Цели и задачи
<р> Измененная экспрессия эпителиального или стромы кавеолина-1 наблюдается (CAV-1) в различных типах злокачественных опухолей человека. Тем не менее, клиническое значение CAV-1 выражение в рак желудка (GC) остается в значительной степени неизвестны. Настоящее исследование направлено на изучение клинико-патологическими значимость и прогностическую ценность обоих опухолевых клеток и раковых ассоциированных фибробластов (CAFS) CAV-1 в GC.
Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального инновационного проекта Бакалавриат Китая (NO. 111048670) и Национального фонда естественных наук Китая (NO. 30900652). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи "
Конкурирующие интересы:. Гуйлинь Fanpu биотехнологии Co., Ltd дала технологическую поддержку строительства ТМА. Там нет патентов, продукты в разработке или реализуемой продукции, чтобы объявить. Это не меняет приверженность авторов на всех политик PLoS ONE на данных и материалов общего доступа.
материалы и методы
пациенты и последующая деятельность
Поскольку время было ограничено, а некоторые пациенты из больницы, так что трудно получить письменное согласие. Мы позвонили к каждому пациенту, объяснил наше исследование было использовано только для академических обменов, а не вред их здоровью, а также не содержали их личную информацию. Когда мы позвонили, нотариус присутствовал, и мы получили мобильный телефон короткое сообщение, которое мы требовали согласия пациентов, исследование, чтобы отправить нам. Если у пациента мертв, мы получили согласие от его законного представителя. И, наконец, мы получили устное согласие от всех 300 пациентов. В общей сложности 340 фиксированных формалином, залитых парафином тканей были получены от пациентов, диагностированных в период с июля 2005 года по февраль 2012 года, в том числе 300 ШС, 20 гастрита без кишечной метаплазии (IM) тканей и 20 гастрита с тканями обмена мгновенными сообщениями. Гастрит без обмена мгновенными сообщениями и обмена мгновенными сообщениями с образцами были получены из аденокарциномы paracancerous тканей. Серийный раздел подтвердили не опухолевой ткани не было найдено в этих образцах. Образцы были собраны из архивов Департамента патологии, Чжуннань больницы университета города Ухань (Хубэй, P.R. Китай). Гистологический диагноз и сорта дифференциации были определены в соответствии с Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) критерии для GC. Все образцы GC были классифицированы на основе классификации UICC TNM (2009). Два совета сертифицированных патологи (Yang GF и вентилятор LF) вновь подтвердил Гистопатологические особенности этих образцов. 326 образцов были успешно сохранены для дальнейшего анализа; В то же время, 14 образцов GC были потеряны из слайда во время иммунным окрашиванием. Клинико-патологическими факторами больных ГЦ были приведены в таблице 1. Для 247 больных ГХ имеется достаточно ткани для анализа опухолевых клеток и рака, связанного фибробластической CAV-1 иммунное окрашивание. Все эти 300 пациентов лечили радикальной резекции или циторедуктивного операции ГК, до введения химиотерапии или лучевой терапии. Это исследование было одобрено научно-исследовательского медицинского комитета по этике Института Школы фундаментальных медицинских наук, Ухань университета им.
<Р> Последующие действия начались на дату операции и закончилась в августе 2012 года Среди оставшихся 286 ГК тканей от пациентов , 257 поступил в нашей последующей когорты и 116 пациентов, которые успешно достигли пяти лет наблюдения или умерли из-GC были включены в анализ выживаемости. Пациенты, которые не достигли пяти лет наблюдения и умер от других заболеваний или из-за неожиданных событий, были исключены из исследования выживаемости. Средний период наблюдения из 116 пациентов было 62 (диапазон: 1-85) месяцев. Общая выживаемость была определена как интервал от момента операции до смерти. Болезнь выживаемость была определена как интервал от момента операции до рецидива. Диагноз рецидива был основан на следующих критериях: местный рецидив найден эндоскопической биопсии или релапаротомии; метастазирование по радиологической, ультразвуковой или цитологического исследования.
