PLoS ONE: MUC4 og MUC1 ekspression i Adenokarcinom i mave korrelerer med Vessel Invasion og lymfeknudemetastase: En immunhistokemisk undersøgelse af Early Gastrisk Cancer

Abstrakt

Vi har tidligere rapporteret, at MUC4 udtryk er en dårlig prognostisk faktor i forskellige carcinomer. Vores tidligere undersøgelse viste også, at MUC1 ekspression i gastrisk kræft, herunder de tidlige og fremskredne stadier er en dårlig prognostisk faktor. I den foreliggende undersøgelse, blev udtrykket profiler af MUC4 og MUC1 undersøgt ved immunhistokemi (IHC) under anvendelse af to anti-MUC4 monoklonale antistoffer (MAB), 8G7 og 1G8 og anti-MUC1 MAb DF3 i 104 gastrektomi enheder af tidlig gastrisk adenocarcinom med submukøst invasion (pT1b2), herunder 197 histologiske subtype læsioner. Før IHC undersøgelse af humane prøver, vi evaluerede specificiteten af ​​de to MAbs ved Western blotting og IHC af to MUC4 mRNA udtrykker gastrisk kræft cellelinjer. MAb 8G7 reagerede tydeligt, hvorimod MAb 1G8 ikke viste nogen reaktivitet, i enten Western blotting eller IHC. I IHC i mavens kræft, udtrykket satser MUC4 /8G7 detekteret af MAb 8G7, MUC4 /1G8 detekteret af MAb 1G8 og MUC1 /DF3 påvist af MAb DF3 i godt differentierede typer (70%, 38/54, 67%, 36/54, 52%, 28/54) var signifikant højere end de i dårligt differentierede typer (18%, 10/55, 36%, 20/55, 13%, 7/55) ( P
< 0,0001; P
= 0,0021; P
< 0,0001), hhv. Den MUC4 /8G7 udtryk var relateret med lymfatisk invasion (r = 0,304, P
= 0,033). På den anden side blev den MUC4 /1G8 ekspression relateret til lymfatisk invasion (r = 0,395, P
= 0,001) og lymfeknudemetastaser (r = 0,296, P
= 0,045). Den MUC1 /DF3 udtryk var relateret med lymfatisk invasion (r = 0,357, P
= 0,032) og venøs invasion (r = 0,377, P
= 0,024). Afslutningsvis ekspressionen af ​​MUC4 samt MUC1 i tidlige gastriske cancere er en nyttig markør til at forudsige dårlige prognostiske faktorer relateret med fartøj invasion

Henvisning:. Tamura Y, Higashi M, Kitamoto S, Yokoyama S, Osako M, Horinouchi M, et al. (2012) MUC4 og MUC1 ekspression i Adenokarcinom i mave korrelerer med Vessel Invasion og lymfeknudemetastase: En immunhistokemisk undersøgelse af Early Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49251. doi: 10,1371 /journal.pone.0049251

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: August 17, 2012; Accepteret: 5 oktober 2012; Udgivet: November 13, 2012 |

Copyright: © 2012 Tamura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af Princes Takamatsu Cancer Research Fund til S. Yonezawa; Tilskud-i-Aid for Videnskabelig Forskning på videnskabelig forskning (B) 23.390.085 til S. Yonezawa; Videnskabelig Forskning (C) 21.590.399 til M. Higashi; Unge Forskere (B) 24701008 til S. Yokoyama; Videnskabelig Forskning i prioriterede områder 239349 til S. Kitamoto (JSP'er Fellowship) fra Ministeriet for Undervisning, Videnskab, Sport, Kultur og Teknologi, Japan; en Pancreas Research Foundation of Japan til S. Yokoyama; og Kodama Mindefond, Japan til M. Higashi. S. Batra understøttes delvist af National Institutes of Health tilskud (CA78590, CA163120, CA133944 og CA111294). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt med hensyn til arbejdet i undersøgelsen

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige cancer verdensplan og mere end 90% af gastriske cancere er adenocarcinomer [1]. For nylig, i Japan, har tidlig påvisning af den rutinemæssige endoskopisk undersøgelse i gastroenterologi klinikker resulteret præcise diagnoser og effektive kirurgiske eller endoskopiske behandlinger, hvilket resulterer i et relativt bedre prognose. I analysen af ​​11,261 patienter med mavekræft behandles af gastrisk resektion, TNM 5-årige overlevelsesrate for fase IA var 91,8% og for fase IB overlevelsesraten var 84,6% [2]. For de tidlige gastriske cancere, en endoskopisk submucosa dissektion (ESD) er det første valg behandling i Japan, men kriterierne for yderligere kirurgi herunder lymfeknude dissektion efter ESD stadig kontroversiel [3].

