), 100 enot /ml penicilina in 0,1 mg /ml streptomicina pri 37 ° C v navlaženi 5% inkubatorju ogljikovega dioksida

ekstrakcijo RNA in PCR v realnem času

QRT-PCR smo izvedli za določitev ravni izražanja potencialnih naj-7F ciljnih genov. Total RNA je bila vzeta iz tkiv ali kultiviranih celic z uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen Life Technologies). Komplementarne DNA (cDNA) je bila pripravljena z uporabo TaqMan povratne Transcription Kit (Applied Biosystems). Realnem času analize PCR smo izvedli z TaqMan mikro RNA Vsebnost kit (Applied Biosystems). Primer za oddajal-7f je bila kupljena od Ambion (MI0000437). Primer iz MYH9 zaporedja je bil zasnovan z uporabo Primer Express programske opreme (različica 1.5). Premaz-MYH9 zaporedje: (Forward) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 "(Reverse) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All protokoli so bile izvedene v skladu z navodili proizvajalca. Stopnja izraz oddajal-7f bil normaliziran 5S (Forward: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 "

Povratne: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3"). Stopnja izraz MYH9 je normirane to18S (Forward: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 "

Povratne: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3") PCR in zbiranje podatkov smo izvedli na iCycler (Bio-Rad).. Vsak vzorec je bilo teči v treh izvodih

Vector konstrukti in lentivirusom proizvodnje

pri-kaj-7f zaporedje je bila zgrajena kot sledi:. (Forward) HSA-let-7F-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (Reverse) HSA-let-7F-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Zaporedje smo pomnožili in klonirali v pGCsil-GFP Vector (GENECHEM) za ustvarjanje pGCsil-GFP- pustiti-7f. Negativna kontrola je PGC FU-RNAi-NC-LV. Virus embalaža je bila izvedena v HEK 293T celicah po kotransfekcijo 20 mikrogramov pGCsil-GFP-kaj-7f vektorja s 15 ig embalažno plazmida pHelper 1,0 Vector 10 ig ovojnice plazmida pHelper 2.0 Vector uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virusi smo zbrali 48 ur po transfekciji in so bile določene virusne titre.

oligonukleotid gradnja

dajmo-7f posnema, kaj-7f inhibitor in negativne kontrole siRNA oligonukleotidi so bili chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., Ltd.). Oligonukleotidi, ki se uporabljajo v teh študijah, so se-kaj-7F posnema: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ';

Posnema negativna kontrola: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 ", je-kaj-7F inhibitor: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 ". MircoRNA inhibitor negativno kontrolo: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 "

Cell transfekciji

Celice smo gojili do 80% do 90% konfluence, potem ko zasejali v 6 vdolbinami in smo transfektirali z Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA), v skladu z navodili proizvajalca. Prehodni transfekciji smo celice v vsako vdolbino 6 vdolbinicami transfektirana z 12,5 ul miRNA zaviralca ali 7,5 p.l miRNA mimičnih oligonukleotidov. Po 48 urah po transfekciji smo zbrali celice za nadaljnje poskuse. Za stabilno transfektiranih celicah smo celice transfektirali z lentivirusom 30% -50% konfluence. Tarčne celice (1 x 10 ^{4), vključno z GC 9811-P in SGC7901 M celic smo okužili z 1 x 10 6 rekombinantni lentivirusom transduciranja enote v prisotnosti 6 ug /ml polybrene (GENECHEM) .}

invazijo vsebnosti

invazivno sposobnost celic smo analizirali z uporabo Transwells (velikost por 8-um, Corning Costar Corp). V Transwells se je začela 24-vdolbinami za. Najprej dodamo 0,1 ml Študiie (50 ug /ml, BD Biosciences) na površino plošče in inkubiramo 2 uri, nato pa smo odstranili supernatant. Sveže tripsinizirali in sprani celice (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) suspendiramo v RPMI1640, ki vsebuje 1% fetalnega govejega seruma. Potem smo 100 xl celične suspenzije (1 x 10 ^{5 celice) dodamo k zgornji komori vsakega vložka, ki je prevlečen s Matrigel. Naslednji je 450 xl RPMI1640, ki vsebuje 10% fetalnega govejega seruma dodamo v spodnjem predelu in celice pustimo, da napadejo 24 h, 48 h pri 37 ° C v 5% CO _{2 vlažnem inkubatorju. Po inkubaciji smo celice določen z 95% absolutni alkohol in obarvamo s kristalno vijolično. Celice na zgornji površini filtra smo odstranili z bombažno krpico in celice, ki je vdrla v spodnjo površino filtra preštejemo in posneta pod obrnjenem mikroskopom (Olympus Corp. Tokyo, Japonska) pri x 200 povečavi več deset naključno polja v vsako jamico. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.}}