Ткань микрочипов Строительство
<р> были построены два набора микрочипов ткани (TMAS). Каждый набор содержал 5 TMAS, которые были установлены с 340 образцов. Наиболее представительные участки опухоли были определены на hematoxylin- и эозином окрашенных участков и отмечены на слайде. То, как мы построили TMAS и система микрочипов инструмента были одинаковыми с нашего предыдущего исследования [24], [25]. Как ранее исследования не сообщали о внутриопухолевой гетерогенность CAV-1 выражение в GC и наше технико-экономического эксперимента показали, что одно ядро на опухоль на TMA и больших участков показали хорошую согласованность [26], [27], [28], поэтому в тестировании эксперимент, одно ядро отбирали в каждом конкретном случае. Кратко, один сердечник с диаметром 1,5 мм был взят из каждого образца и вставляли в пустые "получателей" парафиновых блоков; эти блоки были разрезаны на секции (4 мкм) и использовали для анализа КТ-IHC.
на основе квантовых точек Иммунофлуоресценции Гистохимия
<р> CAV-1 иммунореактивность была обнаружена в одном наборе ТМА. Антитела, QDS, конъюгированный стрептавидин зонды (КТ-SA) с длиной волны излучения 605 нм и связанных с ними реагентов для детекции КАВ-1 были такими же, как и ранее [16] со следующими основными процедурами: deparaffinizing → поиска антигена → блокировании → первичного антитела для Cav -1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) → умывания и блокирование → биотинилированного IgG → умывания и блокирование → 605 нм КТ-SA → умывания → монтажа и наблюдения. Сигнал, полученный от маркировки клеток был обнаружен с помощью с помощью Olympus BX51 флуоресцентной микроскопии (CCD DP72). Сигнал был целевой КТ специфический, красный и фотостабильным. Аутофлюоресценции ткани-фон был зеленым. Так как CAV-1 обычно локализуется в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов [27], [29], которые изучали в каждом районе аэродрома, он может быть подан в качестве внутреннего положительного и контроля качества в КТ-IHC. TBS вместо CAV-1 первичного антитела служили в качестве отрицательного контроля.
Результаты оценивались двумя патологи (Yang GF и вентилятор LF) одновременно в той же Displayer , которые являются независимыми и ослепил клинических признаков исследования. Сравнивали оценки двух патологов и любые несоответствующие баллы переоцениваются переоценкой окрашенных образцов ткани на двух патологов для достижения консенсуса счет. Методика для озвучивания CAV-1 окрашивание опухолевых клеток и CAFS были одинаковыми. Лучшие результаты были определены путем объединения доли положительно окрашенных клеток и интенсивность окрашивания. Срезы сначала сканируются при низкой мощности. Затем клетки из пяти репрезентативных полей каждого образца при большом увеличении (200 ×) подсчитывали для CAV-1-окрашенных опухолевых клеток или CAFS. Область положительных (AP) дифференцируются клетки, как не следует: 0 (нет положительной области или положительной области &лт; 5%), 1 (положительная площадь 5-25%), 2 (положительная площадь 26-50%), 3 ( положительной области 51-75%) и 4 (положительная область > 75%). CAV-1 интенсивность окраски (IS) по численному значению не привело баллов: 0 (отрицательный: нет положительный сигнал), 1 (слабый: светлый или темный красный сигнал) и 2 (сильный: ярко-красный сигнал). рассчитывались Уровни экспрессии КАВ-1 в расчете на общий балл, как по следующему уравнению:. Распределение интенсивности (ID) = AP × IS
<р> пороговое значение для высокой и низкой экспрессии определяли на приемнике (эксплуатационная характеристика ROC) анализ кривой с относительно общей выживаемости. В соответствии с оптимальной чувствительности и специфичности кривой ROC по общему статусу выживания, 1.5 была определена в качестве оптимального среза для CAV-1 балл иммунофлуоресцентного в CAFS (идентификатор оценка ≥1.5 определен высокий уровень экспрессии и ID оценка &л; 1,5 указано низкая экспрессия) , 3.5 была определена в качестве оптимального среза для CAV-1 балл иммунофлуоресцентного в опухолевых клетках (идентификатор оценка ≥3.5 определен высокий уровень экспрессии и ID оценка &л; 3,5 указано низкая экспрессия).
