PLoS ONE: MicroRNA Laat-7F Remt tumorinvasie en metastase door zich te richten MYH9 in Human Gastric Cancer

De abstracte

Achtergrond

MicroRNAs (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren die een belangrijke rol spelen bij het ontstaan ​​van tumoren en tumorprogressie. Een eerdere rapport heeft aangetoond dat let-7 familieleden kunnen als tumor suppressors in vele kankers. Door miRNA array, vonden we dat laat-7f was downgereguleerd in de hoog metastatisch vermogen maagkanker cellijnen GC9811-P en SGC7901-M, in vergelijking met de ouderlijke cellijnen, GC9811 en SGC7901-NM; Het mechanisme is niet duidelijk. In deze studie onderzoeken we of laat-7f fungeert als een tumor suppressor om invasie en metastase remmen in maagkanker.

Methodologie /Opdrachtgever

Real-time PCR toonde verlaagde niveaus van laat-7F expressie in metastatische maagkanker weefsels en cellijnen die potentieel zeer metastatisch. Cel invasie en migratie waren significant verminderde in GC9811-P en SGC7901-M cellijnen na transfectie met laat-7f-bootst. Naakt muizen met xenograft modellen van maagkanker bevestigd dat laat-7F konden maagkanker metastase in vivo na transfectie door de lentivirus pGCsil-GFP laat-7F remmen. Luciferase reporter assays waarmee-7F direct bindt aan het 3'UTR van MYH9, dat codeert voor myosine IIA en real-time PCR en Western blotting verder aangegeven waarmee-7f downgereguleerd de expressie van myosine IIA op mRNA en eiwitniveaus .

Conclusies /Belang

Onze studie toonde aan dat overexpressie van laat-7F bij maagkanker invasie en migratie van maagkanker cellen kunnen remmen door middel van direct gericht zijn op de tumor metastase-geassocieerde gen MYH9. Deze gegevens suggereren dat laat-7f kan een nieuwe therapeutische kandidaat voor maagkanker, gezien het vermogen om cel invasie en metastase verminderen

Citation:. Liang S, L Hij, Zhao X, Y Miao, Gu Y, Guo C, et al. (2011) MicroRNA Laat-7F Remt tumorinvasie en metastase door zich te richten MYH9 in Human maagkanker. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10.1371 /journal.pone.0018409

Uitgever: Donald Gullberg, Universiteit van Bergen, Noorwegen |

Ontvangen: 27 september 2010; Aanvaard: 7 maart 2011; Gepubliceerd: 18 april 2011

Copyright: © 2011 Liang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 30801330, nr 30871143, nr 81030044)) en de Nationale Basic Research Program van China (nr 2010CB529300, No. 2010CB529306). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de meest voorkomende gastro-intestinale maligniteit in Oost-Azië, Oost-Europa, en delen van Midden- en Zuid-Amerika, en is de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen [1]. Wijdverspreide metastase is een belangrijke reden voor de sombere resultaten van GC patiënten. Metastase is een complex meerstaps proces waarbij kankercellen migreren van het primaire neoplasme Afgelegen [2]. Het proces begint wanneer primaire tumorcellen binnendringen aangrenzend weefsel, gevolgd door cellen sluiten van de bloedstroom (intravasation), translocatie door het vaatstelsel, verlaten van bloedvaten (extravasatie) in de omringende weefsel parenchym, initiëren micrometastasen en tenslotte prolifererende macroscopische secundaire vormen tumoren [3]. Een van de belangrijke regulatoren die bij dit proces wordt een microRNA (miRNA) [4].

