Plos ONE: MicroRNA-206: Učinkovito zavira Rak želodca napredovanje skozi c-Met Pathway

Povzetek

MicroRNAs so endogeni kratke verige nukleotidov RNA, ki uravnavajo delovanje genov, ki jih neposredno vezavo ciljnih mRNA. V tej študiji smo raziskali učinke microRNA-206 (miR-206) na razvoj raka želodca. miR-206 je bil prvič potrdili, da bodo navzdol reguliranih v želodčnih osebkov raka. Nasprotno pa je bila Povecanje c-Met potrjena v vzorcih tkiva človeškega raka želodca, s stopnjo obratno korelaciji z miR-206 izražanja. Uvedba miR-206 blokiranem celično proliferacijo z indukcijo G1 celičnega ciklusa aretaciji, kot tudi migracije in invazijo. Poleg tega so bili potrjeni pomembni proliferacije in /ali migracije povezane molekule, kot so c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt in p-ERK se navzdol reguliranih z Western blot analizo. Ciljanje c-Met tudi neposredno vpliva proliferacije AGS celic, migracije in invazijo. V vivo
, miR-206, ki izražajo tumorske celice prikazani tudi rast zamuda v primerjavi z neprizadetih tumorskih celic. Naši rezultati pokazali, da miR-206 zatreti c-Met izražanje pri raku želodca in lahko deluje kot močan zaviralnih v c-Met Tumorji s prekomerno ekspresijo. Zaviranje miR-206 funkcijo lahko prispevajo k odklonskega celične proliferacije in migracije, ki vodi do razvoja raka želodca

Navedba. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) MicroRNA-206: Učinkovito zavira Rak želodca napredovanje skozi c-Met Pathway. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10,1371 /journal.pone.0128751

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonska

Prejeto: 4. februar 2015; Sprejeto: 1. maj 2015; Objavljeno: 17. julij 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. To delo je bilo podprto, v delu, ki ga je National Natural Science Foundation Kitajske Grant 81100671 (DY), province Zhejiang Natural Science Foundation of China Grant Y2110609 ( DY) in Wenzhou Science & Tehnologija Bureau Grant Y20080096 (DY). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok raka povezanih smrti v svetu [1]. Njena obolevnost in smrtnost je še posebej izrazita v azijskih državah zaradi različnih vplivov [1]. Ker je njena predstavitev pogosto povezana z napredovalo boleznijo, je nujno potrebno za napredek v svojem odkrivanju in nenazadnje njegovo upravljanje. Trenutno je razumevanje microRNAs (miRNAs) glede vplivanja na nastanek raka želodca se pojavljajo na hitro.

Od prvega opisa miRNA v ogorčice C
. elegans
leta 1993, je vpliv teh malih nekodiranih RNA prekoračil več vej molekularne biologije [2]. MiRNAs so zelo tkiva specifične biomarkerjev z možnostjo spreminjajo in preoblikujejo rezidenta tkivo. Ker so overexpression in pod-izraz tako je bila povezana z tumorigeneze [3], njihove vloge so onkogeni in zaviralnih genov sta oba uveljavljena [4, 5]. V zadnjih nekaj letih, njihov vpliv na razvoj in odkrivanje tumorjev trdnih organov, vključno z rakom želodca se počasi pojasnjen. Obstaja že več miRNAs opredeljeni v raka želodca anti-apoptotske mehanizmom, kot so pokoj-21 in miR-148a [6, 7]. Druge poti, ki jih miRNAs vplivajo vključujejo napredovanje celičnega ciklusa, ki obsega miR-222/221, MIR-106b /93/25 in miR-24 [6, 7].

Ena od drugih obetavnih novih miRNAs za trdne organa tumorji vključuje MIR-206 [8]. To še posebej miRNA spada v skupino "myomiRs", ki je vključena v skeletnih mišicah razvoj [9]. Potem ko je bila povezana s številnimi drugimi boleznimi, vključno z boleznimi srca, kronična obstruktivna pljučna bolezen in Alzheimerjeva bolezen, njegova vloga v onkogenezo prejela nadzor nedavno tudi rabdomiosarkom, pljučnega raka, kolorektalnega raka, švanom in rak želodca [8, 9]. Čeprav povišano nekaj vrst raka, vključno z jajčnikov in Waldenstromovo makroglobulinemijo je miR-206 večinoma zatreti v tumorjih trdnih organskih [9]. miR-206 je bilo predhodno prikazano, da inhibira proliferacijo rakavih obolenj želodca delno zatiranju ciklin D2 [10]. V tej raziskavi smo se osredotočili na vlogo miR-206 v želodcu onkogenezo raka prek c-Met pot, ki je nekdaj vplivnega signalno pot za onkogenezo v različnih tumorjev [11]. c-Met bilo predvideno, in pokazala, da je ciljni gen več miRNAs vključno miR-206 [9, 12].