Cell migracije

Sposobnost GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM in SGC7901 M celic za selitev je bila odkrita s pomočjo Transwells [8-im por velikost, Corning Costar Corp]. V Transwells se je začela 24-vdolbinami za. Sveže tripsinizirali in izperemo celice smo suspendirali v RPMI1640, ki vsebuje 1% fetalnega govejega seruma. 5 x 10 ^{4 celic /jamico damo v zgornji komori vsakega vložka (BD Biosciences, NJ), z ne-obloženih membrano. 450 xl RPMI1640, ki vsebuje 10% fetalnega govejega seruma smo dodali v spodnje komore. Po inkubaciji 24 ur, 48 ur pri 37 ° C v 5% CO _{2 navlaženem inkubatorju smo celice določen z 95% absolutni alkohol in obarvamo s kristalno vijolično. Celice v notranjo komoro smo odstranili z vato in celice pritrjena na spodnji strani membrane preštejemo in posneta pod obrnjenem mikroskopom (Olympus Corp. Tokyo, Japonska) pri x 200 povečava več kot deset naključnih polj v vsako jamico . Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.}}

vivo metastaz testa

Za in vivo metastazami testih, stabilne celične linije GC9811-P in SGC7901-M so bile pridelane iz tkivne kulture bučk po transfekciji s lentivirusni pGCsil-GFP- pustiti-7f in nadzirati pGCsil-GFP z uporabo tripsina in sprali trikrat s PBS. Nato 2 x 10 ^{6 Celice smo suspendirali v 0,2 ml RPMI1640 brez seruma za vsako miš (šest v vsaki skupini, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 tednov starosti), in celice smo injicirali v rep žil. Po štirih tednih injekciji, smo žrtvovali miši. Jetra tkiva smo opazili s prostim očesom, je prešteti število vidnih tumorjev na površini jeter. Jetra tkiva so bile razdeljene v serijskih oddelkov, določenih s fosfatnim pufrom nevtralnem formalinu, obarvali s hematoksilinom in eozinom in pregledati histološko. Nude miši manipulira in oskrbujejo v skladu s smernicami NIH varstvo živali in uporaba odbora v eksperimentu Center živali četrtega vojaške Medical University (Xi'an, Shanxi Province, PR China).}

luciferaza Reporter Vsebnost

Da bi raziskali, ali je MYH9 izraz ureja pustil-7f, je dual-luciferaza novinar test opravili. 3 "UTR od MYH9 vsebuje oddajal-7f vezavnega mesta smo pomnožili s PCR. Pomnoževanje MYH9 uporabili naslednje primerjev: (Forward) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(Reverse) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3'

Kot negativno kontrolo, mutiranega vezavno mesto zaporedja 3'-UTR (z uporabo povratne dopolnilo veznega) smo pomnožili s pomočjo primerje: (Forward) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 "(Reverse) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3 '. Izdelki so bile predelane z agarozno gelsko elektroforezo, in klonirali v luciferazno reporterski PsiCHECK vektor (Promega, Madison, WI). Vsi konstrukti so bili preverjeni sekvenciranje. Prijava faza GC9811-P celice smo zasejali v 24 vdolbinami in kotransfektiramo z Let-7F zaviralci ali nadzora, in luciferazni novinarji uporabljajo Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), po navodilih. Po 48 urah inkubacije smo firefly in Renilla luciferazno aktivnost merjena s sistemom reporterski analiznega dvojno luciferazno (Promega).