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van endogene en kleine niet-coderende regulerende RNA's, welke genen reguleren in de post- transcriptie niveau [5]. Volwassen miRNAs kan worden getranscribeerd door RNA-polymerase II en worden gegenereerd uit de sequentiële verwerking van de primaire miRNA transcripten door Drosha en Dicer; ze dienen dan als posttranscriptionele regulatoren van genexpressie via complementaire baseparing aan boodschapper-RNA's [6]. Veel rapporten blijkt dat miRNAs een belangrijke rol spelen in verschillende biologische processen, zoals celdifferentiatie, proliferatie, apoptose, stressbestendigheid, vetmetabolisme, het ontstaan ​​van tumoren en tumormetastase [7], [8], [9].

de laat-7 familie is een geconserveerde familie van miRNAs. Let-7 werd oorspronkelijk waargenomen in de nematode Caenorhabditis elegans [10], en veertien leden bleken date [11]. Onlangs heeft de expressieniveaus van tal let-7-familieleden bleken verlaagd in verschillende kankers. Bijvoorbeeld, laten we-7 is neerwaarts gereguleerd bij longkanker, melanoom, en het hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom, terwijl overexpressie van laat-7 de groei van kankercellen [12], [13], [14], [15], [16 kunnen remmen ], [17], [18]. Verscheidene oncogenen, zoals RAS, MYC en HMGA2, directe doelwitten van let-7 [19], [20], [21]. Laat-7F is een lid van de laat-7 familie. Eerdere studies hebben aangetoond dat laat-7f is opgereguleerd in primaire borsttumoren en angiogenese bevordert [22]; downregulatie bij PAH [23] werd veroorzaakt door chronische hypoxie of monocrotaline bij ratten, en het niveau verlaagd in plasma vesicles van NSCLC patiënten [24]. Daarnaast kunnen laten-7F celproliferatie beïnvloeden door zich te richten kallikreïne-gerelateerde peptidasen (KLKs), een familie van serine proteasen waarvan is aangetoond dat om te worden ontregeld in verschillende tumoren, waaronder eierstokkanker [25].

Onze lab hebben eerder aangegeven een groep van differentieel tot expressie miRNAs tussen de GC9811 en GC9811-P cellen door middel van high-profile microRNA chip analyseert dat bevatten laat-7F [26]. Tijdens de verdere karakterisatie van laat-7f in verschillende kankercellijnen, vonden we waarmee-7f functioneert als een metastase suppressor. De verhoogde expressie van let-7f kan onderdrukken GC invasie en migratie in vitro en in vivo. Door bioinformatica analyse hebben we vastgesteld MYH9, die een IIA myosine zware keten betrokken bij de promotie van kanker celmigratie en invasie codeert, als een vermoedelijk laat-7f doel. Latere experimenten bevestigden dat laat-7F kan myosine IIA uitdrukking downregulate door zich te richten de 3'UTR van MYH9, die een mogelijk doelwit voorziet GC behandeling.

Materialen en methoden

Tissue verzameling

Primary maag tumor weefsel, grenzend non-tumor maag weefsels en verre metastatische maag weefsels werden verkregen van patiënten die een operatie ondergaan aan de Xijing ziekenhuis van maag Lever Darm in Xi'an, China. Alle monsters werden klinisch en pathologisch getoond correct worden geëtiketteerd. Patiënten met monsters voor de studie ondertekend informed consent formulieren.

Cell cultuur

De menselijke maagkanker cellijnen GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M werden geconserveerd in ons eigen laboratorium en werden gekweekt in RPMI1640 (HyClone), aangevuld met 10% foetaal bovine serum. (FBS; GIBCO), 100 eenheden /ml penicilline en 0,1 mg /ml streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde 5% kooldioxide incubator

RNA-extractie en real-time PCR

qRT-PCR werd uitgevoerd om de expressieniveaus van potentiële laat-7f doelgenen bepalen. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit weefsels of gekweekte cellen met behulp van TRIZOL-reagens (Invitrogen Life Technologies). Complementair DNA (cDNA) werd gegenereerd met behulp van TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time PCR analyses werden uitgevoerd met TaqMan Micro-RNA Assay kit (Applied Biosystems). Primer van laat-7F werd gekocht van Ambion (MI0000437). Primer van MYH9 sequentie werd ontworpen met behulp van Primer Express Software (versie 1.5). De primer-MYH9 volgorde: (Forward) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 '(omgekeerde) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All protocollen werden volgens de instructies van de fabrikant uitgevoerd. De expressie niveau van de laat-7F was genormaliseerd tot 5S (Forward: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 ';

