PLoS ONE: CEACAM6 fördert Magenkrebs Invasion und Metastasierung von über PI3K /AKT Signalweg Epithelial-mesenchymale Transition Induzierende

Abstrakt

überexprimiert CEACAM6 in Tumorgewebe spielt eine wichtige Rolle bei Invasion, Metastasierung und anoikis Widerstand in einer Vielzahl von Krebserkrankungen des Menschen. Vor kurzem berichteten wir, dass CEACAM6 Expression in Magenkrebs (GC) Gewebe und gefördert GC Metastasierung hochreguliert wird. Hier berichten wir, dass CEACAM6 Peritonealmetastasen in fördert
vivo
und ist negativ mit E-Cadherin-Expression in GC Gewebe korreliert. Überexprimiert CEACAM6 induzierte epithelial-mesenchymale Transition (EMT) in GC, wie durch den Anstieg in den EMT-Marker gemessen N-Cadherin, Vimentin und Slug während E-Cadherin-Expression wurde in CEACAM6-überexprimierenden GC-Zellen verringert; Gegen Ergebnisse wurden in CEACAM6-Schweigen-Zellen beobachtet. Darüber hinaus wurde E-Cadherin-Expression negativ mit der Tiefe der Tumorinvasion, Lymphknotenmetastasen und TNM-Stadium in GC Gewebe korreliert. Zusätzlich CEACAM6 erhöhte Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) -Aktivität in GC und anti-MMP-9-Antikörpers könnte die zunehmende Invasion und Wanderung von Reverse CEACAM6 induziert. CEACAM6 erhöhte auch die Mengen an phosphoryliertem AKT, die in dem Verlauf einer Vielzahl von humanen Tumoren beteiligt ist. Wir beobachteten weiterhin, dass LY294002, ein PI3K-Inhibitor, umkehren könnte mesenchymalen-epithelialen Übergang CEACAM6-induzierte EMT über. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CEACAM6 Invasion und Metastasierung in GC verbessert durch EMT über den PI3K /AKT Signalweg Förderung

Citation. Zang M, Zhang B, Zhang Y, Li J, Su L, Zhu Z, et al . (2014) CEACAM6 fördert Magenkrebs Invasion und Metastasierung von Induzierende Epithelial-mesenchymale Transition über PI3K /AKT Signalweg. PLoS ONE 9 (11): e112908. doi: 10.1371 /journal.pone.0112908

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong

Empfangen: 7. August 2014; Akzeptiert: 16. Oktober 2014; Veröffentlicht: 14. November 2014

Copyright: © 2014 Zang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr 81172324, Nr 91229106, Nr 81272749 und Nr 81372231) unterstützt wurde, und Key-Projekt von Shanghai Education Committee (Nr 12ZZ105 und No.12ZZ102) und Wissenschaft und Technologie Kommission der Stadt Shanghai (Nr 13ZR1425600). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

GC ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren und ein großes gesundheitliches Problem weltweit, vor allem in den ostasiatischen Ländern wie Japan, Korea, China, wo es die zweite Ursache der durch Krebs verursachten Tod ist [1] - [3]. Carcinoembryonic antigen-verwandte Zelladhäsionsmolekül 6 (CEACAM6) ein Glycosylphosphatidylinosit (GPI) -verknüpfte Immunglobulin-Superfamilie Mitglied, das in einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten überexprimiert wird, insbesondere gastrointestinaler Karzinome [4], und fungiert als ein interzelluläres Adhäsionsmolekül [4] - [6]. Obwohl CEACAM6 ist ein GPI-verankerten Zelloberflächen-Glykoprotein eine transmembrane oder intrazelluläre Domäne fehlt, aber in der Lage, die intrazelluläre Signalereignisse zu beeinflussen und spielt eine wichtige Rolle bei der Progression gastrointestinalen Krebs [4], [6] - [8]. GPI-verankerte Moleküle oft co-lokalisiert auf kleine Membran-Mikrodomänen in der Plasmamembran [9], die nachgeschalteten Signalkaskaden wie der Integrin-Signalweg aktivieren kann [10]. CEACAM6 wirkt als ein Onkogen in Tumoren und fördert Krebsinvasion, Metastasenbildung, anoikis Beständigkeit und Chemoresistenz und hemmt die Differenzierung [7], [8], [11]. Vor kurzem berichteten wir, dass CEACAM6 Ausdruck hochreguliert wird und mit Lymphknotenmetastasen in GC Geweben assoziiert [12]. Jedoch bleiben die Mechanismen, durch die Einflüsse CEACAM6 intrazelluläre Signaltransduktion in GC bestimmt werden.

epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) ist nicht nur ein physiologischer Prozess während der embryonalen Entwicklung oder Geweberegeneration, sondern auch ein Element in pathologischen Krebsprogression, an denen Tumormetastasierung, Apoptose und Seneszenz Resistenz [13] - [15]. EMT zeigt immer eine schlechte klinische Prognose bei Krebserkrankungen des Menschen. Eine Anzahl von Mechanismen relevant Initiations EMT wurden dokumentiert, einschließlich der TGF-β, IL-6, PI3K /AKT, RAF /MAPK und SRC Wege [15] - [18]. In unserer früheren Studie beobachteten wir CEACAM6-induzierte Aktivierung SRC in GC-Zellen [12] und beobachtet eine erhöhte Anzahl von CEACAM6-überexprimierenden Zellen spindelförmige verglichen mit Kontrollzellen. Daher waren wir die Beziehung zwischen CEACAM6 und EMT bei der Bestimmung in GC-Zellen sehr interessiert. Obwohl negative Korrelation zwischen CEACAM6 und EMT wurde in Pankreaskarzinome [19], die Mechanismen, durch die aufgezeichnete CEACAM6 EMT reguliert werden kaum verstanden.

In dieser Studie untersuchten wir die Effekte und mögliche Wege der CEACAM6 in GC Invasion und Metastasierung, und untersuchte ihre Korrelation mit EMT.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Eine schriftliche Einverständniserklärung der Studie wurde von allen Teilnehmern erhalten. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine zugelassen. Tierverfahren wurden nach einem von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China genehmigten Protokoll durchgeführt.

Die Zelllinien und Gewebeproben

Der Mensch GC-Zelllinien SGC-7901, MKN-45 und MKN-28 wurden aus Shanghai Institutes for Biological Sciences, chinesische Akademie der Wissenschaften erworben. Die Zellen wurden bei 37 ° C in 5% CO _{2 und Sättigungsfeuchte in RPMI-1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthält.}

Gastric Tumor und benachbarten nicht-tumorösen Gewebe wurden von 93 Patienten erhalten, mit GC, die von 2010 bis 2013 die Patienten eine kurative Operation an der Shanghai Jiaotong University School of Medicine Affiliated Ruijin Krankenhaus unterzog bestand aus 69 Männern und 24 Frauen mit einem mittleren Alter von 62,1 Jahren (Bereich 30-85 Jahre). Keiner der Patienten hatte eine Strahlentherapie oder eine Chemotherapie vor der Operation erhalten. Clinicopathological Daten wurden gesammelt und pathologischen Tumorstaging wurde nach der UICC TNM-Klassifikation bestimmt. Histologische Typisierung wurde von mindestens zwei Sachverständigen Pathologen durchgeführt unabhängig in einer doppelblinden Mode arbeiten. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Shanghai Ruijin Krankenhaus genehmigt und alle Patienten wurden in vollem Umfang von den experimentellen Verfahren informiert.

Vector Konstruktion und Transfektion

in voller Länge CEACAM6 cDNA durch RT- erhalten wurde PCR aus insgesamt von GC-Proben extrahiert RNA. Die Primer-Sequenzen waren 5'-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 '(vorwärts) und 5'-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3' (rückwärts). Wir bauten ein plRES2-eGFP-CEACAM6 durch Einfügen CEACAM6 cDNA in den Vektor plRES2-eGFP konstruieren. Wir transfizierten nächsten plRES2-eGFP-CEACAM6 oder plRES2-eGFP Vektor in SGC-7901 und MKN-45-Zellen unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Stabile Klone wurden durch eine kontinuierliche Behandlung mit G418 (1,2 mg /ml; Gibco, New York, USA)