Western Blot

Celice smo dvakrat sprali z ledeno mrzlo PBS in postrgamo v RIPA pufra (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptina, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) s sveže dodamo inhibitor proteaze koktajl (Roche) 15 minut na ledu, nato pa centrifugiramo pri 13000 obratih na minuto za 10 minut in supernatante zberemo. Deset mikrogramov vsakega vzorca je bil rešen s pomočjo 6% SDS-PAGE in prenesli na nitrocelulozno membrano (Bio-Rad, Hercules, CA). Pasovih inkubiramo pri 10% nemastno mleko v prahu v tris-pufrom, 0,1% Tween-20 blokirati nespecifična vezavna mesta in inkubiramo s primarnim protitelesom: zajec poliklonski anti-humana miozin IIA (razredčena 1:500; Cell Technology signalno ) preko noči pri 4 ° C. Po Ponovno segrevanje in ponavljajoče pranje trikrat, 15 min za vsakega izmed smo membrane inkubirali s hrenovo peroksidazo konjugiranih anti-kunčjega sekundarnega protitelesa (Santa Cruz Biotechnology), razredčimo 1:2000 dve uri pri sobni temperaturi. Pasovih so bile ugotovljene z uporabo okrepljenega sistema kemiluminescenco (Amersham bioznanosti).

Imunohistokemija

Dve tkiva nizi so bili iz Shanxi CHAOYING biotehnologije CO kupili., LTD. Ena je bila želodca rak tkiva in se ujema meji normalnega želodcu tkivo, drugi pa je bil želodčni rak tkiva in se ujema bezgavk metastaze .Tissue nizi so bili razvoskani pri 60 ° C 2 h, rekuperacijo visoka temperatura antigena za 10 minut, rehidrirani inkubirali v 10% normalna kozji serum za 1 uro, nato inkubiranih z kunčje poliklonalno anti-humani miozin II A (razredčena 1:100; Cell Technology signalnih) preko noči pri 4 ° C. Drsniki speremo v PBS trikrat po 5 minut. Tkiva inkubiramo v kozji anti-kunčjega seruma (DAKO) 1 uro, speremo s PBS. Oddelki so bili odkriti tudi z DAB in jih nasprotno s hematoksilinom. Intenzivnost obarvanja je dosegel s pomočjo štirih korakih lestvice (0, 1+, 2+ ali 3+) in odstotek pozitivnih celic, je bila ocenjena s tremi različnimi patologov (0 = ni, 1 = < 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = > 70% tumorskih celic). Skupaj povprečni rezultati so bili razdeljeni v štiri kategorije: negativno (ni zaznati obarvanje pri ocenjevanju glede na nespecifične ozadja barvanjem, šibko (+), zmerna (++) ali močna (+++) in v primerjavi z uporabo Mann-Whitney testa

Statistična analiza

t-test (dvo-tailed), so enosmerna ANOVA in preizkus Mann-Whitney zaposleni za analizo in vitro, in vivo podatkov s pomočjo SPSS 12.0 programske opreme (Chicago, IL , ZDA) P vrednost. < 0,05 bil opredeljen kot statistično značilne * P
. < 0,05; ** P
. < 0,01

Rezultati

raven naj-7f izražanja je bila pogosto se je v človeški GC metastatskega celičnih linij in tkiv

smo pregledanih ravni mRNA izraz pustiti-7f v dveh parov človeških želodčnega raka celičnih linij, GC9811, GC9811 P in SGC7901-NM, SGC7901-M. Kot je prikazano na sliki 1A, izražanja pustiti-7f je bila nižja v GC celicah, GC9811-P in SGC7901-M, z visokim metastatskim potencialom, medtem ko je bil naj-7f bolj močno izražen v GC celicah, GC9811 in SGC7901-NM, z nizko metastatskega potenciala. Da bi še dodatno potrditev vloge oddajal-7f v želodcu rakavih celic metastaze, smo primerjali vrednosti izraz oddajal-7f v svežih človekovih želodca vzorcih raka tkiva z metastazami od osmih oseb (tabela S1), v normalnih želodca tkiv (NG), primarno želodčne tkiva raka (GC) in daljni metastatskim želodčnih tkiva raka (MC), oziroma, s PCR v realnem času. Zanimivo je bilo izredno downregulation za oddajal-7f v MC in GC, v primerjavi z naj-7f izraz v NG (slika 1B). Ugotovili smo, da je bodisi izgubo ali zmanjšano ekspresijo pustiti-7f v tumorjih in metastatsko tkiva za posledico povečano metastaz v želodcu tkivih raka. Rezultati vse kažejo, da je bil izraz oddajal-7f tesno negativno povezana z zmanjšanim GC metastazami in lahko igrajo pomembno vlogo pri patoloških procesih. Tako smo zagotovili klinično in celično konceptualno dokazov za metastatskega stikalo v razvoj raka, ki nakazuje ključno vlogo pri izražanju pustil-7f v razvoj raka.