Keerzijde: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3'). De expressie niveau van MYH9 werd genormaliseerd to18S (Forward: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ';

Keerzijde: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') PCR en het verzamelen van gegevens werden uitgevoerd op een iCycler (Bio-Rad).. Elk monster werd uitgevoerd in drievoud

Vector bouwt en Lentivirus Productie

De PRI-laat-7F sequentie werd als volgt opgebouwd:. (Forward) HSA-laat-7F-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (Reverse) HSA-laat-7F-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. De sequentie werd versterkt en gekloond in de pGCsil-GFP vector (GENECHEM) voor het genereren van pGCsil-GFP laat-7F. Negatieve controle was pGC FU-RNAi-NC-LV. Virus verpakking werd uitgevoerd in HEK 293T cellen na de cotransfectie van 20 ug pGCsil-GFP-let-7f vector met 15 ug van het inpak plasmide pHelper Vector 1,0 en 10 ug van het plasmide envelop pHelper 2,0 vector met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virussen werden geoogst 48 uur na transfectie en virale titers werden bepaald.

Oligonucleotide bouw

Laat-7F bootst, laat-7F remmer en negatieve controle siRNA oligonucleotiden werden chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co, Ltd). De oligonucleotiden die in deze studies waren heeft-laat-7F bootst: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ';

Mimics negatieve controle: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3', heeft-laat-7F remmer: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 '. MircoRNA remmer negatieve controle: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 '

Celtransfectie

De cellen werden gekweekt tot 80% tot 90% confluentie na te zijn gezaaid in 6-wells platen en werden getransfecteerd met Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA) volgens de instructies van de fabrikant. Voor tijdelijke transfectie, cellen in elk putje van een 6-well plaat werden met 12,5 gl miRNA remmer of 7,5 pl miRNA mimic oligonucleotiden. Na 48 uur transfectie werden de cellen geoogst voor verder experimenteren. Voor stabiel getransfecteerde cellen, werden cellen getransfecteerd met lentivirus bij 30% -50% confluentie. Doelcellen (1 x 10 ^{4), waaronder GC 9811-P en SGC7901-M cellen, werden geïnfecteerd met 1 x 10 6 recombinant lentivirus transducerende eenheden in aanwezigheid van 6 ug /ml polybreen (GENECHEM) .}

Invasion assay

de invasieve vermogen van de cellen werd getest met behulp van Transwells (8-um poriegrootte, Corning Costar Corp). De Transwells werden in de 24 putjes gebracht. Eerst werd 0,1 ml Matrigel (50 ug /ml, BD Biosciences) op het plaatoppervlak toegevoegd en gedurende 2 uur en daarna werd de supernatant verwijderd. Vers getrypsiniseerd en gewassen cellen (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) werden gesuspendeerd in RPMI1640 met 1% foetaal runderserum. Vervolgens 100 pl van de celsuspensie (1 x 10 ^{5 cellen) werd aan de bovenste kamer van elk inzetstuk dat is gecoat met Matrigel toegevoegd. Vervolgens werd 450 ui RPMI 1640 met 10% foetaal runderserum werd toegevoegd aan het onderste compartiment en de cellen liet men vallen gedurende 24 uur-48 uur bij 37 ° C in een 5% CO _{2 bevochtigde incubator. Na incubatie werden de cellen gefixeerd met 95% absolute ethanol en gekleurd met kristalviolet. Cellen op het bovenoppervlak van het filter werden verwijderd met het wattenstaafje en de cellen die naar het bodemoppervlak van het filter was binnengedrongen werden geteld en afgebeeld onder een omgekeerde microscoop (Olympus Corporation Tokyo, Japan) en 200 x vergroting dan tien willekeurige velden in elk putje. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd.}}