Статистический анализ Результаты Экспрессия CAV-1 в различных желудочных поражениях локализации и экспрессия CAV-1 в гастрита без обмена мгновенными сообщениями, гастрит с IM и ГХ оценивали с помощью КТ-IHC с использованием поликлональных антител CAV-1. Сильная интенсивность пончика положительный сигнал CAV-1 в строме опухоли был внутренний контроль эндотелиальной экспрессии (фиг. 1А). В гастритом без тканей IM, отрицательный CAV-1 сигнал преимущественно в поверхностных слизистых клеток (фиг. 1А) и позитивный сигнал преимущественно в основание и горлышко фундального железистых клеток (рис. 1в). При гастритах с IM тканей, в некоторых случаях не показали распределение CAV-1 (рис. 1д), а некоторые показали положительную CAV-1 окрашивание в абсорбционной ячейке и бокаловидных клеток из метапластических желез (рис. 1G). Выражение CAV-1-иммунореактивности в основном наблюдалась в клеточной мембране (рис. 1 л) и цитоплазмы. Уровень сигнала скоринг был показан на рис. 1I-K и типичные примеры CAV-1 экспрессии в GC были показаны на рис. 2. колокализации КАВ-1 и α-SMA белки детектировали с помощью КТ на основе маркировки двойного иммунофлуоресцентного в GC, и анализировали с помощью мультиспектральных систем формирования изображений, чтобы точно определить CAV-1 выражение в CAFS (рис. 3). Распределение сигнала CAV-1 в фибробластах является случайным и не имеет никакого отношения со статусом CAV-1 в опухолевых клетках. Все 286 пробы GC были доступны для анализа CAV-1 иммунным окрашиванием в опухолевых клетках и 247 (86,4%) случаев имели достаточное количество ткани для анализа CAV-1 иммунным окрашиванием в CAFS. В таблице 3 приведены корреляции между опухолевыми клетками или CAFS в CAV-1 экспрессии и классические клинико параметры GC, такие как возраст, пол, Т стадии и состояния лимфатических узлов в одномерном анализе. Тем не менее, никаких существенных отношений не было найдено. Обсуждение <бр> Здесь мы сообщали, что CAV-1 иммунореактивности в основном наблюдается в клеточной мембране и цитоплазме. В гастритом без тканей IM, CAV-1 сигнал преимущественно обнаруживается в основании и шейки фундального железистых клеток. При гастритах с тканями обмена мгновенными сообщениями, CAV-1 окрашивание в основном находит в абсорбционной клетки и бокаловидных клетки метапластических желез. Этот результат согласуется с другом исследовании, в котором содержится анализ CAV-1 в желудочной ткани с помощью иммуногистохимии [27]. CAV-1 выражение постепенно уменьшается с прогрессированием GC и уровнем экспрессии в CAFS, а не в опухолевых клетках в определенной степени предсказывает рецидив и выживаемость у больных ГЦ. Наши результаты показали, что CAV-1 уровень экспрессии в эпителии клеток постепенно снижалась с злокачественной прогрессии GC. Аналогичные результаты были получены в другом исследовании [26] следственным CAV-1 экспрессию IM и GC, подразумевая, CAV-1 может рассматриваться как опухолевый супрессор в развитии GC. К тому же, как опухолевые клетки и CAFS CAV-1 статус экспрессии белка не коррелировали с типичными клинико-патологическими параметрами, такими как Т-стадии, стадии TNM и классификации Lauren. Это было в отличие от другого исследования [26], который показал, что сниженная экспрессия гена опухолевых клеток CAV-1 белка коррелировал с высоким T стадии, стадии TNM и метастазов в лимфатических узлах. Разница может быть связано с методом оценки: мы оценивали окрашивание путем умножения интенсивности и доли клеток, окрашенных и определили точку среза, что имел оптимальную чувствительность и специфичность кривой ROC на основе общего состояния выживания; в то время как в других исследованиях оценивали только процент иммуноположительных клеток и порог положительного или отрицательного, не было представлено. К тому же, чем больше размер выборки нашего исследования повлияли на