Lentivirale Vektorkonstruktion

Auf der Grundlage von menschlichen CEACAM6 Gendaten, ein Paar von Oligonukleotid-Sequenzen. und negative Kontrollsequenzen wurden entwickelt und synthetisiert von Shanghai Novobio Scientific Co., Ltd. shRNA Sequenzen waren wie folgt: CEACAM6, 5'-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 '(vorwärts) und 5'-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3' (rückwärts); Steuerung, 5'-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 '(vorwärts) und 5'-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3' (rückwärts). CEACAM6 shRNA wurde in PL /shRNA /F lentiviralen Vektor subkloniert PL /shRNA /SHR-CEACAM6 Konstrukt zu erhalten. Dann pL /shRNA /SHR-CEACAM6 oder lentiviralen Vektoren steuern wurden in MKN-28 GC-Zellen transfiziert. Stabil transfizierte Zellen wurden durch Behandlung mit 5 ug /ml Blasticidin ausgewählt und wurden zur Identifizierung und weitere Forschung.

Western-Blot

Die Zellen wurden geerntet und lysiert mit RIPA-Puffer (Solarbio, Beijing, China ) mit 1% PMSF Proteaseinhibitoren. Ein BCA-Assay-Kit (Pierce, Rockford, USA) wurde verwendet, um die Gesamtproteinkonzentration zu messen. Äquivalente Mengen an Protein wurden durch 10% SDS-PAGE getrennt und die Proteine ​​gelöst auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden für 2 h mit 5% Magermilch blockiert und dann mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Primäre Antikörper waren wie folgt: CEACAM6 (1:500; Abcam, USA), E-Cadherin (1:500; Cell Signaling Technology (CST), USA), N-Cadherin (1:500; CST, USA), Vimentin ( 1:1000; CST, USA), Slug (1:500; CST, USA), p-AKT (Ser473) (1:1000; CST, USA), insgesamt AKT (1:1000; CST, USA) und GAPDH ( 1:10000; Abcam, USA). Membranen wurden dann mit sekundärem Antikörper für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und wurden mit einem verstärkten Chemilumineszenz-Detektionssystem (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers sichtbar gemacht.

Immunfluoreszenzfärbung

Die Zellen wurden auf Deckgläsern für 24 h und dann mit 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten fixiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann permeabilisiert mit 0,5% Triton X-100 für 20 min und 30 min bei Raumtemperatur mit 5% BSA blockiert. Wir gefärbt neben der Zellen mit CEACAM6 Antikörper (01.50; Abcam) bei 37 ° C für 2 h, gefolgt von einer Inkubation mit fluoreszierenden sekundären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur. Die Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Rhodamin-Phalloidin-Antikörper (1:150; Cytoskeleton) wurde verwendet, um das Zytoskelett der GC-Zellen sichtbar zu machen. Die Objektträger wurden auf einem Fluoreszenzmikroskop analysiert und abgebildet.

Immunhistochemie

Sektionen von 4 um dicke aus in Paraffin eingebettete Gewebeblöcke geschnitten und dann entparaffiniert und rehydratisiert. Immunhistochemische Färbung von Schnitten wurde gemäß dem Protokoll durchgeführt DAKO, Maus anti-CEACAM6 (1:100; Abcam) und E-Cadherin (1:100; CST) bei 4 ° C über Nacht. Die Objektträger wurden dann mit HRP-markierten sekundären Antikörper und sichtbar gemacht durch Diaminobenzidin inkubiert. Zwei Pathologen, die auf alle Patientendaten geblendet wurden unabhängig voneinander bewertet und erzielte in den Abschnitten. Immunhistochemie Fleck Score = positive Zellzahl + Anfärbungsintensität Score. Der Prozentsatz der positiven Zellen wurde wie folgt bewertet: 0 (10%), 1 (10-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) und 4 (> 75%). Immunhistochemische Färbung Intensität abgestuft wurde wie folgt bewertet: 0 (keine Färbung), 1 (schwache Färbung), 2 (braun-Färbung) und 3 (dunkelbraune Färbung). Insgesamt Noten von ≥3 wurden als positiv definiert die Datenanalyse zu vereinfachen. Um die Korrelation zwischen CEACAM6 und E-Cadherin-Expression, Image-Pro Plus-Version 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) analysiert wurde verwendet, um die Expression von CEACAM6 und E-Cadherin auf 20 Proben zu quantifizieren.

