PLoS ONE: CEACAM6 Skatina skrandžio vėžio invazija ir metastazių stimuliuoja epitelio-mezenchiminių Perėjimas per PI3K /AKT Signalizacijos Pathway

Anotacija

ekspresija CEACAM6 naviko audiniuose vaidina svarbius vaidmenis invazija, metastazių ir atsparumo anoikis į veislės žmogaus vėžio. Mes neseniai pranešė, kad CEACAM6 išraiška yra aktyvinama skrandžio vėžio (GC) audinių ir skatinti GC metastazių. Čia mes pranešti, kad CEACAM6 skatina pilvaplėvės metastazių
vivo, parsisiųsti ir neigiamai koreliuoja su El-cad raiškos GC audiniuose. Ekspresija CEACAM6 sukeltas epitelio-mezenchiminių perėjimas (EMT) ir GC, matuojamas padidėjimu EMT žymekliai N-cad, Vimentin ir Slug o El-cad išraiška sumažėjo CEACAM6-ekspresija GC ląstelių; priešingos rezultatai buvo pastebėtas CEACAM6-nutildė ląsteles. Be to, e-cad išraiška buvo neigiamai koreliuoja su gylio naviko invazijos, limfmazgių metastazių ir TNM etape GC audiniuose. Be to, CEACAM6 padidėjusi matricos metaloproteinazės-9 (MMP-9) veikla GC, ir anti-MMP-9 antikūnai gali pakeisti vis invazija ir migracijos sukeltas CEACAM6. CEACAM6 taip pat padidino fosforilinto AKT, kuris dalyvauja A įvairiuose žmogaus navikuose progresavimo lygį. Mes taip pat pastebėjo, kad LY294002 A PI3K inhibitorius, gali pakeisti CEACAM6 sukeltas EMT per mezenchimos-epitelio perėjimą. Šie rezultatai rodo, kad CEACAM6 pagerina invazija ir metastazes GC skatinant EMT per PI3K /AKT signalinio kelio

nurodomoji dalis:. Zang, M, Zhang B Zhang Y Li J S L Zhu Z ir kt , (2014) CEACAM6 Skatina skrandžio vėžio invazija ir metastazes stimuliuoja epitelio-mezenchiminių Perėjimas per PI3K /AKT signalinio kelio. PLoS ONE 9 (11): e112908. Doi: 10,1371 /journal.pone.0112908

redaktorius: Chun-Ming Wong universiteto Honkonge, Honkongas

Įstojo: rugpjūčio 7, 2014; Priėmė: Balandis 16, 2014 m Paskelbta: Lapkričio 14, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Zang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus

Finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas dotacijas iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81172324, Nr 91229106, Nr 81272749 ir ​​Nr 81372231) ir Pagrindiniai projekto Šanchajaus švietimo komiteto (Nr 12ZZ105 ir No.12ZZ102) ir mokslo ir technologijų komisijos Šanchajaus savivaldybės (Nr 13ZR1425600). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

GC yra vienas iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų ir pagrindinių sveikatos problema visame pasaulyje, ypač Rytų Azijos šalių, tokių kaip Japonija, Pietų Korėja, Kinija, kur ji yra antra priežastis, dėl vėžio susijusių mirties [1] - [3]. Karcinoembrioninius antigenas susijusių ląstelių adhezijos molekulės 6 (CEACAM6) yra glycosylphosphatidylinositol (GPI) -susijęs imunoglobulinas superšeimai narys, ekspresija į žmogaus vėžio, ypač virškinimo trakto vėžio įvairovė [4], ir veikia kaip tarpląstelinio adhezijos molekules [4] - [6]. Nors CEACAM6 yra GPI-įtvirtinta ląstelės paviršiaus glikoproteino jis neturi transmembraninio arba ląstelėje domeną, bet gali daryti įtaką viduląstelinius signalizavimo įvykius ir vaidina svarbų vaidmenį virškinimo trakto vėžio progresavimo [4], [6] - [8]. GPI-įsišaknijusi molekulės yra dažnai bendrai lokalizuota į mažų membraninių microdomains membranoje plazmos [9], kuris gali aktyvuoti pasroviui signalines kaskados, pavyzdžiui, integrino signalinio kelio [10]. CEACAM6 tarpininkauja navikų onkogeno ir skatina vėžio invazijos, metastazes, atsparumas anoikis ir Atsparumas cheminėms ir slopina diferenciaciją [7], [8], [11]. Mes neseniai pranešė, kad CEACAM6 išraiška yra aktyvinama ir susijęs su limfmazgių metastazių GC audiniuose [12]. Tačiau mechanizmai, per kuriuos CEACAM6 įtakos ląstelėse signalo perdavimas į GC dar reikia nustatyti.