Celmigratie

Het vermogen van GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM en SGC7901-M cellen migreren werd gedetecteerd met Transwells [8 urn poriën grootte, Corning Costar Corp]. De Transwells werden in de 24 putjes gebracht. Vers getrypsiniseerd en gewassen cellen werden in RPMI1640 met 1% foetaal runderserum gesuspendeerd. 5 x 10 ^{4 cellen /putje werden in de bovenste kamer van elke insert (BD Biosciences, NJ), met de niet-beklede membraan. 450 pl RPMI 1640 dat 10% foetaal runderserum werd toegevoegd in de onderkamer. Na incubatie gedurende 24 uur-48 uur bij 37 ° C in een 5% CO _{2 bevochtigde incubator, werden de cellen gefixeerd met 95% absolute ethanol en gekleurd met kristalviolet. De cellen in de binnenkamer werden verwijderd met een wattenstaafje en de cellen die aan de onderzijde van het membraan werd geteld en afgebeeld onder een omgekeerde microscoop (Olympus Corporation Tokyo, Japan) en 200 x vergroting boven tien willekeurige velden in elk putje . Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd.}}

In vivo assay metastase

Voor de metastase in vivo assays, de stabiele cellijnen GC9811-P en SGC7901-M werden geoogst uit weefselkweek kolven na transfectie met het lentivirus pGCsil-GFP- laat-7f en controle pGCsil-GFP middels trypsine en driemaal gewassen met PBS. Vervolgens 2 x 10 ^{6 cellen werden gesuspendeerd in 0,2 ml serumvrije RPMI1640 per muis (zes in elke groep, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 weken leeftijd), en de cellen werden geïnjecteerd in de staartader. Na vier weken van injectie werden de muizen opgeofferd. Leverweefsel werd waargenomen met het blote oog, en het aantal zichtbare tumoren in de lever oppervlak werd geteld. De lever weefsels werden verdeeld in seriecoupes met fosfaatgebufferde neutrale formaline gefixeerd, gekleurd met hematoxyline en eosine en histologisch onderzocht. Naakt muizen werden gemanipuleerd en verzorgd volgens NIH Animal Care en gebruik Comite richtlijnen op het Experiment Animal Center van de Vierde Militaire Medische Universiteit (Xi'an, de provincie Shanxi, PR China).}

Luciferase Reporter Assay

Om te onderzoeken of MYH9 expressie werd gereguleerd door laat-7F, werd een dual-luciferase reporter assay uitgevoerd. De 3 'UTR van MYH9 die laat-7f bindingsplaats geamplificeerd met PCR. Amplificatie van MYH9 gebruikte de volgende primers: (Forward) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(omgekeerde) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3'

Als negatieve controle, de gemuteerde bindingsplaats van het 3'-UTR sequentie (met behulp van de omgekeerde complement van de bindingsplaats) werd versterkt met behulp van de primers: (Forward) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 '(omgekeerde) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3'. Producten werden teruggewonnen via agarose gelelektroforese en gekloneerd in de luciferase reporter PsiCHECK vector (Promega, Madison, WI). Alle constructen werden geverifieerd door sequencing. Log fase GC9811-P-cellen werden gezaaid in 24-well platen en gecotransfecteerd met Let-7f remmers of control, en luciferase reporters met behulp van Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) en volg de instructies. Na 48 uur incubatie werd vuurvlieg en Renilla luciferaseactiviteit gemeten met de dubbele luciferase reporter assay systeem (Promega).

