PLoS ONE: MUC4 og MUC1 Expression i Adenokarsinom i magen korrelerer med Vessel Invasion og lymfeknutemetastase: En Immunhistokjemisk Study of Early Gastric Cancer

Abstract

Vi har tidligere rapportert at MUC4 uttrykk er et dårlig prognostisk faktor i ulike karsinomer. Vår tidligere studie viste også at MUC1 uttrykk i mage kreft, inkludert de tidlige og avanserte stadier er et dårlig prognostisk faktor. I denne studien ble uttrykket profiler av MUC4 og MUC1 undersøkt av immunhistokjemi (IHC) ved hjelp av to anti-MUC4 monoklonale antistoffer (MAbs), 8G7 og 1G8, og anti-MUC1 MAb DF3 i 104 gastrektomi eksemplarer av tidlig adenokarsinom i ventrikkel med submucosal invasjon (pT1b2), inkludert 197 histologiske subtype lesjoner. Før IHC studiet av de humane prøvene, evaluerte vi spesifisiteten av de to MAb ved hjelp av Western blotting og IHC av to MUC4 mRNA som uttrykker gastrisk cancer-cellelinjer. MAb 8G7 omsatt klart, mens MAb 1G8 ikke viste noen reaktivitet, i enten Western blotting eller IHC. I IHC av mage kreft, uttrykket priser av MUC4 /8G7 oppdaget av MAb 8G7, MUC4 /1G8 oppdaget av MAb 1G8 og MUC1 /DF3 oppdages av MAb DF3 på godt differensierte typer (70%, 38/54, 67%, 36/54, 52%, 28/54) var signifikant høyere enn de i dårlig differensierte typer (18%, 10/55, 36%, 20/55, 13%, 7/55) ( P
< 0,0001; P
= 0,0021; P
< 0,0001), henholdsvis. Den MUC4 /8G7 uttrykk var relatert med lymfatisk invasjon (r = 0,304, P
= 0,033). På den annen side ble det MUC4 /1G8 uttrykk relatert med lymfatisk invasjon (r = 0,395, P
= 0,001) og lymfeknutemetastase (r = 0,296, P
= 0,045). Den MUC1 /DF3 uttrykk var relatert med lymfatisk invasjon (r = 0,357, P
= 0,032) og venøs invasjon (r = 0,377, P
= 0,024). I konklusjonen, er det uttrykk for MUC4 samt MUC1 tidlig mage kreft en nyttig markør for å forutsi dårlige prognostiske faktorer knyttet til fartøy invasjon

Citation. Tamura Y, Higashi M, Kitamoto S, Yokoyama S, Osako M, M Horinouchi et al. (2012) MUC4 og MUC1 Expression i Adenokarsinom i magen korrelerer med Vessel Invasion og lymfeknutemetastase: En Immunhistokjemisk Study of Early Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49251. doi: 10,1371 /journal.pone.0049251

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

mottatt: 17 august 2012; Godkjent: 05.10.2012; Publisert: 13.11.2012

Copyright: © 2012 Tamura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Princes Takamatsu Cancer Research Fund til S. Yonezawa; Grants-i-Aid for Scientific Research på Scientific Research (B) 23390085 til S. Yonezawa; Scientific Research (C) 21590399 M. Higashi; Unge Forskere (B) 24701008 til S. Yokoyama; Scientific Research på Prioriterte områder 239349 til S. Kitamoto (JSP Fellowship) fra departementet for utdanning, vitenskap, sport, kultur og teknologi, Japan; en Foundation Pancreas Forskning fra Japan til S. Yokoyama; og Kodama Memorial Foundation, Japan til M. Higashi. S. Batra støttes delvis av National Institutes of Health tilskudd (CA78590, CA163120, CA133944 og CA111294). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt om arbeidet i studien

Innledning

Magekreft er den fjerde vanligste kreftformen i verden og mer enn 90% av mage kreft er adenokarsinomer [1]. Nylig, i Japan, har tidlig deteksjon av rutinen endoskopisk undersøkelse i gastroenterologi klinikker resulterte nøyaktige diagnoser og effektive kirurgiske eller endoskopiske behandlinger, noe som resulterer i en relativt bedre prognose. I analysen av 11,261 pasienter med magekreft behandlet av mage reseksjon, TNM 5-års overlevelse for stadium IA var 91,8% og for scene IB overlevelse var 84,6% [2]. For tidlig mage kreft, en endoskopisk submucosal disseksjon (ESD) er førstevalget behandling i Japan, men kriteriene for ytterligere kirurgi inkludert lymfeknute disseksjon etter ESD er fortsatt kontroversielt [3].