epitelio-mezenchiminių perėjimas (EMT) yra ne tik fiziologinis procesas, kurio metu embriono vystymasis ar audinių regeneracijos, o taip pat patologinis elementas vėžys progresavimo, įtraukiant naviko metastazės, apoptozės ir atsparumas senėjimas [13] - [15]. EMT visada rodo prastą klinikinį prognoziq žmogaus vėžio. Atitinkamų EMT inicijuoti mechanizmų skaičius buvo dokumentuota, įskaitant TGF-beta, IL-6, PI3K /AKT, RAF /MAPK ir SRC takais [15] - [18]. Mūsų ankstesniame tyrime, mes nustatėme CEACAM6 sukeltos SRC aktyvacijos GC ląstelių [12], ir pastebėjo didesnį skaičių verpstės formos CEACAM6 ekspresija ląstelių, lyginant su kontrolinių ląstelių. Taigi, mes buvome labai domina nustatyti tarp CEACAM6 ir EMT santykius GC ląsteles. Nors neigiama koreliacija tarp CEACAM6 ir EMT buvo užfiksuotas kasos karcinoma [19], mechanizmų, kuriais CEACAM6 reguliuoja EMT yra sunkiai suprantamas.

Šiame tyrime mes toliau nagrinėjo poveikį ir galimus kelius CEACAM6 GC invazija ir metastazių, ir ištirti jos ryšį su EMT.

medžiagos ir metodai

etika pareiškimas

Parašė informuotas sutikimas tyrime buvo gauti iš visų dalyvių. Tyrimo protokolas buvo patvirtintas etikos komiteto Ruijin ligoninė, Šanchajaus Jiao Tong universiteto medicinos mokyklos. Gyvūnų procedūros buvo atliktos pagal protokolą pagal institucinius gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto (IACUC) Šanchajaus Jiao Tong universiteto, Šanchajus, Kinija patvirtino.

Mobilaus ryšio linijos ir audinių mėginiai

žmogus GC ląstelių linijos SGC-7901, MKN-45 ir MKN-28 buvo įsigyti iš Šanchajaus institutai biologijos mokslų, Kinijos mokslų akademijos. Ląstelės buvo auginamos 37 ° C temperatūroje 5% CO _{2 ir sočiųjų drėgnumo RPMI-1640 terpėje, turinčioje 10% vaisiaus galvijų serumo.}

skrandžio naviko ir greta ne-auglio, audinių buvo gauti iš 93 pacientų, sergančių GC, kuris patyrė chirurginio gydymo Šanchajaus Jiaotong universiteto medicinos mokyklos filialas Ruijin ligoninėje nuo 2010 iki 2013 pacientų sudarė 69 vyrų ir 24 moterų amžiaus vidurkis 62.1 metai (diapazonas, 30-85 metų). Nė vienas iš pacientų gavo radioterapija ar chemoterapija prieš operaciją. Klinikos duomenys buvo renkami ir patologinis naviko stadija buvo nustatomas atsižvelgiant į UICC TNM klasifikaciją. Histologinis rašyti atliko ne mažiau kaip dviejų ekspertų patologai darbo nepriklausomai dvigubai aklu metodu. Šis tyrimas patvirtino Etikos komiteto Šanchajaus Ruijin ligoninės, o visi pacientai buvo išsamiai informuoti apie eksperimentinių procedūrų.