Western Blot

De cellen werden tweemaal met ijskoud PBS gewassen en afgeschraapt in RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptine, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) met vers toegevoegde proteaseremmer cocktail (Roche) gedurende 15 min op ijs en vervolgens gecentrifugeerd bij 13.000 rpm gedurende 10 min en de supernatanten werden verzameld. Tien microgram van elk monster werd opgelost met behulp 6% SDS-PAGE en overgebracht op een nitrocellulosemembraan (Bio-Rad, Hercules, CA). De banden werden geïncubeerd met 10% niet vette droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing-0,1% Tween-20 aan de niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren en geïncubeerd met een primair antilichaam: konijnen polyklonaal anti-menselijk myosine IIA (verdund 1:500; Cell Signaling Technology ) overnacht bij 4 ° C. Na opwarmen en herhaald wassen driemaal 15 min voor elke werden de membranen geïncubeerd met mierikswortel-peroxidase-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (Santa Cruz Biotechnology), verdund 1:2000 gedurende twee uur bij kamertemperatuur. De banden werden gedetecteerd met behulp van een verbeterde chemiluminescentie (Amersham Biosciences).

Immunohistochemie

Twee weefsel arrays werden gekocht van SHANXI Chaoying BIOTECHNOLOGIE CO., LTD. Was maagkanker weefsel en gekoppeld aangrenzend normaal maagweefsel, de ander maagkanker weefsel en gekoppeld lymfeknoop metastase .Tissue arrays werden van was ontdaan in 60 ° C gedurende 2 uur, hoge temperatuur antigen herstel voor 10 minuten, gerehydrateerd, geïncubeerd in 10% normaal geit serum gedurende 1 uur, daarna geïncubeerd met konijn polyklonaal anti-menselijk myosine II A (verdund 1:100; Cell Signaling Technology) overnacht bij 4 ° C. De plaatjes werden in PBS driemaal gedurende 5 minuten elk. De weefsels werden geïncubeerd in geit anti-konijnenserum (DAKO) gedurende 1 uur, gespoeld met PBS. Secties werden gedetecteerd met behulp DAB en tegengekleurd met hematoxyline. De intensiteit van kleuring werd gescoord via vier stappen schaal (0, 1+, 2+ of 3+) en het percentage positieve cellen werd geschat door drie verschillende pathologen (0 = geen, 1 = < 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = > 70% van de tumorcellen). Totale gemiddelde scores werden vervolgens gegroepeerd in vier categorieën: negatief (geen detecteerbare kleuring wanneer ze worden beoordeeld in vergelijking met niet-specifieke achtergrond kleuring, zwak (+), matig (++) of sterke (+++) en vergeleken met behulp van Mann-Whitney-test

Statistische analyse

t-toets (tweezijdig), One-way ANOVA en Mann-Whitney-test werden gebruikt om te analyseren van de in vitro en in vivo gegevens met behulp van SPSS 12.0 software (Chicago, IL , USA) P-waarde. < 0,05 werd gedefinieerd als statistisch significant * P
. < 0,05; ** P
. < 0,01

Resultaten

het niveau van laat-7f expressie werd vaak verminderd bij humane GC metastatische cellijnen en weefsels

We hebben de mRNA expressie van let-7f twee paren van menselijke maagkanker cellijnen, GC9811, GC9811 onderzocht -P en SGC7901-NM, SGC7901-M. Zoals getoond in figuur 1A, expressie van laat-7f was lager in de GC cellen, GC9811-P en SGC7901-M, met een hoog metastatisch vermogen, terwijl de laat-7f was hoger expressie in het GC cellen, GC9811 en SGC7901-NM, met een lage metastatische potentieel. Om de rol van laat-7F bij maagkanker cellen metastase verder te valideren, vergeleken we de expressie niveaus van de laat-7F in verse menselijke maagkanker weefselmonsters met uitzaaiingen uit acht personen (tabel S1), de normale maag weefsels (NG), primaire maagkanker weefsels (GC) en verre uitgezaaide maagkanker weefsels (MC), respectievelijk door real-time PCR. Intrigerend was er opmerkelijk downregulatie van laat-7F in MC en GC, vergeleken met laat-7F expressie in NG (Figuur 1B). We zagen dat ofwel het verlies van of verminderde expressie van laat-7F in tumoren en hun metastatische weefsels geresulteerd in verbeterde uitzaaiingen bij maagkanker weefsels. De resultaten al gesuggereerd dat de expressie van laat-7F negatief zeer nauw gecorreleerd met een verminderde GC uitzaaiingen en kan een belangrijke rol in pathologische processen spelen. We zijn dus verstrekt klinische en cellulaire conceptuele bewijs voor een uitgezaaide switch in de ontwikkeling van kanker, dat een belangrijke rol voor de expressie van laat-7F in de ontwikkeling van kanker suggereert.