Vores serie immunhistokemi (IHC) studier for mucin ekspression i forskellige humane neoplasmer har vist, at ekspressionen af ​​MUC1 mucin (pan-epitel membranassocieret mucin) er relateret med invasiv proliferation af tumorer og dårligt resultat af patienterne, mens ekspressionen af den MUC2 mucin (tarm typen sekretorisk mucin) er relateret til ikke-invasiv spredning af tumorer og et positivt resultat for patienterne [4], [5]. Vores tidligere undersøgelse viste, at MUC1 ekspression i gastriske cancere er en dårlig prognostisk faktor [6].

MUC4 blev først rapporteret som tracheobronchial mucin [7] og er en membran-associeret mucin [8]. I vores undersøgelse serie, ekspressionen af ​​MUC4 i intrahepatisk cholangiocarcinom, pancreatisk duktalt adenokarcinom, ekstrahepatisk galdegang carcinom, lunge adenocarcinom, og mundtlige pladecellecarcinom var en uafhængig faktor for dårlig prognose og er en nyttig markør til at forudsige resultatet af patienterne [ ,,,0],5], [9], [10], [11], [12], [13]. Desværre er der kun få undersøgelser af MUC4 udtryk profil i human gastrisk cancer. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi udtrykket profiler af MUC4 samt MUC1 i tidlige gastrisk cancer væv, og fandt, at MUC4 og MUC1 ekspression i de tidlige gastriske cancere ville blive dårlige prognostiske faktorer ved lymfekar invasion, invasion blodkar og lymfeknude metastaser.

Som anti-MUC4 monoklonale antistoffer (MAB), 8G7 og 1G8, er kendt for at opdage forskellige steder i MUC4 molekyle. MAb 8G7 genkender en tandem gentagelsessekvens (STGDTTPLPVTDTSSV) af den humane MUC4α underenhed [14]. MAb 1G8 er rejst mod rotte-sekvens (rotte ASGP-2), genkender en epitop på rotte ASGP-2-underenheden, som svarer til det humane MUC4β underenheden, og viser en krydsreaktivitet med humane prøver [15]. Således blev en særlig vægt på sammenligningen af ​​to anti-MUC4 Mab'er ved Western blotting og IHC to gastrisk cancer cellelinjer, før IHC undersøgelse af humane mavekræft væv. Eftersom der er uenighed om den prognostiske betydning af disse anti-MUC4 MAbs, en litteraturgennemgang af MUC4 udtryk i forskellige kræftformer blev også udført.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

gastrektomi eksemplarer af 104 tidlige gastrisk kræft, som viser submucosa invasion, pT1b2, med eller uden lymfeknude metastaser, blev hentet fra fil mellem 1994 og 2008 i Kagoshima-shi lægeforening Hospital. Den gennemsnitlige alder af patienterne var 65,7 (standardafvigelse, 9,8, rækkevidde, 39-92 år, median alder, 66 år); 64 sager var mænd, og 40 tilfælde var kvinder. Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med hovedprincipperne i Helsinki-deklarationen, og godkendt af den etiske komité for Kagoshima-shi Medical Association Hospital (KMAH 2011-02-02). Informeret, blev skriftligt samtykke opnået fra alle patienter. I de tilfælde med mere end to histologiske typer blandet i en læsion blev hvert histologisk mønster vurdering uafhængigt, ifølge den japanske Klassificering af gastrisk karcinom (JCGC) [16].

Evaluering af monoklonale antistoffer for MUC4

Celler og dyrkningsbetingelser.

Humane gastriske cancer cellelinjer (SNU-16 og NCI-N87) og bugspytkirtelkræft cellelinjer (PANC1 og CAPAN1) blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Begge gastrisk cancer celler blev holdt i RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); PANC1 celler blev holdt i DMEM (Sigma-Aldrich); Capan1 celler blev holdt i DMEM /F-12 (Sigma-Aldrich). Alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (GIBCO, Breda, Holland) og 100 U /ml penicillin /100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich). Alle celler blev inkuberet i 5% CO2 ved 37 ° C og holdt ved sub-sammenflydende niveauer.