Vektorius statybos ir transfekcija

Visas ilgis CEACAM6 kDNR buvo gautas RT- PGR iš viso RNR išgaunamas iš GC pavyzdžius. Pradmenys sekos buvo 5'-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 '(į priekį) ir 5'-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3' (atgal). Mes surinkome pIRES2-EGFP-CEACAM6 statyti įterpiant CEACAM6 kDNR į pIRES2-EGFP vektorių. Mes šalia perkeltų pIRES2-EGFP-CEACAM6 arba pIRES2-EGFP vektorių į SGC-7901 ir MKN-45 ląstelių naudojant Lipofectamine 2000 (INVITROGEN, Karlovi Varai, JAV) pagal gamintojo protokolą. Stabilus klonai atrinko nuolatinio gydymo G418 (1,2 mg /ml, Lanksčiai, Niujorkas, JAV)

lentiviruso vektorius statybos

Remiantis žmogaus CEACAM6 genų duomenimis, oligonukleotidų sekų pora. ir neigiami kontroliniai sekos buvo susintetinta Šanchajus Novobio mokslinio Co, Ltd shRNR sekos buvo taip: CEACAM6, 5'-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 "(į priekį), ir 5'-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3 '(atgal); kontrolė, 5'-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 '(į priekį), ir 5'-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3' (atgal). CEACAM6 shRNR buvo subklonuotas į PL /shRNR /F lentiviruso vektoriaus gauti PL /shRNR /SHR-CEACAM6 konstruktą. Tada PL /shRNR /SHR-CEACAM6 arba kontroliuoti lentiviruso vektoriai buvo pernešta į MKN-28 GC ląsteles. Stabiliai Transfekuoti ląstelės buvo atrinkti gydyti 5 mikrogramai /ml blasticidin ir buvo naudojami identifikavimo ir tolesniems moksliniams tyrimams.

imunoblotingu

Ląstelės buvo nukirsta ir lizuoti naudojant Ripa buferis (Solarbio, Pekinas, Kinija ), kurių sudėtyje yra 1% PMSF proteazės inhibitorių. BCA tyrimas rinkinys (Pierce, Rokfordas, JAV) buvo naudojamas matuoti bendro baltymo koncentracijai. Lygiaverčiai sumos baltymų buvo atskirtos nuo 10% SDS-PAGE, ir išspręsti baltymai perduota PVDF membranos. Membranos buvo blokuotos 5% lieso pieno 2 h, ir inkubuojami su pirminiais antikUnais per naktį 4 ° C temperatūroje. Pirminiai antikūnai buvo taip: CEACAM6 (1:500; Abcam, JAV), E-cad (1:500; Mobilusis Signalizacijos technologijos (BST), JAV), N-cad (1:500; CST, JAV) Vimentin ( 1:1000; BST, JAV), slunkius (1:500; BST, JAV), p-AKT (Ser473) (1:1000; BST, JAV), bendras AKT (1:1000; BST, JAV) ir GAPDH ( 1:10000; Abcam, JAV). tada Membranos buvo inkubuojami su antriniais antikūnais 2 valandas kambario temperatūroje ir buvo vizualizuojama naudojant sustiprintą chemiliuminescencija aptikimo sistemą (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, JAV) pagal gamintojo protokolą.