Vår serie av immunhistokjemi (IHC) studier for mucin-ekspresjon i forskjellige humane neoplasmer har vist at ekspresjonen av MUC1 mucin (pan-epitelial membran-assosiert mucin) er beslektet med invasiv spredning av svulster og dårlig resultat av pasientene, mens ekspresjonen av den MUC2 mucin (tarmtypen sekretoriske mucin) er beslektet med den ikke-invasiv spredning av svulster og et positivt resultat for pasienter [4], [5]. Vår tidligere studie viste at MUC1 uttrykk i mage kreft er en dårlig prognostisk faktor [6].

MUC4 ble først rapportert som tracheobronchial mucin [7] og er en membran-assosiert mucin [8]. I vår studie serien, uttrykk for MUC4 i intrahepatisk kolangiokarsinom, bukspyttkjertel ductal adenokarsinom, ekstrahepatiske gallegang kreft, lunge adenokarsinom og muntlig plateepitelkarsinom var en selvstendig faktor for dårlig prognose og er en nyttig markør for å forutsi utfallet av pasientene [ ,,,0],5], [9], [10], [11], [12], [13]. Dessverre, er det få studier av MUC4 ekspresjonsprofilen i human magekreft. I denne studien undersøkte vi uttrykket profiler av MUC4 samt MUC1 i tidlige magekreft vev, og funnet ut at MUC4 og MUC1 uttrykk i tidlig mage kreft skulle bli dårlige prognostiske faktorer ved lymfe fartøy invasjon, blodkar invasjon og lymfeknute metastase.

Som anti-MUC4 monoklonale antistoffer (MAbs), 8G7 og 1G8, er kjent for å oppdage ulike områder av MUC4 molekyl. MAb 8G7 gjenkjenner en tandemrepetisjonssekvensen (STGDTTPLPVTDTSSV) av det humane MUC4α-underenheten [14]. MAb 1G8 er dannet mot rotte-sekvensen (rotte ASGP-2), og gjenkjenner en epitop på rotte ASGP-2-subenhet, noe som tilsvarer den menneskelige MUC4β subenhet, og viser et kryss reaktivitet med humane prøver [15]. Dermed ble en spesiell oppmerksomhet til sammenligning av to anti-MUC4 MAbs ved Western blotting og IHC av to mage kreft cellelinjer, før IHC studiet av menneskelige mage kreft vev. Dessuten, siden det er uenighet om den prognostiske betydningen av disse anti-MUC4 MAbs, en litteraturgjennomgang av MUC4 uttrykk i ulike krefttyper ble også utført.

Materialer og metoder

Pasienter og vevsprøver

gastrektomi eksemplarer av 104 tidlig mage kreft, som viser submucosal invasjon, pT1b2, med eller uten lymfeknutemetastaser, ble hentet fra filen mellom 1994 og 2008 av Kagoshima-shi Medical Association Hospital. Gjennomsnittsalderen for pasientene var 65,7 (standardavvik, 9.8, rekkevidde, 39-92 år, median alder 66 år); 64 tilfeller var menn, og 40 tilfeller var kvinner. Denne studien ble gjennomført i samsvar med de veiledende prinsippene i Helsinkideklarasjonen, og godkjent av etikkomiteen for Kagoshima-shi Medical Association Hospital (KMAH 2011-02-02). Informert, ble skriftlig samtykke innhentes fra alle pasienter. I tilfellene med mer enn to histologiske typer blandet i en lesjon, ble hver histologiske mønster vurderes uavhengig av hverandre, ifølge det japanske Klassifisering av magekarsinom (JCGC) [16].

Evaluering av monoklonale antistoffer for MUC4

Cells og kulturforhold.

Menneskelige mage kreft cellelinjer (SNU-16 og NCI-N87) og bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (PANC1 og CAPAN1) (Manassas, VA). Begge gastrisk kreft celler ble holdt i RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO); PANC1 celler ble holdt i DMEM (Sigma-Aldrich); Capan1 celler ble holdt i DMEM /F-12 (Sigma-Aldrich). Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (GIBCO, Breda, Nederland) og 100 U /ml penicillin /100 mg /ml streptomycin (Sigma-Aldrich). Alle celler ble inkubert i 5% CO2 ved 37 ° C og holdt ved sub-konfluente nivåer.