RNA-ekstraktion og RT-PCR.

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af RNeasy mini (Qiagen, Hilden, Tyskland) og kvantificeres ved NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Det opnåede mRNA (2 ug) blev revers transkriberet til cDNA med høj kapacitet RNA til cDNA kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). De følgende primere blev udformet til den efterfølgende PCR: MUC4, 5'TGGGACGATGCTGACTTCTC-3 ', 5'-CCCCGTTGTTTGTCATCTTTC-3'; ACTB, 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3 ', 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'. PCR blev udført med AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems) ved at følge fabrikantens protokol.

Protein ekstraktion og western blotting.

Totale cellelysater blev fremstillet under anvendelse RIPA buffer indeholdende protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Proteinkoncentrationen blev målt ved BCA-assay (Thermo Scientific, Rockford, IL). Samme mængde protein lysat blev opløst på 2% agarosegel indeholdende SDS og passivt overført til PVDF-membran natten over ved stuetemperatur. Membraner blev blokeret med 1% skummetmælk /PBST løbet af 2 timer og underkastet standard immunpåvisning procedure under anvendelse af specifikke primære antistoffer. De primære antistoffer er som følger: anti-humant MUC4 MAb 8G7 (1:1000, genereret af Dr. Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE) og 1G8 (1:1000, købt fra Invitrogen, Camarillo, CA), og anti-humant a-tubulin MAb DM1A (1:2,000, Sigma-Aldrich).

Immuncytokemi for dyrkede celler.

i MUC4 farvning i dyrkede celler, celler blev podet i 8-kammer slides (Becton Dickinson and Company, Franklin søer, NJ) og inkuberes i natten. Celler blev fikseret med 3,7% formaldehyd i 10 min ved stuetemperatur og farvet med MAb 8G7 (1:24,000) og MAb 1G8 (1:4,000) natten over ved 4 ° C. Signal detektion blev udført ved en immunperoxidase metoden i en Vectastain Elite ABC-kittet (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) ifølge producentens instruktioner.

Immunhistokemi for humane væv Salg

IHC til menneskeføde gastrisk karcinom blev gjort ved anvendelse af de følgende antistoffer i de maksimale efterfølgende sektioner i hver tumor. MUC4 blev påvist ved to MAb'er, 8G7 og 1G8. For den sammenlignende undersøgelse blev MUC1 udtryk også undersøgt af MAb DF3 (muse-IgG, TFB, Tokyo, Japan). IHC blev udført ved immunperoxidase fremgangsmåde som følger. Antigen genfinding blev udført ved hjælp af CC1 antigen hentning buffer (pH 8,5 EDTA, 10037 ° C, 30 min., Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) for alle sektioner. Efter inkubering med de primære antistoffer (MAb MUC4 /8G7 fortyndet 1:3000, 37 ° C, 32 min .; MAb MUC4 /1G8 fortyndet 1:500, 37 ° C, 24 min .; MAb MUC1 /DF3 fortyndet 1:50, 37 ° C, 32 min.) i phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (PBS) med 1% bovint serumalbumin, blev farvet på en Benchmark XT automatiseret slide farvningsværktøjet anvendelse af et diaminobenzidin detektion kit (Ultraview DAB, Ventana Medical Systems). For enkelhedens skyld er MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 bruges til at angive de mucin antigener detekteres af hvert antistof.

Scoring af resultaterne og statistiske analyser.

Fire blindet efterforskere ( YT, MH, MG og SY) evalueret de IHC farvning data uafhængigt. Når evalueringen afveg blandt de fire, blev en endelig beslutning foretaget af konsensus. Resultaterne blev evalueret baseret på procentdelen af ​​positivt farvede carcinomceller, og de procentvise data blev kategoriseret i seks kvaliteter ved anvendelse af følgende pointsystem: negativ, ingen af ​​carcinom celler farvet; svag, < 5% af carcinom celler farvet; 1+, at ≥5% < 25%; 2+, til ≥25% < 50%; 3+, til ≥50% < 75%; og 4+: ≥75% farves. Tilfælde med ≥5% af carcinomceller farvede blev betragtet som positive. Statistisk analyse blev udført ved nonparametriske metoder ved hjælp af EXCEL-Statistik Ver.3 software genereret af Hisae Yanai, Det Naturvidenskabelige Fakultet, Saitama Universitet (OMS Publishing, Japan).