imunofluorescencines dažymo

Ląstelės buvo auginamos ant coverslips 24 h ir tada tvirtinama su 4% paraformaldehido 15 min. Ląstelės buvo plaunamos PBS, tada laidžiomis su 0,5% Triton X-100, 20 min ir užblokuotas su 5% BSA 30 min kambario temperatūroje. Mes kitą nudažomi ląsteles su CEACAM6 antikūno (1:50; Abcam) 37 ° C temperatūroje 2 val, po to inkubacijos su fluorescencinio antrinio antikūno 1 val kambario temperatūroje. Branduolys buvo tamsintas su DAPI. Rodamininių faloidinas antikūnas (1:150; citoskeleto) buvo naudojamas vizualizuoti GC ląstelių citoskeleto. Skaidrės buvo analizuojami ir nufotografuota ant fluorescencinio mikroskopo.

imunohistocheminis

Profiliai iš 4 mkm storio buvo išpjauti iš parafino įterptųjų audinių blokelių ir tada deparaffinized ir rehidrataciją. Imunohistocheminį dažymo sekcijų buvo atlikta pagal DAKO protokolu, naudojant pelės anti-CEACAM6 (1:100; Abcam) ir E-cad (1:100; BST), esant 4 ° C naktį. tada Skaidrės buvo inkubuojami su HRP pažymėtą antrinio antikūno ir regimos diaminobenzidinu. Du patologai, kurie buvo apakinti bet kuriam pacientui duomenų nepriklausomai įvertintos ir pelnė skyrius. Imunohistocheminis dėmių rezultatas = teigiama ląstelė rezultatas + dažymo intensyvumo balas. Teigiamų ląstelių procentas pelnytas taip: 0 (10%), 1 (10-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) ir 4 (> 75%). Imunohistocheminis raiškos intensyvumas buvo rūšiuojami taip: 0 (dažymo), 1 (silpnas dažymo), 2 (rudi dažymo) ir 3 (tamsiai rudos dėmės). Iš viso balų ≥ 3 buvo apibrėžiamas kaip teigiamas supaprastinti duomenų analizę. Analizuoti tarp CEACAM6 ir E-cad raiškos, vaizdo-Pro Plus "6.0 versija koreliaciją (Media Kibernetika, Inc, Bethesda, MD, JAV) buvo naudojama kiekybiškai CEACAM6 ir E-cad išraišką 20 mėginių.

Želatina zymography

Jei išnagrinėti MMP-9 aktyvumą, zymography buvo atliekama naudojant 10% SDS-PAGE geliai, kurių sudėtyje yra 1 mg /ml želatina (Sigma). Trumpai, GC ląstelės buvo auginamos serumo neturinčioje RPMI-1640 terpėje 24 h ir tada supernatantas buvo surinkti ir centrifuguojamas, esant 1000 apsisukimų per minutę 5 min. Geliai buvo plaunamos du kartus renatūracijos buferinio tirpalo (2,5% Triton X-100) kiekvieną kartą, pašalinti SDS po elektroforezės ir tada inkubuojamas 37 ° C temperatūroje 24 val reakcijos buferinio tirpalo (50 mmol Tris-HCl pH 7,5, 5 30 min mM CaCl2, 150 mm NaCl). Mes šalia tamsintas gelių su 0,5% Coomassie briliantinis mėlynasis R-250 2 h ir destained gelių buferyje (30% metanolio, 10% acto rūgšties). Išvalyti skaidrios juostos į mėlyną dažymo fone atstovavo gelatinazė veiklą.

Mobilusis migracija ir invazija tyrimai

ląstelių migraciją ir invazija tyrimus, iš 1 × 10 ^{5 ląstelių viso buvo sustabdytas RPMI-1640 serumo nemokamai su arba be MMP-9 antikūnas (Abcam, 2 g /200 uL) ir padengtą į transwell rūmų (8 mikrometrai už 24 šulinėlių plokštelės; Corning "Costar, NY, JAV) su arba be Matrigel ( BD biologijos, CA, USA) pagal gamintojo protokolai. Už abu tyrimai, terpę, turinčią 10% FBS buvo įtraukta į apatinę kamerą kaip chemoattractant. Po 24 h kultūra, ląstelės buvo nustatytas 10% formalinu ir tamsintas 0,5% violetinei. Galiausiai, ląstelės apatinėje kameroje buvo fotografuotas ir skaičiuoja apversto mikroskopu.}