Let-7F remde de invasieve en metastatische vermogen van GC cellen in vitro

Omdat laat-7F fungeert als een agitator in invasie en metastatische processen, we onderzoek gedaan naar de effecten van verminderde laat-7f op minder metastatische cellijnen en verhoogde laat-7f op meer-metastatische cellijnen. Om dit te bereiken, korte interfererende RNA (siRNA) oligonucleotiden van laat-7F werden geconstrueerd en geïntroduceerd in GC9811 cellen en SGC7901 -NM cellen voor metastase assays in vitro, als GC9811-laat-7F-siRNA cellen, SGC7901-NM-laten-7F -siRNA cellen en controlecellen. Tegelijkertijd mimic-laat-7F en negatieve controle oligonucleotiden werden ook geconstrueerd en ingebracht in GC9811-P cellen en SGC7901-M cellen voor metastase assays in vitro, als GC9811-P-laat-7F-mimische cellen, SGC7901-N-heeft laten -7f-mimische cellen en controle cellen. Uitputting van laat-7f aanzienlijk verminderde het vermogen van GC9811 cellen te migreren en binnendringen via de Matrigel-gecoate membranen of de niet-Matrigel gecoate membranen in de richting van serum-bevattend medium in een gemodificeerde Boyden kamer assay (Figuur 2A). Verhoogde expressie van let-7f onderdrukte aanzienlijk het vermogen van GC9811-P cellen te migreren en binnendringen doorgaande Matrigel gecoate membranen of non-Matrigel beklede membranen richting serumbevattend medium in een gemodificeerde Boyden kamer assay (figuur 2B), vergeleken met de controlecellen. Vergelijkbare resultaten werden gevonden in SGC7901-NM-cellen (figuur 3A) en SGC7901-M-cellen (Figuur 3B), terwijl de laat-7F knock-out in GC cellijnen resulteerde in hogere invasie en migratie tarieven.

Let-7F remt tumor invasie en metastase in een naakt muis xenograft model

GC9811-P of SGC7901-M tumor cellen die met de lentivirus pGCsil-GFP laat-7f of negatieve controle pGCsil-GFP werd in naakt muizen en de muizen geïnjecteerd werden opgeofferd vier weken na de inenting. Het aantal metastatische nodi werd drastisch verminderd in de naakt muizen geïnjecteerd met de pGCsil-GFP-7f laten getransfecteerde cellen, in vergelijking met de negatieve controles (Figuur 4A, 4B). Deze gegevens bieden sterke aanwijzingen dat laat-7F kan tumor invasie en metastase in vivo te remmen.

Let-7F downregulates myosine IIA expressie door direct gericht zijn 3'-UTR

Om het mechanisme verder te verkennen door die laat-7F onderdrukt GC invasie en metastase, analyseerden we mogelijke downstream tumor-metastase gerelateerde target genen in silico. We ons gericht op let-7f doelgenen, vooral die genen die migratie en /of invasie-gerelateerde waren, en vonden dat myosine IIA, betrokken bij de bevordering van kankercelmigratie of invasie, kan het doelgen van laat-7f zijn. In een poging te bepalen of myosine IIA wordt geregeld door let-7f door directe binding aan het 3 'UTR, construeerden wij volledige lengte wild-type en mutante fragmenten van MYH9 mRNA 3' UTR en ingebracht ze in het gebied direct achter een luciferase reportergen (Figuur 5A). Vervolgens laat-7f mimic oligos werden gecotransfecteerd met verschillende luciferase 3 'UTR constructen in GC9811 P-cellen. We hebben waarmee-7f verlaagde de relatieve luciferaseactiviteit in het wildtype 3 'UTR van MYH9 (figuur 5B). Echter, luciferaseactiviteit niet sterk dalen in de UTR's met mutante bindingsplaatsen in vergelijking met het mut-type tegenhangers (Figuur 5C). Deze gegevens ondersteunen dat MYH9 directe doelwit van laat-7f.