Overlevelse af patienterne blev sammenlignet mellem gruppen med positive MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 eller MUC1 /DF3 udtryk og gruppen med negative udtryk ifølge Kaplan-Meier-metoden, og forskelle mellem overlevelseskurverne blev testet ved hjælp af log-rank test. En sandsynlighed på P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Evaluering af to monoklonale antistoffer for MUC4

For at undersøge forskellen i antistofspecificitet mellem 8G7 og 1G8, vi. udført RT-PCR, Western blotting og IHC-analyse under anvendelse af to gastriske cancercellelinjer, SNU-16 og NCI-N87 celler. Den MUC4 mRNA blev påvist i de to gastriske cancercellelinier (fig. 1a). I overensstemmelse med den foregående rapport [14], viste vores data, at 8G7 anerkendt en meget høj molekylvægt protein (over 500 kD, som var den forventede størrelse for indfødte MUC4). Tværtimod betyder 1G8 ikke viser nogen immunreaktive bånd (fig. 1B). Det samme resultat blev observeret i IHC analyse (fig. 1C).

immunhistokemisk farvning af gastrektomi Prøver Salg

Immunohistokemisk farvning af ikke-neoplastisk maveslimhinden.

I den ikke -neoplastic slimhinde af tilfældene med gastrisk cancer, blev MUC4 /8G7 udtryk undertiden i cytoplasmaet i overfladen mukøse epithelium og hyppigt men svagt i cytoplasmaet af fundiske og pylorus kirtler (figur S1 A og D). MUC4 /1G8 blev ofte udtrykkes i cellen spids og cytoplasma af overfladen mukøse epithelium og hyppigt men svagt i cytoplasmaet af fundiske og pylorus kirtler (figur S1 B og E), og blev set konstant på det vaskulære endotel. MUC1 /DF3 blev undertiden udtrykt i overfladen mukøse epithelium, og altid i de fundiske kirtler (især intenst ved cellepositionen spidser), men ikke i pylorus kirtler (fig S1 C og F).

Immunhistokemisk farvning af gastrisk adenocarcinom.

vi undersøgte gastrektomi eksemplarer af 104 tidlige gastrisk kræft (pT1b2), da vi ønskede at undgå de store degenerative forandringer, der ofte ses i avancerede kræft væv, og for at justere scenen for nøjagtig sammenligning mellem IHC resultater og de clinicopathologic faktorer.

Når mere end to histologiske typer blev blandet i en læsion i gastrektomi eksemplarer af 104 tidlige gastrisk kræft, blev hver histologiske mønster vurderes uafhængigt i henhold til JCGC [16]. Derfor, i de 104 gastrektomi prøver, kunne vi evaluere 197 carcinom foci af forskellige histologiske typer i alt.

Blandt de 197 læsioner, der var 15 læsioner af papillær adenocarcinom (PAP) (fig. 2A-D), 39 af godt differentieret rørformede adenocarcinom (tub1) (fig. 2E-H), 52 moderat differentieret rørformede adenocarcinom (tub2) (fig. 2I-L), 6 mucinous carcinomer (MUC) (fig. 2M-P), 8 af fast type, dårligt differentieret adenocarcinom (por1) (fig. 2Q-T), 47 af ikke-fast form dårligt differentieret adenocarcinom (por2) (fig. 2U-X) og 30 i signet-ring cellecarcinom (SIG) (fig. 2Y-b), baseret på forbindelse med fælles histologisk klassificering af gastrisk cancer i JCGC [16]. Ifølge sammenhæng i WHO klassifikation af tumorer i mave [17] såvel som i JCGC [16], pap og tub1 blev klassificeret i "godt-differentieret adenocarcinom", og por1 og por2 blev klassificeret i "dårligt differentieret adenocarcinom ". Dataene i udtrykket på MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 blev sammenfattet i figur 3. Den detaljerede antallet og procentdelen af ​​positivt farvede neoplastiske celler ved hjælp af pointsystemet blev opsummeret i tabel S1.

Expression profil MUC4 /8G7.