nude pelės svetimo modelis

Keturių savaičių amžiaus Vyras Balb /c nuogas pelėms (institutas Zoologijos, Kinija akademija mokslai) buvo naudojami siekiant įvertinti CEACAM6 vaidmenį pilvaplėvės plinta
, in vivo
. Nude pelėms buvo laikomi tam tikru patogeno aplinkos Gyvūnų laboratorijos padalinys, medicinos mokyklos, Šanchajaus Jiao Tong universiteto, Kinija. Pelės gavo humaniškai ir studijų protokolai buvo atliekamas pagal protokolą pagal institucinius gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto (IACUC) patvirtintą Šanchajaus Jiao Tong universiteto Šanchajuje, Kinijoje. A 2 × 10 ^{6 SGC-7901-CEACAM6 ar viso SGC-7901-NC ląstelės buvo švirkščiamas į penkias peles pilvo ertmę kiekvienos grupės (Atsitiktinės). Pelės buvo numarinti 30 dieną po injekcijos, ir pilvo mases buvo nufotografuota ir fotografavo. Visi eksperimentai buvo atliekami laikantis oficialių rekomendacijų Kinijos gyvūnų bendruomenės.}

Statistika

Studento , T
-test buvo nagrinėjama statistinius skirtumus tarp šių dviejų grupių , Koreliacija tarp El cad raiškos GC audinių ir klinikos parametrus ir CEACAM6 išraiška buvo analizuojami chi kvadrato ar Fisher'io bandymus arba Pearson koreliacijos koeficientas analizė. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± SD. P
< 0,05 ir P
. ≪ 0,01 buvo laikomas statistiškai reikšmingas ir labai svarbus, atitinkamai

Rezultatai

CEACAM6 paveikia ląstelių morfologija ir Citoskeletas

Mūsų ankstesni rezultatai reiškė, kad MKN-28 GC ląstelės natūraliai išreikšti aukšto lygio CEACAM6, o SGC-7901 ir MKN-45 GC ląstelės išreiškia žemą lygį [12]. Padidėjusi CEACAM6 į SGC-7901 ir MKN-45 GC ląstelių ir silpninimo CEACAM6 raiškos MKN-28 GC ląstelėse PL /shRNR /SHR-CEACAM6 lentiviruso vektoriai buvo patvirtinta baltymų lygio Vakarų dėmė analizė (pav. 1A). IMUNOFLUORESCENCIJOS tyrimai visada parodė, kad SGC-7901-CEACAM6 ląstelės išreiškė daugiau CEACAM6 baltymų nei SGC-7901-NC ląstelės (pav. 1B).

Įdomu, ląstelių morfologija buvo pakeistas po CEACAM6 slopinimas ir raiškos. Palyginti su kontroline ląsteles, SGC-7901-CEACAM6 ir MKN-45-CEACAM6 ląstelės eksponuojami daugiau mezenchiminių-kaip morfologiją ir buvo spindle- ir Vārpstveidīgs formos (pav. 1C). Priešingai, būdingas perėjimas nuo mezenchiminių epitelinio morfologija buvo aptiktas MKN-28-sh ląstelių, lyginant su MKN-28-NC ląstelių (pav. 1c). Tačiau kol kas neaišku, jei CEACAM6 raiška turėjo įtakos citoskeleto Taip imunofluorescencinių dažymo F-aktino dažymo buvo atliktas. Įdomu tai, kad didesnis dydžio Vārpstveidīgs formos ląstelės buvo pastebėta MKN-45-CEACAM6 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901-CEACAM6 linijos, lyginant su kontrolinių ląstelių (1D pav.).