RNA-ekstrahering og RT-PCR.

Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og kvantifisert ved Nanodrop ND-1000 spektrofotometer. Den oppnådde mRNA (2UG) ble revers transkribert til cDNA med høy kapasitet RNA til cDNA kit (Applied Biosystems, Foster City, California). De følgende primere ble utformet for den påfølgende PCR: MUC4, 5'- TGGGACGATGCTGACTTCTC-3 ', 5'-CCCCGTTGTTTGTCATCTTTC-3'; ACTB, 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3 ', 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'. PCR ble utført med AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems) etter produsentens protokoll.

Protein utvinning og western blotting.

Totalt cellelysater ble fremstilt ved bruk RIPA buffer som inneholder proteasehemmer cocktail (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Proteinkonsentrasjonen ble målt ved BCA-analyse (Thermo Scientific, Rockford, IL). En lik mengde protein lysat ble løst i 2% agarosegel inneholdende SDS og passivt overført til PVDF-membran over natten ved romtemperatur. Membranene ble blokkert med 1% skummet melk /PBST i løpet av 2 timer og underkastet den standard immundeteksjon prosedyren ved hjelp av spesifikke primære antistoffer. Den primære antistoffer er som følger: anti-human MUC4 MAb 8G7 (1:1000, generert av Dr. Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE) og 1G8 (1:1000, kjøpt fra Invitrogen, Camarillo, CA), og et anti-human-tubulin MAb DM1A (1:2,000, Sigma-Aldrich).

Immunocytochemistry for dyrkede celler.

for MUC4 farging i dyrkede celler, celler ble sådd i 8-kammer lysbilder (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) og inkuberes i natten. Celler ble fiksert med 3,7% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og farget med MAb 8G7 (1:24,000) og Mab 1G8 (1:4,000) over natten ved 4 ° C, respektivt. Signal deteksjon ble utført av en immunoperoxidase metode med en Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.

Immunhistokjemi for menneskelig vev

IHC for menneskelig gastrisk karsinom ble utført ved anvendelse av følgende antistoffer i de maksimale snittavsnitt i hver tumor. MUC4 ble oppdaget av to MAbs, 8G7 og 1G8. For sammenlignende studien ble MUC1 uttrykk også undersøkt av MAb DF3 (mus IgG, TFB, Tokyo, Japan). IHC ble utført ved immunperoksydase fremgangsmåten som følger. Antigen henting ble utført ved hjelp CC1 antigen gjenfinning buffer (pH 8,5 EDTA, 10 037 ° C, 30 min., Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) for alle seksjonene. Etter inkubering med de primære antistoffer (MAb MUC4 /8G7 fortynnet 1:3000, 37 ° C, 32 min .; MAb MUC4 /1G8 fortynnet 1:500, 37 ° C, 24 min .; MAb MUC1 /DF3 fortynnet 1:50, 37 ° C, 32 min.) i fosfatbufret saltvann pH 7,4 (PBS) med 1% bovint serumalbumin, seksjonene ble farget på en Benchmark XT automatisert lysbilde Stainer bruker en diaminobenzidin deteksjon kit (Ultra DAB, Ventana Medical Systems). For enkelhets skyld er MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 brukes til å indikere mucin antigener oppdaget av hvert antistoff.

Scoring av resultatene og statistisk analyse.

Fire blindet etterforskere ( YT, MH, MG og SY) evaluert IHC flekker data uavhengig av hverandre. Når evalueringen skilte mellom de fire, ble en endelig avgjørelse fattes ved konsensus. Resultatene ble evaluert basert på prosentandelen av positivt fargede carcinoma celler, og den prosentvise data ble kategorisert i seks karakterer med følgende poengsystem: negativ, ingen av carcinoma celler farget; svak, mindre enn 5% av carcinoma celler farget; 1+, til ≥5% < 25%; 2+, til ≥25% < 50%; 3+, til ≥50% < 75%; og 4+: ≥75% farget. Saker med ≥5% av carcinoma celler farget ble vurdert positivt. Statistisk analyse ble utført av parametriske metoder ved hjelp av Excel-statistikk Ver.3 programvare generert av Hisae Yanai, Fakultet for naturvitenskap, Saitama University (OMS Publishing, Japan).