Gelatin Zymographie

MMP-9-Aktivität zu untersuchen, wurde Zymographie durchgeführt 10% SDS-PAGE-Gelen unter Verwendung von mit 1 mg /ml Gelatine (Sigma). Kurz gesagt wurden gezüchtete GC-Zellen in serumfreiem RPMI-1640-Medium für 24 h und der Überstand wurde dann bei 1000 Upm für 5 min gesammelt und zentrifugiert. Die Gele wurden zweimal in Renaturierungspuffer (2,5% Triton X-100) gewaschen, für 30 Minuten jedes Mal SDS zu entfernen, nach der Elektrophorese und dann bei 37 ° C für 24 h in einem Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, inkubiert 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl). Wir gefärbt als nächstes die Gele mit 0,5% Coomassie-Brillantblau R-250 für 2 h und entfärbt die Gele in Puffer (30% Methanol, 10% Essigsäure). Klare transparente Bänder im Hintergrund der Blaufärbung vertraten die Gelatinase-Aktivitäten.

Die Zellmigration und Invasion Assays

Für die Zellmigration und Invasion Assays, insgesamt 1 x 10 ^{5 Zellen waren in serumfreiem RPMI-1640 suspendiert, mit oder ohne MMP-9-Antikörper (Abcam, 2 ug /200 ul) und in Transwell Kammern (8 &mgr; m für 24-Well-Platte; Corning Costar, NY, USA) überzogen mit oder ohne Matrigel ( BD Bioscience, CA, USA) nach den Protokollen des Herstellers. Für beide Assays Medium, enthaltend 10% FBS in die untere Kammer als chemoattractant zugegeben. Nach 24 h Kultur wurden die Zellen mit 10% Formalin und gefärbt mit 0,5% Kristallviolett fixiert. Schließlich Zellen in der unteren Kammer wurden durch Umkehrmikroskopie fotografiert und gezählt.}

Nude Maus Xenograftmodell

Vier-Wochen alten männlichen Balb /c Nacktmäuse (Institut für Zoologie, China Academy of Sciences) wurden verwendet, um die Rolle der CEACAM6 bei der Peritonealdialyse Verbreitung in
vivo
zu bewerten. Nacktmäuse wurden an einem spezifischen Pathogen-freie Umgebung in der Animal Laboratory Unit School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, China untergebracht. Die Mäuse erhielten humane Pflege und die Studienprotokolle wurden nach einem Protokoll genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China. Insgesamt 2 x 10 ^{6 SGC-7901-CEACAM6 oder SGC-7901-NC-Zellen wurden in fünf Mäuse Bauchhöhle jeder Gruppe (Randomisierung) injiziert. Die Mäuse wurden am 30. Tag nach der Injektion eingeschläfert, und die abdominale Massen wurden abgebildet und fotografiert. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den offiziellen Empfehlungen der chinesischen Tiergemeinschaft durchgeführt.}

Statistik

Student t
-Test verwendet wurde, um die statistischen Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu untersuchen . Die Korrelationen zwischen E-Cadherin-Expression in GC Geweben und klinischen Parametern und CEACAM6 Expression wurden durch Chi-Quadrat oder Fisher-Tests oder Pearson-Korrelationskoeffizient-Analyse analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. P
< 0,05 und P
. ≪ 0,01 wurde als statistisch signifikant angesehen und hoch signifikant bzw.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Rabex-5 ist nach oben reguliert und spielt eine onkogene Rolle in Magenkrebs Entwicklung durch die Aktivierung des VEGF-Signal Pathway
• PLoS ONE: Ist Frühe orale Ernährung nach Magenkrebs Chirurgie Machbar? Eine systematische Übersicht und Meta-Analyse von randomisierten kontrollierten Trials