CEACAM6 neigiamai susijęs su E-cad į GC audiniai

Imunohistocheminis analizė buvo naudojama, siekiant nustatyti e-cad išraiškos lygį vėžio audiniuose ir suporuotas gretimų ne tumoro audiniuose. Imunohistocheminį dažymo parodė El cad išraiška buvo mažesnė navikų audiniuose, negu gretimose ne tumoro audiniuose, atskleidė, kad El-cad daugiausia įsikūrę epitelio ląstelių (pav. 2D, E, F) cytomembrane. Be to, mes ištirti ryšį tarp e-cad saviraiškos ir klinikos ypatybių GC santykius ir nustatė, kad downregulated El cad buvo susijęs su gylio invazijos ( P
= 0,046), limfmazgių metastazių ( P
= 0,013), ir TNM stadija ( P
= 0,035), bet ne su kitais klinikos veiksnių, įskaitant lytį, amžių, ar diferenciacijos (1 lentelė). Be to, CEACAM6 neigiamai koreliuoja su EMT kasos karcinoma [19], ir CEACAM6 slopinimo gali padidėti El cad promotoriaus aktyvumą kolorektalinio vėžio [20].

Be to, mes ištirti ryšį tarp E-cad ir CEACAM6 raiškos sąsajas į gCS pagal serijos skyriaus imunohistocheminis (20 mėginių). CEACAM6 išraiška navikų audiniuose buvo didesnis nei, kad suderintų ne tumoro audinių (Pav. 2a, B, C), atitinkančių mūsų ankstesnius rezultatus [12]. Įdomu tai, mes nustatėme, kad CEACAM6 išraiška buvo neigiamai koreliuoja su El-cad raiškos GC audiniuose Pearson koreliacijos koeficientas analizė ( P
< 0,01;. 2G pav).

CEACAM6 skatina EMT į GC ląstelės

EMT susijusių baltymų GC ląstelių vertino Vakarų dėmė analizė. Mes pastebėjo, kad N-cad, Vimentin ir Slug baltymų kiekis buvo padidintas, o El-cad buvo sumažėjo CEACAM6 ekspresija ląstelių, lyginant su jų atitinkamų kontrolinių ląstelių (pav. 3A, B). Converse rezultatai buvo gauti po CEACAM6 buvo nuversta į MKN-28 ląstelių (3C, D pav.). Šie rezultatai rodo, funkcinį vaidmenį CEACAM6 reguliuojant EMT GC ląsteles. Be to, šios pastabos GC ląstelių buvo panašūs su GC audinio išvadas.

CEACAM6 pakelia MMP-9 aktyvumą GC ląstelių

Jis yra gerai žinoma, kad sukibimas, degradacija ir migracija pagrindiniai klausimai vėžio metastazių. Želatina zymography buvo atliktas, siekiant įvertinti CEACAM6 poveikį MMP-9 veiklos, kuri yra svarbi ECM degradacija. MMP-9 veikla SGC-7901-CEACAM6 ir MKN-45-CEACAM6 ląstelių buvo padidintas, palyginti su jų valdymo grupių (pav. 4A, B),. Mes šalia ištirti, ar padidėjęs aktyvumas MMP-9 sukeltas CEACAM6 GC ląstelių lėmė tikra prieaugio invazija ir migruojančių ląstelių skaičius. Mes taip išnagrinėta aktyvios kovos su MMP-9 antikūno arba PBS indėlį į CEACAM6-ekspresija GC ląsteles. Kaip ir tikėtasi, buvo nustatyti reikšmingi skirtumai užplūsta ir migruojančių ląstelių antikūnų gydytų ląstelių, lyginant su PBS gydytų ląstelių ( P
< 0,01; pav. 4C, D, E, F), skaičius.