результаты. CAFS являются одними из наиболее важных компонентов опухоли стромы, с важными функциями вызывая осаждение ЕСМ, регулируя эпителиальной дифференцировки и воспалительной реакции и взаимодействия с микрососудов секретируя матричные металлопротеиназы и фактор роста эндотелия сосудов [35]. Так как Cav-1 белок является необходимым условием структурным компонентом кавеол, измененное выражение CAV-1 белка в CAFS будут влиять различные патологические процессы и, следовательно, способствуют развитию опухолей. Потеря CAV-1 белка в CAFS способствует активации CAFS через активацию TGF-бета пути, поэтому облегчая опухоль микросреде ремоделирования и развитие опухоли [12]. Тем не менее, другое исследование, опубликованное в Cell Выводы В заключение, наше исследование оценивали экспрессию CAV-1 в обеих опухолевых клетках и CAFS и исследовали их клиническое значение для больных GC. Следует отметить, что выражение CAV-1 в CAFS, а не опухолевые клетки особенно применимыми в прогнозировании раннего рецидива и плохие перспективы выживания больных ГЦ, предполагая CAV-1 в CAFS может быть кандидатом терапевтической мишенью и полезным прогностическим маркером пациентов GC , Необходимы дальнейшие исследования, чтобы исследовать механизмы, с помощью которых высокие уровни CAV-1 в CAFS подавляют развитие GC и, возможно, разработать терапевтику ориентации CAV-1. Кроме того, дальнейшие клинические испытания будут иметь важное значение для проверки прогностическое значение CAFS CAV-1 в GC и может ли она способствовать персонализированного лечения противоракового. Авторы благодарят Dr. Kathryn Solka, кафедра биохимии, Rush University Medical Center для написания помощи.
<р> Мы использовали программное обеспечение SPSS 17.0 (Чикаго, Иллинойс, США) для проведения всех статистических анализов. Тест Фридмана применяли для анализа разности CAV-1 оригиналам среди различных желудочных поражений. анализ кривой ROC проводили для определения точки среза высокого или низкого уровня КАВ-1 и оценить прогностическую ценность CAV-1 выражение для общей выживаемости. Тест χ2 или точный критерий Фишера использовали для анализа корреляции между клинико-патологическими параметрами и CAV-1 выражение. тест ранговой корреляции Спирмена был проведен анализ связи между CAV-1 экспрессии в опухолевых клетках и CAFS. Общая выживаемость и выживаемость без признаков заболевания были оценены с использованием метода Каплана-Мейера и сравнивали с помощью теста долго ранга. Многофакторный анализ с использованием Cox пропорционального риска регрессионной модели была использована для проверки независимых значений прогноза. Два хвостатых P
-значения &л;. 0,05 считались статистически значимыми
<Р> Таблица 2 приведены исходные оценки КАВ-1 выражение в гастрита без IM, гастрит с IM и GC. В эпителиальной отделении, 30% (6/20) гастрита без обмена мгновенными сообщениями, 55% (11/20) гастрита с IM, 75% (15/20) ГК были забиты 0, показывая CAV-1 белка уровень экспрессии постепенно уменьшающуюся , Фридман тест показал, что разность CAV-1 окрашивания оценка между гастритом без IM, гастрит с IM и ГХ было статистически значимым ( P
= 0,012).
Корреляция Выражение CAV-1 между опухолевые клетки и CAFS
<р> Корреляция между опухолевыми клетками и CAFS в CAV-1 выражение также было проанализировано. Как было показано в таблице 3, в том числе 226 случаев с низкой CAV-1expression в опухолевых клетках, 121 (53,5%) пациентов показали низкую экспрессию CAV-1 в CAFS (фиг. 2А), а среди 21 больных с высоким уровнем экспрессии КАВ-1 в опухолевых клетках, 9 (42,9%) случаев отображается высокий уровень экспрессии КАВ-1 в CAFS (рис. 2в). Остальные 117cases показали статус отчетливое выражение в опухолевой клетке и CAFS (рис. 2Е и G). Нет значимая корреляция была основана между опухолевыми клетками и CAFS CAV-1 выражение (г = -0,20, P
= 0,751).