Survival of pasientene ble sammenlignet mellom gruppen med positive MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 eller MUC1 /DF3 uttrykk og gruppen med negative uttrykk ifølge Kaplan-Meier-metoden, og forskjeller mellom overlevelseskurver ble testet ved hjelp av log-rank test. En sannsynligheten for P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant

Resultater

Evaluering av to monoklonale antistoffer for MUC4

For å undersøke forskjellen i antistoff spesifisitet mellom 8G7 og 1G8, vi. utført RT-PCR, Western blotting og IHC analyse ved hjelp av to mage kreft cellelinjer, SNU-16 og NCI-N87 celler. Den MUC4 mRNA ble påvist i de to magecancercellelinjer (Fig. 1A). I samsvar med forrige rapport [14], våre data viste at 8G7 anerkjent en meget høy molekylvekt protein (over 500 kD, som var forventet størrelse for native MUC4). Tvert imot, ikke 1G8 ikke viser noen immunoreaktive bånd (Fig. 1B). Det samme resultatet ble observert i IHC-analyse (fig. 1C).

immunhistokjemisk farging av gastrektomi Prøver

Immunohistokjemisk farging av ikke-neoplastisk gastrisk mucosa.

I den ikke -neoplastic slimhinnene i tilfeller med magekreft, ble MUC4 /8G7 uttrykt noen ganger i cytoplasma av overflaten slimete epitel, og ofte, men svakt i cytoplasma av fundus og pylorusstenose kjertler (figur S1 A og D). MUC4 /1G8 ofte ble uttrykt i cellen apex og cytoplasma av overflaten slimete epitel, og ofte, men svakt i cytoplasma av fundus og pyloric kjertler (figur S1 B og E), og ble sett konstant på det vaskulære endotel. MUC1 /DF3 ble av og til uttrykt i overflaten slimete epitel, og alltid i fundus-kjertler (særlig intenst ved celle spissene), men ikke i pylorus kjertler (fig S1 C og F).

Immunohistokjemisk farging av adenokarsinom i ventrikkel.

Vi undersøkte gastrektomi eksemplarer av 104 tidlig mage kreft (pT1b2), siden vi ønsket å unngå de store degenerative forandringer som er ofte sett i avanserte kreft vev, og for å justere scenen for nøyaktig sammenligning mellom IHC funn og de clinicopathologic faktorer.

Når flere enn to histologiske typer ble blandet i en lesjon i gastrektomi prøver av 104 tidlige gastriske cancere, ble hver histologisk mønster bedømt uavhengig av hverandre, i henhold til JCGC [16]. Derfor, i de 104 gastrektomi prøver, kan vi vurdere 197 carcinoma foci av ulike histologiske typer totalt.

Blant de 197 lesjoner var det 15 lesjoner av papillær adenokarsinom (PAP) (fig. 2A-D), 39 av godt differensiert rørformet adenokarsinom (tub1) (fig. 2E-H), 52 av moderat differensierte rørformet adenokarsinom (tub2) (fig. 2I-L), seks av mucinkjertler karsinomer (fRA) (fig. 2 M-P), 8 av solid typen dårlig differensiert adenokarsinom (por1) (fig. 2Q-T), 47 av ikke-solid typen dårlig differensiert adenokarsinom (por2) (fig. 2U-X) og 30 av signet-ring cellekreft (sig) (fig. 2Y-b), basert på konteksten av felles histologisk klassifisering av magekreft i JCGC [16]. Ifølge sammenheng i WHO klassifisering av svulster i magen [17] samt at i JCGC [16], pap og tub1 ble klassifisert i "godt differensiert adenokarsinom", og por1 og por2 ble klassifisert som "dårlig differensiert adenokarsinom ". Dataene til uttrykk frekvensen av MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 ble oppsummert i figur 3. Den detaljerte tall og i prosent av positivt farget neoplastiske celler ved hjelp poengsystemet ble oppsummert i tabell S1.

Expression profilen til MUC4 /8G7.