Naj-7f inhibira invazivne in metastaznih sposobnosti GC celic in vitro

Ker dajmo-7f deluje kot agitator v invazijo in metastatskim procesov, smo raziskovali učinke zmanjšane naj-7F na manj metastatskih celičnih linijah in povečala naj-7F na bolj metastatskih celičnih linijah. Da bi to dosegli, kratke interferenčne RNA (siRNA) oligonukleotidi naj-7f so bile zgrajene in vnesene GC9811 celice in SGC7901 -NM celic za metastazami testih in vitro, kot GC9811-let-7F-siRNA celice, SGC7901-NM-let-7f -siRNA celice in kontrolne celice. Hkrati posnemajo-naj-7F in negativne kontrole oligonukleotidi so bili izdelani tudi in uvedemo v GC9811-P celic in SGC7901 M celicah metastazami teste in vitro, kot GC9811-P-kaj-7f-posnemajo celice, SGC7901-N-je pustil -7f-posnemajo celice in kontrolnih celicah. Izčrpavanje naj-7F močno oslabljena sposobnost GC9811 celic za selitev in napadejo preko-Matrigel obložene membrane ali ne-Matrigel prevlečenih membran do medija v spremenjeni Boyden komorni testu, ki vsebuje serum (slika 2A). Povečano ekspresijo naj-7F bistveno zatreti sposobnost GC9811-P celic za migracijo in napadejo skozi Matrigel obložene membrane ali brez Matrigel obložene membrane k mediju, ki vsebuje v serumu v spremenjeni Boyden komore testu (slika 2B), v primerjavi s kontrolne celice. Podobni rezultati so bili na voljo v SGC7901-NM celic (slika 3A) in SGC7901 M celic (slika 3B), medtem ko naj-7f knockout v celičnih linijah GC je povečal invazijo in migracij.

Naj-7F inhibira tumorska invazija in metastaze v modelu nude miške ksenotransplantskih

GC9811-P ali SGC7901-M tumorske celice transfektiramo z lentivirusni pGCsil-GFP- kaj-7f ali negativni kontrolni pGCsil-GFP smo injicirali v golih miši in miši so žrtvovali štiri tedne po cepljenjih. Število metastatskega nodi je dramatično zmanjša pri golih miših, injiciranih z pusti-7F transfektiranih celic pGCsil-GFP-, v primerjavi s negativne kontrole (slika 4A, 4B). Ti podatki zagotavljajo trdne dokaze, da je pustil-7f lahko zavirajo tumorsko invazijo in metastaze in vivo.

Naj-7f zmanjša število miozin IIA izraz, ki ga neposredno ciljanje svojo 3 'UTR

Da bi še dodatno raziskati mehanizem ki naj-7f zavira GC invaziji in metastaz, smo analizirali možne smeri toka tumorjev, povezanih z metastazami ciljnih genov v silicij. Osredotočili smo se na naj-7F ciljnih genov, zlasti tiste gene, ki so bile migracije in /ali povezane z invazijo, in ugotovila, da miozin MIS, ki sodelujejo pri spodbujanju migracij rakave celice ali invazije, lahko ciljni gen pustiti-7f. V prizadevanju, da bi ugotovili, ali je miozin IIA ureja naj-7F z direktno vezavo na svojem 3 'UTR, smo zgradili celotno dolžino divjim tipom in mutant fragmente MYH9 mRNA 3' UTR, in jih vstavi v regiji, nižje od luciferaza reporterski gen (slika 5A). Kasneje so bili naj-7F shematični oligo co-transfekciji s drugačna luciferazno 3 'UTR gradi v GC9811-P celic. Ugotovili smo, da pusti-7f zmanjšal relativno luciferazno aktivnost divjega tipa 3 'UTR od MYH9 (slika 5B). Vendar luciferazno aktivnost ni strmo spusti v UTRs z mutiranim vezavnih mest v primerjavi s kolegi v mut tipa (slika 5C). Ti podatki potrjujejo, da je MYH9 neposreden cilj pustiti-7F.