Клиническое значение CAV-1 Expression в опухолевых клетках и CAFS из GC
<Р> Кроме того, мы исследовали прогностическую ценность CAV-1 экспрессии в опухолевых клетках и CAFS. Анализ Каплана-Мейера и тест журнала ранга показали, что низкий уровень экспрессии CAV-1 в CAFS, а не в опухолевых клетках предсказывали плохую выживаемость. Медиана общей выживаемости с низким CAFS CAV-1 выражение подгруппа была 73,0 месяцев (95% CI, 55.589-90.411), в то время как в последующих интервале, высокая CAFS CAV-1 выражение подгруппа имеет расчетный коэффициент выживаемости приблизительно 0,8 (рис . 4А). Как показано на рис. 4B низкая экспрессия CAV-1 в CAFS также предсказал ранний рецидив пациентов GC. Рисунок 4C и D показали, что опухолевые клетки CAV-1 статус не имели значимой корреляции с общей выживаемости и выживаемости без признаков заболевания ( P
= 0,178 и 0,104, соответственно). Кроме того, совокупный 5 летняя выживаемость пациентов, у которых опухоли показали высокие CAFS CAV-1 выражение было 75,5% (95% ДИ 0.642-0.868), в то время как только 57,4% (95% ДИ 0.456-0.692) в низких CAFS CAV-1 группа ( P
= 0,053).
<р> в одномерном анализе, TNM стадии, Т стадии, состояние лимфатических узлов и CAFS CAV-1 уровня были обнаружены в значительной степени связаны с заболеванием выживаемость пациентов GC ( P
= 0,001, 0,003, 0,010 и 0,029, соответственно, таблица 4). ТНМ этап, Т стадии и CAFS CAV-1 уровня были достоверно коррелирует с общей выживаемости (<ЕМ> P
= 0,012, 0,006 и 0,013, соответственно; таблица 4). Для того, чтобы определить, был ли CAFS CAV-1 выражение является независимым предиктором рецидива и выживаемости GC пациентов, многомерный анализ проводился с использованием ЦОГ регрессионной модели опасности, наряду с возрастом, Т классификации, стадии TNM и другие особенности опухоли. Опять же, CAV-1 уровень в CAFS был независимо друг от друга, и в значительной степени связано с рецидивом GC пациентов и исхода ( P
= 0,034 и 0,005, соответственно, таблица 4). Напротив, опухолевые клетки CAV-1 уровень не в состоянии прогнозировать рецидив и выживаемость GC пациента в одновременной модели (таблица 4).
<Р> Смерть прогностическое значение CAV-1 порогов в опухолевых клетках и в CAFS анализировали также. Как показано на рисунке 5, CAV-1 уровень в CAFS предсказал смерть с хорошей производительностью; площадь под кривой была 0,627 (95% ДИ: 0.515-0.738; P
= 0,032). Принимая во внимание, CAV-1 уровень в опухолевых клетках не удалось предсказать смерть, с площадью под кривой 0,551. (95% ДИ: 0.438-0.664; P
= 0,393)
<Р> Роль CAV-1 белка в развитии опухоли опухоль-зависимой и купе-зависимой [12], [30]. CAV-1 ген локализован в локусе D7S522 хромосомы 7q31.1 человека, который часто удалены в некоторых типах опухолей [11]. Более того, КАВ-1 участвует в домене кавеолин подмостей и может вызывать ингибирование сигнального рецепторов цитокинов [14], что указывает на роль супрессора опухоли CAV-1. Опухоль поощрение активности CAV-1 широко подтверждается путем тщательного выявления ее уровни экспрессии и клинические значения в разновидностей рака, таких как язык плоскоклеточного рака пищевода плоскоклеточный рак, мочевого пузыря переходный карциномы, карциномы носоглотки и шеи плоскоклеточный рак [16], [31], [32], [33], [34]. CAV-1 имеет различные роли в опухолевых клетках и клетках стромы. Например, при раке молочной железы и рака простаты, потеря стромы CAV-1, но не опухолевых клеток CAV-1 предвещает плохой прогноз [6], [8], [12], [14], что указывает на купе-зависимой роли резонаторе 1.