Blant de 197 adenokarsinom lesjonene ble MUC4 /8G7 uttrykt i 83 lesjoner (42%). MUC4 /8G7 viste en betydelig høyere rate av positive uttrykk (≥5% av carcinoma celler farget) i godt differensierte typer (pap + tub1: 70%, 38/54) enn i dårlig differensierte typer (por1 + por2: 18% , 10/55) ( P
< 0,0001) (fig 3A, piler).. MUC4 /8G7 ble uttrykt hovedsakelig i cytoplasma i de neoplastiske cellene pap (Fig. 2B), tub1 (Fig. 2F) og tub2 (Fig. 2J), i tilfeller med positive uttrykk.

Expression profil av MUC4 /1G8.

Blant de 197 adenokarsinom lesjonene ble MUC4 /1G8 uttrykt i 95 lesjoner (48%). MUC4 /1G8 viste signifikant høyere forekomst av den positive uttrykk i godt differensierte typer (pap + tub1: 67%, 36/54) enn i dårlig differensierte typer (por1 + por2: 36%, 20/55) ( P
= 0,0021) (fig. 3B, piler). MUC4 /1G8 ble uttrykt i hovedsak på celle hjørnene av pap (Fig. 2C), tub1 (fig. 2G) og tub2 (Fig. 2K), eller i intracytoplasmatisk mucin substansen i sig (Fig. 2a), i tilfeller med positivt uttrykk.

Expression profilen til MUC1 /DF3.

Blant de 197 adenokarsinom lesjoner, MUC1 /DF3 ble uttrykt i 62 lesjoner (31%). MUC1 /DF3 viste signifikant høyere forekomst av den positive uttrykk i godt differensierte typer (PAP + tub1: 52%, 28/54) enn i dårlig differensierte typer (por1 + por2: 13%, 7/55) ( P
< 0,0001) (figur 3C, piler).. MUC1 /DF3 ble uttrykt i hovedsak på celle hjørnene av pap tub1 og tub2 (Fig. 2L), i tilfeller med positive uttrykk.

Sammenligning av slimstoffekspresjon i hvert histologisk type.

i tub1, ekspresjonshastigheter av MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 var betydelig høyere enn for MUC1 /DF3 ( P
= 0,0106 og P
= 0,039, henholdsvis) (fig. 3, *1). I por2 uttrykket frekvensen av MUC4 /1G8 var betydelig høyere enn for MUC4 /8G7 ( P
= 0,0286), eller som av MUC1 /DF3 ( P
= 0,0005) (fig. 3, * 2). I sig, uttrykk frekvensen av MUC4 /1G8 var betydelig høyere enn for MUC4 /8G7 ( P
= 0,0158), eller som av MUC1 /DF3 (sig, P
= 0,0019) (fig . 3, * 3). I de andre histolgical typer (pap, tub2, muc og por1), var det ingen signifikant forskjell i uttrykket priser blant MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 (Fig. 3).

Forholdet mellom MUC4 eller MUC1 ekspresjon og lymfe fartøy invasjon, blodkar invasjon og lymfeknutemetastase.

semikvantitativ evaluering av lymfatisk invasjon (ly), venøs invasjon (v) og lymfeknutemetastase status (N) er definert i den JCGC [16]. Lymfatisk invasjon (ly) ble evaluert som følger; ly0, ingen lymfatisk invasjon; LY1 minimal lymfatisk invasjon; ly2, moderat lymfatisk invasjon; og ly3, merket lymfatisk invasjon. For det venøse invasjon (v), tilsvarende vurdering (v0 til v3) ble gjort ved hjelp av elastiske farging (Victoria-Blue) som ble tilsatt til hematoxylin-eosin-farging. Det totale antall lymfeknuter og antallet involverte lymfeknuter ved hver nodestasjon (N) ble registrert som følger; N0, ingen regional lymfeknutemetastase; N1, metastase i 1-2 regionale lymfeknuter; og N2, metastase i 3-6 regionale lymfeknuter. Regional lymfeknute metastaser ble observert hos 55 pasienter (N1, 41 tilfeller, N2, 14 tilfeller). Det var ingen signifikant korrelasjon mellom de histologiske typer og lymfatisk invasjon, venøs invasjon eller lymfeknutemetastase status.