CEACAM6 upregulates fosforilinto AKT GC ląstelių

anksčiau pastebėta, kad SRC veikla buvo sukeltas CEACAM6 į SGC-7901 GC ląsteles. AKT yra pasroviui baltymas SRC ir dramatiškai susietas su EMT, invazija ir metastazių auglio progresavimo. Todėl vertinamas AKT veiklą CEACAM6-ekspresija GC ląsteles. Imunoblotingu parodė, kad AKT fosforilinimo metu serino 473 buvo ženkliai padidėjo CEACAM6-ekspresija GC ląstelių, lyginant su kontrolinės grupės (pav. 5A, B). Norėdami patikrinti, ar EMT pokyčiai buvo sukeltas CEACAM6 per PI3K /AKT kelyje, SGC-7901-CEACAM6 ir MKN-45-CEACAM6 ląstelės buvo gydomi 100 Nm LY294002 24 val. Įdomu tai, kad e-cad buvo padidintas ir N-cad buvo sumažintas LY294002 gydytų CEACAM6 ekspresija ląstelių, lyginant su kontrole, vertinant pagal Vakarų dėmė analizė (Pav. 5C, D).

CEACAM6 skatina peritoninės plinta in vivo

Galiausiai, mes išnagrinėjo CEACAM6 raiškos poveikį pilvaplėvės plinta ir metastazių
vivo pervežimas. Mes švirkščiamas SGC-7901-CEACAM6 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901-NC ląstelės į nuogas pelių pilvus. Platus pilvaplėvės plitimas buvo pastebėtas SGC-7901-CEACAM6 grupėje, lyginant su SGC-7901-NC grupės (pav. 6a). Nebuvo žymiai matomi pilvaplėvės mazgeliai į SGC-7901-CEACAM6 grupėje, nei kontrolinėje grupėje (5,400 ± 0,510 vs
1,400 ± 0,245, P
. ≪ 0,01; pav. 6B ). Be to, padidėjusią CEACAM6 didinant metastazių
, in vivo
taip pat buvo pranešta kasos vėžiu [19].

Diskusijos

GC yra antroji priežastis vėžio susijusių mirties visame pasaulyje [1]. Didinti duomenys rodo, kad CEACAM6 vaidina svarbų vaidmenį virškinimo vėžio progresavimo [7], [20] - [22], ir CEACAM6 yra labiau paplitusi nei CEA (CEACAM5) sveikuose audiniuose, ryškus išraiškos daugelyje epitelyje [4]. CEACAM6 įtakoja vidines ląstelių signalines įvykius per homophilic ir heterophilic sukibimo su kitomis CEACAMs ar integrinų [23], [24]. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti GPI įtvirtinti baltymų CEACAM6 įmokas GC progresavimą.

Įdomu, mes nustatėme, kad ląstelių morfologija ir Citoskeletas struktūra buvo pakeista stabili ląstelę ir downregulation CEACAM6 GC ląsteles. CEACAM6 ekspresija ląstelės buvo daugiau mezenchiminių-kaip ir eksponuojami veleno ir Vārpstveidīgs formos, ir daugiau aktino streso pluoštai buvo aptikta palyginti su kontrolinių grupių, į procesą apibrėžiamas kaip EMT. Mezenchiminių fenotipas apdovanoja ląsteles su daugiau migruojančių ir invazinių savybių [15]. Šis pastebėjimas buvo suderintos su
, in vivo
rezultatai kuriuo CEACAM6 sukeltų didelę peritoninės išskaidymo nuogas pelių. RER buvo pastebėta šių nutildymo iš CEACAM6 GC ląsteles. Šie stebėjimai parodė, kad CEACAM6 gali dalyvauti skatinančius EMT GC. Mes šalia išnagrinėjo tarp CEACAM6 ir E-cad, iš EMT persekiotoją koreliaciją, GC audiniuose imunohistocheminį dažymo. Kaip ir tikėtasi, reikšminga neigiama koreliacija pastebėta tarp CEACAM6 ir E-cad, ir E-cad išraiška buvo susijęs su gylio naviko invazijos, limfmazgių metastazių ir TNM etape GC audiniuose. Be to, CEACAM6 skatinamas limfmazgių metastazių ( P
= 0,001) 98 GC audinių mūsų ankstesniame tyrime [12]. Ankstesni rezultatai parodė, kad CEACAM6 slopinimas padidėjo El cad promotoriaus aktyvumą kolorektalinio vėžio [20]. Remiantis pirmiau minėtų faktų, mes prielaidą, kad CEACAM6 skatinamas GC invazija ir metastazes, sukeldami EMT ir gali tarnauti kaip mezenchimos persekiotoją.