RT-PCR toonde aan dat de expressie van MYH9 in GC9811 cellen en SGC7901 NM-cellen getransfecteerd met let-7f-bootst wordt neerwaarts gereguleerd in vergelijking met die cellen getransfecteerd met besturingsconstructies (figuur 5D). Western blotting resultaten toonden expressie van myosine IIA GC9811 en SGC7901 NM-cellen getransfecteerd met let-7f-mimetica neerwaarts gereguleerd in vergelijking met die getransfecteerd met negatieve controle (Figuur 5E). Furthmore, real-time PCR blijkt dat mRNA relatieve expressie van MYH9 in GC weefsels en verre metastatisch weefsel neerwaarts gereguleerd in vergelijking met hun normale naastgelegen niet-kankerachtige monsters (figuur 6A). Immunohistochemie toonde dat de expressie van myosine IIA GC lymfeklier is opgereguleerd in vergelijking met de primaire GC weefsel (tabel 2, figuur 6C, figuur S1B), en het is opgereguleerd in GC weefsel vergeleken met gematched aangrenzende normale maag weefsel (tabel 1, figuur 6B Figuur S1A) .Deze gegevens tonen aan dat laat-7F kan down-reguleren van de mRNA expressie van MYH9 en kan eiwit vertaling ervan onderdrukken

Discussie

In. deze studie hebben we aangetoond waarmee 7f-expressie in metastatische GC cellijnen downgereguleerd vergelijking laat-7f expressie in niet-metastatische cellen GC. Ectopische expressie en siRNA knock-down van laat-7F bevestigde zijn invasie onderdrukkende activiteit in vitro en in vivo. Bovendien tonen wij dat MYH9 een direct doelwit voor te laten-7f en dit laat-7f geïnduceerde inhibitie van MYH9 is afhankelijk van de 3'-UTR. Daarom zijn deze resultaten benadrukken het belang van laat-7f als een tumor suppressor in cel invasie en metastase door zich te richten MYH9 bij maagkanker.

Recente studies tonen aan dat miRNAs kunnen fungeren als activatoren of remmers van tumor metastase [27] . Bijvoorbeeld, microRNA-10b [28], miR-373 en miR-520C [29], [30] gestimuleerd kankercel migratie en invasie bij borstkanker. Bovendien kan miR-155 tumor invasie en metastase in borstkanker te bevorderen door neerwaarts reguleren van zijn doel, RhoA [31] en het bevorderen van de tumor invasie en metastase in pancreas duct carcinoom door het onderdrukken van de expressie van TP53INP1 [32]. De miRNA-200 familie (miRNA-200a, miRNA-200b, miRNA-200C, miRNA-141 en miRNA-429) kan tumor invasie en metastase remmen door het reguleren van de EMT [33]. MiR-126 bleek celadhesie, migratie en invasie remmen gedeeltelijk door het vernietigen van CRK in een in vitro model van niet-kleincellig longcarcinoom [34]. Er is aangetoond dat miR-29c aanzienlijk verminderd sterk invasieve en metastatische nasofaryngeale carcinomen [35]. MiR-218 remt de invasie en metastase van maagkanker door zich te richten de Robo1 receptor [26]. Hoewel veel studies zijn gedaan om het mechanisme van miRNA en tumormetastase onderzoeken dit mechanisme is niet duidelijk. Belangrijker zijn er weinig studies gedaan over de mechanismen van GC metastase regulering van microRNA.