сообщили противоположные функции CAFS Cav-1 белок, стромальных CAV-1 способствует опухолевой инвазии и метастазирования через силу зависящих от архитектурного регулирования микросреды [36]. Таким образом, роль CAFS CAV-1 остается неопределенным. Представленные здесь результаты продемонстрировали независимое прогностическое предсказатель GC с участием уровня экспрессии Cav-1 в CAFS. Низкая экспрессия CAV-1 в CAFS, но не в опухолевых клетках независимо друг от друга прогнозируемым раннего рецидива и плохой выживаемости больных GC. Анализ ROC указывает на смерть, предсказывающий значение низкой CAV-1 в CAFS. Результаты предполагало роль опухоли ингибирования из CAFS CAV-1 белка и были совместимы с нахождением в груди и рака простаты, который выяснены, что потеря стромальных CAV-1 предвещает плохой прогноз [8], [12], [15]. Кроме того, при раке молочной железы, то ясно, что с развитием рака, микроокружение опухоли становится гипоксическая и нишей плохое питание, стимулируя аутофагии в CAFS. Тогда ненормальное активированный аутофагия деградирует CAV-1 в CAFS. Конечно, существуют ли подобные механизмы в GC требует больше
пробирке исследования в области.
<Р> Кроме того, потеря стромы CAV-1 имеет большое прогностическое значение в ER (+), PR (+), HER2 (+), а также так называемые больных раком молочной железы тройной негативный (ER (-) /PR (-) /HER2 (-)). Одновременно с этим возбуждено эндокринная терапия не влияет на его прогностическую ценность, что делает его новый универсальный или широко применяется рак молочной железы прогностический маркер [37]. GC является четвертым общим и третье причинение смерти рака в мире [38], который до сих пор не хватает достаточного количества подходящих биомаркеров для прогностической оценки и персонализированного лечения противоракового. Пациенты положительно GC HER2 приносят пользу от лечения трастузумаб, однако, лишь немногие пациенты положительный HER2, например, только 19% больных ГХ показал положительный HER2 в нашем исследовании. В настоящее время, прогрессирующих больных GC с отрицательным HER2 по-прежнему страдают от плохого выживания. Таким образом, выявление более целей, которые подавляют развитие GC чрезвычайно необходимы. При этом, мы продемонстрировали значения с использованием стромальных белков в качестве биомаркеров в GC, которые могли бы способствовать Молекулярное типирование GC и, следовательно, лечения GC, проверив существенно важную роль опухоли стромы в развитии опухоли. Кроме того, проспективное исследование настоятельно рекомендуется, чтобы подтвердить прогностическую ценность и исследовать клиническую значимость обнаружения CAV-1 в CAFS.
<Р> Одна интересная вещь, что, хотя CAFS CAV-1 статус может быть использован в качестве предсказателя , при анализе корреляции между уровнями CAFS CAV-1 и классических клинико-патологическими параметрами GC, никакого существенного объединения не было найдено. Таким образом, способствуя опухолевой инвазии и метастазированию не может быть основным механизмом, с помощью которого потеря CAFS CAV-1 способствует развитию GC. Химиотерапия является наиболее распространенной вспомогательной терапии, которые рекомендуются для пациентов среднего и продвинутого этапа GC в Китае. В сочетании с результатами, представленными здесь, мы отмечали, что ли низкая экспрессия CAV-1 в CAFS коррелирует с устойчивостью к химиотерапии может быть примечателен проблема, заслуживающим дальнейшего изучения.
<Р> Наконец, в нашем исследовании, с помощью передовых квантовых точек на основе двойная технология маркировки иммунофлуоресцентного, CAV-1 белка в CAFS был точно расположен. Псевдоегипетском цвета совместно локализации изображения позволили нам оценить уровень CAV-1 в CAFS исключительно, однако, КТ-IHC и квантовых точек на основе технологии двойного иммунофлуоресцентного маркировки обычно не используется в клинических лабораториях. Иммуногистохимия является наиболее широко практикуется технология в клинических лабораториях. Наше предыдущее исследование демонстрирует, что метод КТ-IHC как чувствительный и специфический как IHC [22]. Если вы хотите, чтобы обнаружить одновременно двух различных белков, таких как CAV-1 и a-SMA в одном слайде, квантовые точки на основе двойной маркировки представляет собой новый, надежный и альтернативный метод, с помощью которого мы можем получить результаты как можно точнее.
Выражение признательности