RT-PCR je pokazala, da je izražanje MYH9 v GC9811 celic in SGC7901-NM celic, transfektiranih s oddajajo-7F-posnema navzdol reguliranih primerjavi s tistimi celic, transfektiranih s kontrolnimi konstrukti (Slika 5D). Zahodni Rezultati blot pokazala izražanje miozin IIA v GC9811 in SGC7901-NM transfektiranih s pustijo-7f-posnema so navzdol urejena v primerjavi s tistimi transfekciji s negativne kontrole (Slika 5E). Furthmore, Real-time PCR, kaže, da so mRNA relativni izraz MYH9 v GC tkiv in daljni metastatskega tkiva navzdol urejena v primerjavi z njihovimi običajnimi sosednjih non-rakastih vzorcev (slika 6a). Imunohistokemija so pokazali, da je izražanje miozin MIS v GC bezgavkah metastaze navzgor regulirano primerjavi s primarnim GC tkiva (tabela 2; Slika 6C; slika S1B), in je pripravljen, urejena v GC tkivu v primerjavi z ujemajočo sosednjim normalno želodcu tkiva (tabela 1, slika 6B, slika S1A) .Ti podatki kažejo, da naj-7f lahko down-regulacijo mRNA izraz MYH9 in lahko zatiranje beljakovin prevod njej

Pogovor

V. pričujoči študiji smo pokazali, da je pustil-7f izraz v celičnih linijah metastatskega GC je navzdol reguliranih v primerjavi z naj-7F izraz v non-metastatskih GC celic. Ektopična izražanja in siRNA rasklapanje za oddajal-7f potrdil svojo dejavnost, invazijo zatiranje in vitro in in vivo. Poleg tega smo pokazali, da je MYH9 neposredna tarča pustiti-7f in to pustiti-7f posredovano zavrtje MYH9 je odvisna od njegove 3'-UTR. Zato ti rezultati poudarjajo pomen naj-7f kot supresorski tumorja v celični invaziji in metastaz z osredotočenjem MYH9 raka želodca.

Nedavne študije kažejo, da lahko miRNAs delujejo kot aktivatorji ali inhibitorji tumorske metastaze [27] . Na primer, microRNA-10b [28], miR-373 in miR-520c [29], [30] stimulirano migracijo rakavih celic in vdor pri raku dojk. Poleg tega lahko miR-155 spodbujati tumorsko invazijo in metastaz pri raku dojke, ki ga downregulating svoj cilj, RhoA [31] in spodbujanje tumorja invazijo in metastaze v trebušni slinavki lepilnim raka s zatiranje izražanja TP53INP1 [32]. Mirne-200 družina (miRNA-200a, miRNA-200B, miRNA-200C, miRNA-141 in miRNA-429), lahko zavirajo tumorsko invazijo in metastaz z ureditvijo EMT [33]. MIR-126 je bilo ugotovljeno, da inhibira celično adhezijo, migracije in invazijo delno skozi zatiranje CRK v in vitro modelu ne-malih celic pljučnega raka [34]. Izkazalo se je, da je miR-29c bistveno zmanjša v zelo invazivno in metastatskega nazofaringealnega karcinoma [35]. MIR-218 zavira invazijo in metastaze raka želodca z usmerjanjem Robo1 receptor [26]. Čeprav so bile številne študije opravijo raziskati mehanizem miRNA in tumorja metastaz, mehanizem ni bil jasen. Najpomembneje je, da so bili malo študij poteka na mehanizme regulacije GC metastaziranje ga microRNA.