De laat-7f gen zich op 9q22.3, en is betrokken bij diverse fysiologische en pathologische processen, zoals angiogenese [36], immunocyt differentiatie [37], replicatieve senescentie [38], groeistop [39], pulmonale arteriële hypertensie en kanker [23]. Laat-7F is neerwaarts gereguleerd in verscheidene tumoren. Een zeer gekarakteriseerde voorbeeld is niercelcarcinoom, waarin laat-7f downregulatie leidde tot een significante afname van kallikreïne (KLK) expressie [40]. KLKs kan ook worden gericht op let-7F bij eierstokkanker [25]. In papillaire schildklierkanker, verlaagde expressie van de laat-7F kan een essentiële moleculaire evenement in RET /PTC maligne transformatie [41] zijn. Bij primaire borstkanker echter laat-7F is opgereguleerd in vergelijking met normale aangrenzende tumorweefsels [22]. In ons onderzoek hebben we aangetoond dat laat-7F is ook neerwaarts gereguleerd in MC weefsels en GC cellijnen met een hoog metastatisch potentieel, en we verder onderzocht het mechanisme waarmee let-7F verminderd tumor invasie en metastase.

MYH9 is het gen voor de niet-spier myosine zware keten IIA (NMHCIIA), waarvan de mutaties verantwoordelijk zijn voor een complexe aandoening genaamd MYH9-gerelateerde ziekte, gekenmerkt door een combinatie van verschillende fenotypische kenmerken [42]. NMMHC-IIA, een 1960 aminozuur polypeptide met een vertaalde molecuulgewicht van 220 kDa, is een conventionele, niet-sarcomeer myosine tot expressie gebracht in de meeste cellen en weefsels. Zijn functies zijn onder andere rollen in cytokinese, celmotiliteit en het onderhoud van de cel vorm [43]. Veel studies suggereren dat MYH9 /NMHC-IIA een sleutelrol in tumorcellen invasief behavior.For bijvoorbeeld de EGF-afhankelijke fosforylering van de myosine-zware keten IIA een directe rol bij het veroorzaken motiliteit en chemotaxis in MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen [44]. Myosine IIA blijkt een belangrijke cellulaire doelwit van Mts1 [45], worden de kleine calciumbindend eiwit metastasin-1, en co-lokaliseert met Mts1 de voorrand van migrerende kankercellen [46]; Mts1 beïnvloedt zowel het samenstel gedrag van myosine IIA en fosforylering [47], [48]. Een recent rapport impliceert MYH9 (NMHC-IIA) als een doelwit van SRF, wat bijdraagt ​​aan de invasie en metastase bij borstkanker [49]. Onze gegevens tonen aan dat MYH9 het directe doel van laat-7f, die invasie en metastase geremd door binding van het 3'UTR MYH9, waardoor de neerwaartse regulatie van myosine IIA expressie.

Concluderend onze studie toont dat laat-7F kan de invasie en uitzaaiing van maagkanker te onderdrukken door het direct binden van de 3'UTR van MYH9, zijn doel. Hoewel er nog veel te leren over de rol van de laat-7F bij maagkanker ontstaan ​​van tumoren, laat-7F voorziet ons van een nieuw potentieel doelwit voor de maag de behandeling van kanker.

Ondersteunende informatie
Figuur S1. Ondernemingen De expressie van MYH9 in de maag tumor exemplaren. (A) Expressie van MYH9 in primaire maagkanker (Ca) en de aangrenzende normale maag weefsel (N) van IHC. (B) Expressie van MYH9 in primaire maagkanker (Ca) en zijn afgestemd lymfeklieren metastase weefsel (M) door IHC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0018409.s001
(TIF)
Table S1.
Clinicopathologische beschikt in 8 verse maag tumor samples.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0018409.s002
(DOC)

Dankwoord

We zijn dankbaar voor Zheng Chen voor een uitstekende begeleiding tijdens het experiment

• PLoS ONE: Oncogene CagA Bevordert Risk maagkanker via Activating ERK signaalwegen: een geneste case-control studie
• PLoS ONE: Wnt /β-catenine signalering Verbetert cyclooxygenase-2 (COX2) transcriptie-activiteit bij maagkanker Cellen