I hvert fall den høyeste poengsummen av de seks IHC karakterer (negativ, svak, 1+, 2+, 3+ eller 4+) i de ulike histologiske typer ble regnet som IHC score i hver enkelt, for eksempel "IHC poengsum 4+" for en sak med [tub1 score, 3+; tub2 score, 4+]. Vi har evaluert sammenhengen mellom IHC poengsum og ly, v og N faktorer i hver enkelt pasient. Som vist i tabell 1, ble det MUC4 /8G7 uttrykk relatert med lymfatisk invasjon (r = 0,304, P
= 0,033). Den MUC4 /1G8 uttrykk var relatert med lymfatisk invasjon (r = 0,395, P
= 0,001) og lymfeknutemetastase (r = 0,296, P
= 0,045). Den MUC1 /DF3 uttrykk var relatert med lymfatisk invasjon (r = 0,357, P
= 0,032) og venøs invasjon (r = 0,377, P
= 0,024).

Videre undersøkte vi sammenhengen mellom IHC score til MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3. Som vist i tabell 2, var det en sammenheng mellom MUC4 /8G7 poengsum og MUC4 /1G8 score (r = 0,486, P
< 0,0001). I kontrast, var det ingen sammenheng mellom MUC4 /8G7 poengsum og MUC1 /DF3 score (r = 0,267, P
= 0,202), og det var ingen sammenheng mellom MUC4 /1G8 poengsum og MUC1 /DF3 score (r = 0,245, P
= 0,269).

Forholdet mellom MUC4 eller MUC1 uttrykk og overlevelse.

Blant de 104 pasientene, oppfølging data ble innhentet for 87 pasienter. Median oppfølgingstid var 47,5 måneder (range, 0-193 måneder). I de 87 pasientene, en pasient døde av magekreft 39 måneder etter operasjonen, en pasient viste levermetastaser, men overlevde i 78 måneder, og to pasienter døde av andre sykdommer. I 85 pasienter med unntak av to pasienter døde av andre sykdommer, Kaplan-Meier estimatet ble testet ved hjelp av log-rank test. Mellom den positive gruppen og negative gruppen (MUC4 /8G7 + vs -, MUC4 /1G8 + vs - eller MUC1 /DF3 + vs -), log-rank test for total overlevelse (MUC4 /8G7, P = 0,27; MUC4 /1G8, P = 0,37; MUC1 /DF3, P = 0,22) og progresjonsfri overlevelse (MUC4 /8G7, P = 0,85; MUC4 /1G8, P = 0,23; MUC1 /DF3, P = 0,83) viste ingen signifikante forskjeller. Videre analyse av 42 pasienter overlevde i mer enn 5 år viste heller ingen signifikante forskjeller.

Diskusjoner

Nylig, vi har rapportert at uttrykket av MUC4 er en uavhengig dårlig prognostisk faktor på pancreatobiliary adenokarsinomer [ ,,,0],10], [11], [12] samt lunge adenokarsinom [13] og muntlig plateepitelkarsinom [9]. MUC1 har også blitt rapportert å være et dårlig prognostisk faktor i forskjellige humane svulster [4], [5]. Vår tidligere studie i mage kreft, inkludert både tidlig kreft og avanserte kreftformer viste at MUC1 er en nyttig prognostisk faktor for dårlig utfall hos pasienter [6]. I den foreliggende undersøkelse, kan forholdet mellom mucin ekspresjon og pasientens resultatet ikke bli vurdert, fordi mage kreft er i tidlig stadium ved pT1b2 og de fleste av pasientene hatt et positivt resultat. Likevel ble følgende resultater oppnådd: (1) Den MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 uttrykk var relatert med lymfatisk invasjon. (2) MUC4 /1G8 uttrykk var relatert med lymfeknutemetastase. (3) MU1 /DF3 uttrykk var relatert med venøs invasjon. I Japan, er ESD det første valget behandling av tidlig magekreft [3]. Undersøkelse av MUC4 samt MUC1 i ESD prøver kan avklare om ytterligere kirurgi, inkludert lymfeknute disseksjon eller hyppig oppfølging for metastasering er nødvendig.

Våre tidligere studier har vist at det ikke var noen siginificant sammenheng mellom MUC4 uttrykk og MUC1 uttrykk [10], [11], [12], [13]. Også i denne studien av mage kreft i tidlig stadium, var det ingen siginificant sammenheng mellom uttrykk for MUC4 og MUC1. Både MUC4 og MUC1 ekspresjon i magekreftformer kan ha sammenheng med dårlig prognostiske faktorer, slik som lymfatisk invasjon, venøs invasjon og lymfeknutemetastase, ved hjelp av forskjellig mekanisme.