gen pustiti-7f se nahaja na 9q22.3 in sodeluje v različnih fizioloških in patoloških procesov, vključno z angiogenezo [36], immunocyte diferenciacija [37], replikacije senescenco [38], rast prijetje [39], pljučno arterijsko hipertenzijo in nastanek raka [23]. Naj-7f je navzdol reguliranih v več malignih bolezni. Zelo značilen primer je karcinom ledvičnih celic, pri katerih naj-7F downregulation pripeljalo do znatnega zmanjšanja kalikrein (KLK) izraz [40]. KLKs lahko usmerjena tudi oddajal-7f pri raku jajčnikov [25]. V papilarnega raka ščitnice, zmanjšano izražanje oddajal-7f lahko bistveno molekularni dogodek v RET /PTC maligno transformacijo [41]. V primeru raka dojke primarna pa je pustil-7f molekul v primerjavi z običajnimi sosednjih tumorskih tkiv [22]. V naši raziskavi smo pokazali, da naj-7f je navzdol reguliranih tudi v MC tkiv in celičnih linij GC z visokim metastatskim potencialom, in smo še naprej raziskovali mehanizem, s katerim naj-7f zmanjša tumor invazija in metastaze.

MYH9 je gen za ne-mišični miozin težke verige MIS (NMHCIIA), katerega mutacije so odgovorni za kompleksne motnje imenom povezanih MYH9 bolezen, označena s kombinacijo različnih fenotipskih značilnosti [42]. NMMHC-IIA, 1960 polipeptid aminokislinsko z prevedeni molekulsko maso 220 kDa, je običajna, non-sarcomeric miozin izražena v večini celic in tkiv. Njegove naloge vključujejo vloge v cytokinesis, celično gibljivost in vzdrževanje celične oblike [43]. Številne študije kažejo, da ima MYH9 /NMHC-IIA ključno vlogo v tumorske celice invazivno behavior.For primer ESPG odvisen od fosforilacije miozin-IIA težke verige ima neposredno vlogo pri posredovanju gibljivost in kemotakso v MDA-MB-231 človeka celic raka dojke [44]. Zdi se, da je glavni celični cilj mts1 [45], miozin IIA majhna kalcij veže protein metastasin-1, in co-lokalizira z mts1 na rob migracijo rakastih celic [46]; mts1 vpliva tako vedenje sklop miozin medinstitucionalnega sporazuma in njegovo fosforilacijo [47], [48]. Nedavno poročilo vpleta MYH9 (NMHC-IIA) kot cilj SRF, ki prispeva k invaziji in metastaz pri raku dojke [49]. Naši podatki kažejo, da je MYH9 neposredni cilj pustiti-7f, ki inhibira invazijo in metastaze z vezavo 3'UTR MYH9, kar je povzročilo v downregulation za miozin IIA izražanja.

Skratka, naša raziskava kaže, da naj-7f lahko zavre invazijo in metastaze raka želodca neposredno vezavo 3'UTR MYH9, svoj cilj. Čeprav je še veliko naučiti o vlogi pustil-7f v želodcu tumorigeneze raka, naj-7f nam zagotavlja nove potencialne tarče za zdravljenje raka želodca.

Podpora Informacije
Slika S1.
izražanje MYH9 v želodcu tumorskih vzorcev. (A) Izražanje MYH9 primarnega raka želodca (Ca) in sosednjim normalno želodcu tkiva (N) po IHC. (B) Izražanje MYH9 primarnega raka želodca (Ca) in njegov ujema bezgavko metastaze tkivo (M), ki ga IHC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s001
(IOD)
Tabela S1.
Clinicopathologic ima v 8 svežih želodčnih vzorcev tumorjev.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s002
(DOC)

Priznanja

Hvaležni smo Zheng Chen za odlično vodilo med poskusom

• Plos ONE: onkogeni CagA Spodbuja Rak želodca tveganja z aktiviranjem ERK signalnih poti: ugnezdeni Case-Control Study
• Plos ONE: NT /β-Catenin signalizacijo Izboljša ciklooksigenaze-2 (COX2) transkripcijske aktivnosti želodčnega raka Cells