Blandt de 197 adenocarcinom læsioner blev MUC4 /8G7 udtrykt i 83 læsioner (42%). MUC4 /8G7 viste en signifikant højere den positive udtryk (≥5% af carcinomceller farvet) i godt differentierede typer (pap + tub1: 70%, 38/54) end at i dårligt differentierede typer (por1 + por2: 18% , 10/55) ( P
< 0,0001) (fig 3A, pile).. MUC4 /8G7 blev hovedsageligt udtrykt i cytoplasmaet af de neoplastiske celler i pap (Fig. 2B), tub1 (fig. 2F) og tub2 (fig. 2J), i de tilfælde med positive udtryk.

Expression profil af MUC4 /1G8.

Blandt de 197 adenocarcinom læsioner blev MUC4 /1G8 udtrykt i 95 læsioner (48%). MUC4 /1G8 viste signifikant højere den positive udtryk i godt differentierede typer (pap + tub1: 67%, 36/54) end i dårligt differentierede typer (por1 + por2: 36%, 20/55) ( P
= 0,0021) (fig. 3B, pile). MUC4 /1G8 blev udtrykt primært på cellen spidser PAP (fig. 2C), tub1 (fig. 2G) og tub2 (fig. 2K), eller i det intracytoplasmatiske mucin substans SIG (fig. 2a), i de tilfælde med positivt udtryk.

Expression profil MUC1 /DF3.

Blandt de 197 adenocarcinom læsioner, MUC1 /DF3 blev udtrykt i 62 læsioner (31%). MUC1 /DF3 viste signifikant højere den positive udtryk i godt differentierede typer (pap + tub1: 52%, 28/54) end i dårligt differentierede typer (por1 + por2: 13%, 7/55) ( P
< 0,0001) (fig 3C, pile).. MUC1 /DF3 blev udtrykt primært på cellen spidser af pap, tub1 og tub2 (Fig. 2L), i de tilfælde med positive udtryk.

Sammenligning af mucin udtryk i hvert histologiske type.

i tub1, udtryk satser MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 var væsentligt højere end for MUC1 /DF3 ( P
= 0,0106 og P
= 0,039, henholdsvis) (fig. 3, * 1). I por2, udtrykket på MUC4 /1G8 var signifikant højere end for MUC4 /8G7 ( P
= 0,0286), eller at af MUC1 /DF3 ( P
= 0,0005) (fig. 3, * 2). I SIG, udtryk på MUC4 /1G8 var signifikant højere end for MUC4 /8G7 ( P
= 0,0158), eller at af MUC1 /DF3 (SIG, P
= 0,0019) (fig . 3, * 3). I de andre histolgical typer (pap, tub2, muc og por1), var der ingen signifikant forskel i udtrykket satser blandt MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 (fig. 3).

Forholdet mellem MUC4 eller MUC1 ekspression og lymfekar invasion, invasion blodkar og lymfeknudemetastaser.

Semikvantitativ evaluering af lymfatisk invasion (ly), venøs invasion (v) og lymfeknudemetastase status (N) er defineret i JCGC [16]. Lymfatisk invasion (ly) blev evalueret som følger; ly0, ingen lymfatisk invasion; Ly1, minimal lymfatisk invasion; ly2, moderat lymfatisk invasion; og ly3, mærket lymfatisk invasion. For venøs invasion (v), tilsvarende evaluering (v0 til v3) blev udført under anvendelse elastisk farvning (Victoria-blå), som blev tilsat til hæmatoxylin-eosin-farvning. Det samlede antal lymfeknuder og antallet af involverede lymfeknuder ved hver nodal station (N) blev registreret som følger; N0, ingen regional lymfeknude metastaser; N1, metastase i 1-2 regionale lymfeknuder; og N2, metastase i 3-6 regionale lymfeknuder. Regional lymfeknude metastaser blev observeret i 55 patienter (N1, 41 tilfælde N2, 14 tilfælde). Der var ingen signifikant korrelation mellem de histologiske typer og lymfe invasion, venøs invasion eller lymfeknudemetastase status.

I hvert tilfælde den højeste score af de seks IHC kvaliteter (negativ, svag, 1+, 2+, 3+ eller 4+) i de forskellige histologiske typer blev regnet som IHC score i hver enkelt, fx "IHC score 4+" for en sag med [tub1 score, 3+; tub2 score, 4+]. Vi evaluerede overensstemmelsen mellem IHC score og ly, v og N faktorer hos hver patient. Som vist i tabel 1 blev MUC4 /8G7 ekspression relateret til lymfatisk invasion (r = 0,304, P
= 0,033). Den MUC4 /1G8 udtryk var relateret med lymfatisk invasion (r = 0,395, P
= 0,001) og lymfeknude metastaser (r = 0,296, P
= 0,045). Den MUC1 /DF3 udtryk var relateret med lymfatisk invasion (r = 0,357, P
= 0,032) og venøs invasion (r = 0,377, P
= 0,024).