Metastazė yra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirties, bet buvo sunku mokytis, nes juo susijęs su retų, stochastinių renginių. Potencialių signalizacijos būdus, susijusius su vėžio metastazių skaičius buvo parodyta, įskaitant PI3K /AKT, MAPK /ERK, FAK-SRC, JAK /STAT, NF-kβ ir MMP takais [25] - [27]. Šiame tyrime padidėjusią CEACAM6 padidėjusi MMP-9 Aktyvumas, ir anti-MMP-9 antikūnai gali pakeisti didėjančius invazinės ir migracijos savybes, atsirandančias dėl CEACAM6. EMT inicijavimas yra reikšmingai koreliavo su vėžio metastazių ir skatina kamieninių ląstelių savybes, apsaugo nuo apoptozę ir senėjimo, ir prisideda prie imuninės sistemos slopinimo vėžio progresavimo [15]. EMT gali būti sukeltas per aktyvavimo PI3K /AKT signalinio kelio [28], [29]. CEACAM6 veikia kaip tarpląstelinio adhezijos molekules ir gali sudaryti didesnių lipidų plaustai, sąveikaudamas su savimi ar kitais CEACAMs, taip įjungiant pasroviui signalines kaskadas, pavyzdžiui, integrinu ir PI3K /Akt takais [10], [30]. Todėl mes išnagrinėjo CEACAM6 raiškos poveikį AKT fosforilinimo lygio GC ląsteles. Fosforilinamos AKT koncentracija padidėjo CEACAM6 ekspresija ląsteles, suderinamas su ankstesniais rezultatais pažymėta kasos karcinoma [8], [11]. Pagal šias pastabas, siūlome hipotezę, pagal kurią CEACAM6 sukeltos EMT įvyksta per aktyvavimo PI3K /AKT signalizacijos kaskadą GC. Be to, CEACAM6 ekspresija ląstelės gydomi LY294002 A PI3K inhibitorių, buvo atlikta daug EMT pasikeitimams per RER. Taigi, galime daryti išvadą, kad CEACAM6 skatina EMT aktyvuojant PI3K /AKT signalizacijos kelią į GC ir gali tarnauti kaip potencialų taikinį auglio gydymo.

Taigi, mes turime iliustruoja, kad CEACAM6 veikia kaip onkogeno skatinant EMT per PI3K /AKT aktyvacijos GC. Be to, e-cad yra žymiai downregulated GC audinių nei suporuotas gretimų ne tumoro audiniuose. CEACAM6 skatina invazija ir metastazes
vitro parsisiųsti ir
, in vivo
ir gali būti potencialus naujos diagnostikos ir prognostinė žymeklį ir romano tikslas GC terapija.

Pagalbinė informacija
Kontrolinis sąrašas S1. Viesbutis The ARRIVE gaires. Visos in vivo mūsų rankraščio buvo eksportuota pagal atvykti gaires
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0112908.s001
(DOC)

Padėka

norėtume padėkoti Xuehua Chen Jianian Zhang už techninę pagalbą, skirtą Beiqin Yu dėl savo materialinės paramos.

• PLoS ONE: RABEX-5 yra aktyvinama ir vaidina onkogeniniam vaidmuo skrandžio vėžio vystymąsi aktyvuojant VEGF signalinio kelio
• PLoS ONE: anksti šėrimas per burną po skrandžio vėžio chirurgijos Įmanoma? Sisteminė apžvalga ir metaanalizė randomizuotų kontroliuojamų tyrimų