I den tidligere studie av magekreftformer ved å bruke MAb 8G7, Senapati et al. viste at MUC4 /8G7 uttrykk ikke var assosiert med tumortypen, scene eller med graden av differensiering [18]. Interessant, deres resultater viste en 42% uttrykk sats i den fasen jeg kreft (n = 19), som er i samsvar med våre data (MUC4 /8G7: 42% og MUC4 /1G8: 48%) i denne studien undersøker stadium I kreft (n = 104). Men vår studie viste at både MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 uttrykk var annerledes blant de histologiske typer, og var betydelig høyere i godt differensierte typer enn i dårlig differensiert type. MUC1 /DF3 uttrykk var også betydelig høyere i godt differensierte typer enn i dårlig differensiert type. Vi rapporterte at MUC1 uttrykk var høy i brønnen differensiert adenokarsinom i mage kreft inkludert avanserte kreftformer, og den høye MUC1 uttrykk kan påvirke overlevelsen av pasienter med høyt differensiert adenokarsinom i magen [6]. Den høye uttrykk for MUC4 i brønnen differensiert adenokarsinom kan også påvirke overlevelsen av pasienter med magekreft. I vår forrige undersøkelse [6], frekvensen av høy uttrykk for MUC1 /DF3 var betydelig høyere i de avanserte mage kreft enn at i de tidlige mage kreft. Forholdet mellom MUC4 uttrykk med invasjonen av mage kreft ville være et interessant område av studien.

Det er uenighet om den prognostiske betydningen av MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 uttrykk. Derfor har vi anmeldt 19 artikler av MUC4 IHC studien søkte forskjellige humane kreft vev (Tabell 3). Betydningen av MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 kunne ikke bli evaluert i åtte av de 19 studiene. En undersøkelse ved hjelp av polyklonalt anti-MIUC4 antistoff rapportert at MUC4 ekspresjon er relatert til en fovorabel utfall [19], tre studier viser ingen korrelasjon mellom MUC4 ekspresjon og prognose [20], [21], [22], de andre tre studiene ikke har noen kommentarer på sammenhengen mellom MUC4 uttrykk og prognose [18], [23], [24], og de resterende en studie av skjoldbruskkjertelkreft rapporterte ingen MUC4 uttrykk i kreft [25]. På den annen side, i de andre 11 artikler, var det en tydelig forskjell i prognostisk signifikans mellom MUC4 /8G7 uttrykk og MUC4 /1G8 uttrykk. De fleste studier som bruker 8G7, som ble generert mot humant MUC4 er MUC4 /8G7 uttrykk knyttet til aggressiv svulst atferd eller et dårlig resultat i menneskelige karsinom [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],26]. I kontrast til de fleste studier med 1G8, som ble dannet mot rotte-ASGP-2, som er beskrevet som MUC4 /1G8 uttrykk er relatert til en gunstig utfall [27], [28], [29], [30], selv om en undersøkelse av pankreas adenokarsinom beskrevet som MUC4 /1G8 uttrykk er relatert til dårlig overlevelse [31]. Denne klare forskjellen reiser spørsmålet om 8G7 og 1G8 ha vesentlig forskjellige tegn. MAb 1G8 ble hevet ved hjelp av rotte Muc4 epitop [15]. Menneskelig MUC4 og rotte Muc4 viser mer enn 60% sekvenslikhet peptidet [32], men de er ikke identiske. Det er bemerkelsesverdig at IHC ved bruk av MAb 1G8 viser alltid positiv farging i det vaskulære endotel, som er noe uvanlig, som uttrykk for MUC4 som er ett av medlemmene av slimstoffer.