Derudover undersøgte vi sammenhængen mellem IHC scoringer af MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3. Som vist i tabel 2, var der en korrelation mellem MUC4 /8G7 score og MUC4 /1G8 score (r = 0,486, P
< 0,0001). Derimod var der ingen sammenhæng mellem MUC4 /8G7 score og MUC1 /DF3 score (r = 0,267, P
= 0,202), og der var ingen korrelation mellem MUC4 /1G8 score og MUC1 /DF3 score (r = 0,245, P
= 0,269).

Forholdet mellem MUC4 eller MUC1 udtryk og overlevelse.

Blandt de 104 patienter, opfølgende data opnået for 87 patienter. Median opfølgningsperiode var 47,5 måneder (interval, 0-193 måneder). I de 87 patienter, én patient døde af mavens carcinoma 39 måneder efter operationen, én patient viste levermetastaser men overlevede i 78 måneder, og to patienter døde af andre sygdomme. I 85 patienter ekskl to patienter døde af andre sygdomme, Kaplan-Meier estimatet blev testet ved hjælp af log-rank test. Mellem den positive gruppe og negative gruppe (MUC4 /8G7 + vs -, MUC4 /1G8 + vs - eller MUC1 /DF3 + vs -), log-rank test af den samlede overlevelse (MUC4 /8G7, P = 0,27; MUC4 /1G8, P = 0,37; MUC1 /DF3, P = 0,22) og progressionsfri overlevelse (MUC4 /8G7, P = 0,85; MUC4 /1G8, P = 0,23; MUC1 /DF3, P = 0,83) viste ingen signifikante forskelle. Yderligere analyse af 42 patienter overlevede i mere end 5 år også viste ingen signifikante forskelle.

Diskussion

For nylig, vi har rapporteret, at ekspressionen af ​​MUC4 er en uafhængig dårlig prognostisk faktor pancreatobiliary adenokarcinomer [ ,,,0],10], [11], [12] samt lunge adenocarcinom [13] og oral pladecellekræft [9]. MUC1 er også blevet rapporteret at være en dårlig prognostisk faktor i forskellige humane neoplasmer [4], [5]. Vores tidligere studie i gastriske cancere, herunder både tidlige cancere og avancerede cancere viste, at MUC1 er en nyttig prognostisk faktor for dårligt resultat i patienterne [6]. I den foreliggende undersøgelse kan forholdet mellem mucin ekspression og patientens udfald ikke vurderes, fordi de gastriske cancere er i det tidlige tidspunkt, pT1b2 og de fleste af patienterne har haft et positivt resultat. Ikke desto mindre blev de følgende resultater opnået: (1) MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 udtryk var relateret med lymfatisk invasion. (2) MUC4 /1G8 ekspression blev relateret til lymfeknudemetastaser. (3) MU1 /DF3 ekspression blev relateret til venøs invasion. I Japan, ESD er det første valg behandling for tidlige gastrisk kræft [3]. Undersøgelse af MUC4 samt MUC1 i ESD prøver kan afklare, om den yderligere kirurgi, herunder lymfeknude dissektion eller hyppig opfølgning for metastaser er nødvendige.

Vores tidligere undersøgelser viste, at der ikke var nogen siginificant korrelation mellem MUC4 udtryk og MUC1 udtryk [10], [11], [12], [13]. i nærværende undersøgelse af mavens kræft i den tidlige fase, var der ingen siginificant korrelation mellem ekspressionen af ​​MUC4 og MUC1. Både MUC4 og MUC1 ekspression i mavens kræftformer kan være relateret med de dårlige prognostiske faktorer, såsom lymfe invasion, venøs invasion og lymfeknudemetastaser, ved hjælp af anden mekanisme.