således vurderte vi spesifisiteten av MAb 8G7 og MAb 1G8 ved Western blotting og IHC av to mage kreft cellelinjer. Vår Western blot-analyse viste at MAb 8G7 føres et meget høymolekylært protein (over 500 kD, som var den forventede størrelse for native MUC4), mens MAb 1G8 ikke viser immunoreaktive bånd. IHC Analysen viste også MAb 8G7 positiv farging men MAb 1G8 negativ farging i de to magekreft cellelinjer. MUC4 mRNA ble også uttrykt i de to magekreft cellelinjer i denne studien, som vist i forrige undersøkelse analysere bukspyttkjertelkreft cellelinjer ved RT-PCR og Northern blot analyser [33], [34]. Både MAb 8G7 og MAb 1G8 reagerer med menneskelige mage kreft vev, selv om plasseringen av MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 uttrykk viste en markant forskjell. I magekreft vev, ble MUC4 /8G7 uttrykt hovedsakelig i cytoplasma i de neoplastiske cellene pap og badekar, mens MUC4 /1G8 ble uttrykt i hovedsak på celle hjørnene av PAP og badekar eller intracytoplasmatisk mucin substans sig. Siden cytoplasmatiske uttrykk mønster av MUC4 /8G7 er også sett i bukspyttkjertelen adenokarsinom, intrahepatisk kolangiokarsinom, ekstra lever gallegang kreft, lunge adenokarsinom og muntlig plateepitelkarsinom [9], [10], [11], [12], [13 ], kan intracytoplasmatisk MUC4 /8G7 uttrykk mønster i mage kreft vev være rimelig. I motsetning til dette, kan den lineære uttrykk mønster av MUC4 /1G8 sammen med celle spissene av magekreft vev reflektere ukjente funksjoner eller egenskaper ved MUC4β subenheten detektert av MAb 1G8 dannet mot rotte-epitop [15], som den foreliggende studien viste at MUC4 /1G8 uttrykk relatert til lymfatisk invasjon og lymfeknutemetastase som er dårlige prognostiske faktorer selv i tidlig magekreft. Spesielt i por2 og sig uttrykket frekvensen av MUC4 /1G8 var signifikant høyere enn for MUC4 /8G7 eller det av MUC1 /DF3. I tillegg var det en siginificant sammenheng mellom MUC4 /8G7 uttrykk og MUC4 /1G8 uttrykk hos pasientene som ble undersøkt. Således IHC-signal av MUC4 /1G8 påvist i prøvene gastrektomi kan vise en signifikant betydning av epitopen detektert av MAb 1G8, selv om det ikke var noen reaktivitet av MUC4 /1G8-ekspresjon i humane magecancercellelinjer (SNU-16 og NCI- N87). Den epitop oppdaget av MAb 1G8 er et område av interesse for fremtidige studier.

I konklusjonen, i denne studien av tidlig mage kreft, MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 uttrykk ble observert hovedsakelig i godt differensierte adenokarsinomer. Den MUC4 /8G7 uttrykk var relatert med lymfatisk invasjon. Den MUC4 /1G8 uttrykk var relatert med lymfatisk invasjon og lymfeknutemetastase. Den MUC1 /DF3 uttrykk var relatert med lymfatisk invasjon og venøs invasjon. Undersøkelsen av MUC4 og MUC1 uttrykk i mage kreft skulle bli en nyttig markør for å forutsi dårlige prognostiske faktorer knyttet til fartøy invasjon, selv i tidlig stadium.

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
I den ikke-neoplastisk slimhinnene i tilfeller med magekreft, ble MUC4 /8G7 uttrykt noen ganger i cytoplasma av overflaten slimete epitel, og ofte, men svakt i cytoplasma av fundus og pylorusstenose kjertler (A og D). MUC4 /1G8 ofte ble uttrykt i cellen apex og cytoplasma av overflaten slimete epitel, og ofte, men svakt i cytoplasma av fundus og pyloric kjertler (B og E), og ble sett konstant på det vaskulære endotel. MUC1 /DF3 ble av og til uttrykt i overflaten slimete epitel, og alltid i fundus-kjertler (særlig intenst ved celle spissene), men ikke i pylorus kjertler (C og F). Original forstørrelse × 100 (A, B, C), × 400 (D, E, F)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0049251.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
Detaljert antall og prosentandel positivt farget neoplastiske celler ved hjelp av scoring system
doi:. 10,1371 /journal.pone.0049251.s002 plakater (DOC)

Takk

Vi takker Mr. Y. Atsuchi, Mr. K. Matsuo, Ms C. Baba, Ms Y. Nishimura, Frøken S. Yoshimura og Ms I. Houjou for deres teknisk assistanse.

• PLoS ONE: Høye nivåer av aromatiske aminosyrer i magesaft i den tidlige fasen av magekreft Progresjon
• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /Pstl polymorfisme og Gastric Cancer Følsomhets: Meta-analyser Basert på 24 kasus-kontrollstudier