I den tidligere undersøgelse af gastriske cancere under anvendelse MAb 8G7, Senapati et al. viste, at MUC4 /8G7 ekspression ikke var forbundet med tumortype, scenen eller med graden af ​​differentiering [18]. Interessant, viste deres resultater en 42% udtryk sats i trin I kræftformer (n = 19), hvilket er i overensstemmelse med vores data (MUC4 /8G7: 42% og MUC4 /1G8: 48%) i den foreliggende undersøgelse undersøger fase I cancere (n = 104). vores undersøgelse viste imidlertid, at både MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 udtryk var forskellige blandt de histologiske typer, og var betydeligt højere i de godt differentierede typer end i dårligt differentieret type. MUC1 /DF3 udtryk var også signifikant højere i godt differentierede typer end i dårligt differentieret type. Vi rapporteret, at MUC1 ekspression var høj i brønden differentieret adenocarcinom i gastriske cancere herunder avancerede cancere, og den høje MUC1 ekspression kan påvirke overlevelsen af ​​patienter med godt differentieret adenocarcinom i maven [6]. Den høje ekspression af MUC4 i brønden differentieret adenocarcinom kan også påvirke overlevelsen af ​​patienter med gastrisk cancer. I vores tidligere undersøgelse [6], satsen for høj ekspression af MUC1 /DF3 var signifikant højere i de avancerede gastrisk kræft end i de tidlige gastrisk kræft. Forholdet mellem MUC4 udtryk med invasionen af ​​gastrisk kræft ville være en interessant område af undersøgelsen.

Der er uenighed om den prognostiske betydning af MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 udtryk. Således har vi revideret 19 artikler i MUC4 IHC undersøgelse anvendes til forskellige humane cancer væv (tabel 3). Betydningen af ​​MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 kunne ikke vurderes i 8 af de 19 studier. En undersøgelse ved hjælp af polyklonale anti-MIUC4 antistof rapporterede, at MUC4 udtryk er relateret til en fovorabel resultat [19], tre undersøgelser viser ingen sammenhæng mellem MUC4 udtryk og prognose [20], [21], [22], de tre andre undersøgelser ikke har kommentarer på sammenhængen mellem MUC4 udtryk og prognose [18], [23], [24], og de resterende en undersøgelse af kræft i skjoldbruskkirtlen rapporterede ingen MUC4 udtryk i kræft [25]. På den anden side, i de øvrige 11 artikler, der var en tilsyneladende forskel af den prognostiske signifikans mellem MUC4 /8G7 ekspression og MUC4 /1G8 ekspression. De fleste undersøgelser anvender 8G7, der blev genereret mod human MUC4 er MUC4 /8G7 Udtryk med relation til aggressiv tumor adfærd eller et dårligt resultat i humane karcinomer [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],26]. I modsætning hertil de fleste undersøgelser anvender 1G8, som blev rejst mod rotte ASGP-2, beskrevet, at MUC4 /1G8 udtryk er relateret til et positivt resultat [27], [28], [29], [30], selv om en undersøgelse af pancreas adenocarcinom beskrevet, at MUC4 /1G8 ekspression er relateret til ringe overlevelse [31]. Denne klare forskel rejser spørgsmålet om, hvorvidt 8G7 og 1G8 har væsentligt forskellige karakterer. MAb 1G8 blev hævet ved anvendelse af rotte MUC4 epitop [15]. Human MUC4 og rotte MUC4 viser mere end 60% peptid sekvenslighed [32], men de er ikke identiske. Det er bemærkelsesværdigt, at IHC hjælp MAb 1G8 viser altid positiv farvning i det vaskulære endotel, hvilket er noget usædvanligt som et udtryk for MUC4 som er en af ​​medlemmerne af muciner.

Således har vi vurderet specificitet MAb 8G7 og Mab 1G8 ved Western blotting og IHC to mavekræft cellelinjer. Vores Western blotting-analyse viste, at MAb 8G7 genkendte et meget protein med høj molekylvægt (over 500 kD, som var den forventede størrelse for nativt MUC4), hvorimod MAb 1G8 ikke viser nogen immunreaktive bånd. IHC-analyse viste også MAb 8G7 positiv farvning men MAb 1G8 negativ farvning i de to gastriske cancercellelinjer. MUC4 mRNA blev også til udtryk i de to gastrisk cancer cellelinjer i den foreliggende undersøgelse, som vist i den foregående undersøgelse til analyse af kræft i bugspytkirtlen cellelinier ved RT-PCR og northen blot analyser [33], [34]. Både MAb 8G7 og MAb 1G8 reagerer med humane mavekræft væv, selv om placeringen af ​​MUC4 /8G7 og MUC4 /1G8 udtryk viste en markant forskel. I mavekræft væv blev MUC4 /8G7 hovedsageligt udtrykkes i cytoplasmaet af de neoplastiske celler i pap og badekar, mens MUC4 /1G8 blev udtrykt primært på cellen spidser af pap og badekar eller intracytoplasmatisk mucin stof SIG. Da den cytoplasmatiske ekspressionsmønsteret for MUC4 /8G7 ses også i pancreas adenocarcinom, intrahepatisk cholangiocarcinom, ekstra hepatisk galdegang carcinom, lungeadenocarcinom og mundtlige pladecellecarcinom [9], [10], [11], [12], [13 ], kan det intracytoplasmatiske MUC4 /8G7 udtryk mønster i mavekræft væv være rimelig. I modsætning hertil kan den lineære udtryk mønster af MUC4 /1G8 sammen med celle spidser af mavekræft væv afspejle ukendte funktioner eller karakteristika MUC4β underenheden påvist af MAb 1G8 rejst mod rotte epitop [15], som denne undersøgelse viste, at MUC4 /1G8 ekspression var relateret til lymfe invasion og lymfeknudemetastaser, der er dårlige prognostiske faktorer, selv i de tidlige gastrisk cancer. Især i por2 og SIG, ekspressionen på MUC4 /1G8 var signifikant højere end den for MUC4 /8G7 eller af MUC1 /DF3. Desuden var der en siginificant korrelation mellem MUC4 /8G7 udtryk og MUC4 /1G8 til udtryk i de undersøgte patienter. Således IHC signal MUC4 /1G8 påvist i gastrektomi prøver kan vise en signifikant betydning af opdaget af MAb 1G8 epitop, selv om der ikke var nogen reaktivitet MUC4 /1G8 udtryk i humane gastrisk cancer cellelinier (SNU-16 og NCI N87). Den opdaget af MAb 1G8 epitop er et område af interesse for fremtidig undersøgelse.

Som konklusion i nærværende undersøgelse af tidlige gastrisk kræft, MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 og MUC1 /DF3 udtryk blev observeret hovedsagelig i godt differentierede adenokarcinomer. Den MUC4 /8G7 ekspression blev relateret til lymfatisk invasion. Den MUC4 /1G8 ekspression blev relateret til lymfatisk invasion og lymfeknudemetastase. Den MUC1 /DF3 ekspression blev relateret til lymfatisk invasion og venøs invasion. Undersøgelsen af ​​MUC4 og MUC1 ekspression i mavens kræft ville blive en nyttig markør til at forudsige dårlige prognostiske faktorer relateret med fartøj invasion, selv i den tidlige fase.

Støtte Information
Figur S1. Salg In den ikke-neoplastiske slimhinde af tilfældene med gastrisk cancer, blev MUC4 /8G7 udtryk undertiden i cytoplasmaet i overfladen mukøse epithelium og hyppigt men svagt i cytoplasmaet af fundiske og pylorus kirtler (A og D). MUC4 /1G8 blev ofte udtrykkes i cellen spids og cytoplasma af overfladen mukøse epithelium og hyppigt men svagt i cytoplasmaet af fundiske og pylorus kirtler (B og E), og blev set konstant på det vaskulære endotel. MUC1 /DF3 blev undertiden udtrykt i overfladen mukøse epithelium, og altid i de fundiske kirtler (især intenst på cellen spidser), men ikke i pylorus kirtler (C og F). Original forstørrelse x 100 (A, B, C), × 400 (D, E, F)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0049251.s001
(TIF)
tabel S1.
Detaljeret antallet og procentdelen af ​​positivt farvede neoplastiske celler ved hjælp af pointsystemet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0049251.s002
(DOC)

Tak

Vi takker Mr. Y. Atsuchi, Mr. K. Matsuo, Ms C. Baba, Ms Y. Nishimura, Ms S. Yoshimura og Ms. I. Houjou for deres tekniske assistance.

• PLoS ONE: Høje niveauer af aromatiske aminosyrer i mavesaft i de tidlige stadier af mavekræft Progression
• PLoS ONE: CYP2E1 Rsal /Pst Polymorfi og Gastric Cancer følsomme: Meta-analyser Baseret på 24 case-control studier