Rezultati

Zatiranje miR-206 je vodila k večji c-Met izraz na raka želodca

Real-time RT-PCR analiza je bila opravljena za odkrivanje izražanje miR-206 v 40 želodčne vzorcih raka in normalnih tkivih. Ravni miR-206 v večini vzorcev tkiva tumorja želodca (34/40), je bilo ugotovljeno, da so bistveno nižje od normalnih tkiv (slika 1A). miR-206 ekspresijo obratno sorazmerna s stopnjo c-Met opazili v vzorcih tumorjev (slika 1B). Večina vzorcev tumor, z zmanjšano miR-206 ekspresijo, so pokazali visok odstotek (> 50%) v c-Met obarvanjem. Nasprotno, tumorji z normalno izražanje miR-206 so pokazali zelo slabo ali negativno c-Met izraz.

miR-206 povzročene G1 prijetje in širjenje zaviral celic, migracije in invazijo AGS želodčnih rakavih celic

Kot je miR-206 izraz zmanjšal v želodčnih vzorcih raka, smo skušali ugotoviti, ali je imela uvedba miR-206 vsak biološki učinek na AGS celic. AGS celice transficirane z miR-206 molekule pokazala inhibicijo rasti celic v primerjavi z negativno kontrolo na osnovi MTS testom (slika 2A). FACS analize celic pokazala G1 aretacijo celičnega ciklusa (S1 Fig). Število kolonij se je zmanjšalo tudi transfekciji miR-206 (S2 slika).

miR-206 lahko zavirajo migracijo in vdor AGS celic (slika 2B in S3 sliki). so opazili dramatično zmanjšanje migracij v smeri nižjih zbornice v miR-206 transfekciji AGS celic (86 ± 15 vs 165 ± 16 v AGS celicah, P
< 0,01, n = 3). Poleg tega, transfektiranih s miR-206 je pokazala, da je bila HGF inducirane invazivnost tudi bistveno ovira naslednje MIR-206 transfekciji (57 ± 12 vs 116 ± 14 v AGS celicah, P
< 0,01, n = 3).

miR-206 navzdol reguliranih c-Met izraz in proteinov drugih celic, povezane cikla

prej smo prepoznali c-Met kot neposredni cilj miR-206 [9]. Western blot analizo potrdili, da je c-Met izraz zmanjša za miR-206 transfekciji v AGS celic (slika 3). Hkrati zunajmaternične miR-206 tudi navzdol regulirano ekspresijo CDK4, p-Rb, p-Akt in p-ERK.

downregulation c-Met inhibira proliferacijo želodčni rak celic, migracije in invazije

Next, c-Met specifične siRNA je bil prvič uporabljen za zmanjšanje izražanje c-Met v AGS celic (S4 Fig). MTS teste smo izvedli za odkrivanje proliferacije celic. AGS celice, transficirane s c-Met siRNA pokazala zmanjša rast celic v primerjavi z negativnimi kontrolnimi celicami (slika 4A, 25.10 ± 3,81% zmanjšanje). Oba HGF inducirane migracije in invazije so se zmanjšale, ko so primerjali c-Met siRNA transfekcije celic negativne kontrole transfekcije celic. Kot je prikazano na sliki 4B in S5 sliki, zmanjšanje migracije (88 ± 10 v primerjavi s 155 ± 15, P < 0,01, n = 3) in invazija (72 ± 7 v primerjavi z 126 ± 12, P < 0,01, n = 3) sta bila oba statistično značilne.

Uvedba miR-206 zatreti rast tumorja in vivo

Naslednja raziskati, če bi prekomerno miR-206 zatirajo rast tumorjev vivo
. Po 8 tednih so bile v povprečju volumne tumorjev bistveno nižja od celic, okuženih z lentivirusom izražajo miR-206, v primerjavi s kontrolo (slika 5).

Diskusija

rak želodca ostaja pomemben zdravje skrbi breme po vsem svetu kljub letih raziskav [1]. Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije, želodčni rak ostaja eden najboljših etiologij raka z visoko stopnjo umrljivosti [1]. Kot pri drugih tumorjev trdnih organov, je vse bolj jasno, da je boljše razumevanje tumorja onkogenezo potrebno izboljšati prognozo teh bolnikov. Ker prevladuje v azijskih državah, podatki pa se pojavljajo v vlogi miRNAs o razvoju ali zatiranje želodcu raka [6].

miRNAs so dvojno funkcijo v smislu želodca razvoj raka [6, 13]. Nekateri miRNAs so tumorske valov in drugi so oncomiRs [6]. Ueda sod. Najdenih 22 miRNAs molekul in 13 navzdol reguliranih v plazmi bolnikov z rakom želodca [13]. Cilji, ki so v postopku preiskave v primeru raka želodca vključujejo regulatorji P16, preko miR-24, in p21 skozi miR-222/221 in pokoj-106b /93/25 [6]. Druge, kot miR-21, lahko povečana pri največ 92% vzorcev želodčnega raka tkiva [14]. Kandidati, opredeljene v raka želodca, ki služi kot tumorskih razbijal vključujejo MIR-181b, MIR-101 in MIR-486 [6]. Na primer, miR-101 mislil, da ciljno EZH2, COX-2, MCL-1 in FOS [15]. miR-486 je mislil, da vplivajo na OLFM4, lahko vplivajo na apoptozo navzdol [16].

Potem ko je ugotovila, da je večina miRNAs služijo kot tumorskih razbijal, smo raziskovali c-Met poti pri raku želodca. Pri preučevanju c-Met pot za rhadbomyosarcoma, smo ugotovili pomen te poti v sarkomom [9]. c-Met je znano, da je dysregulated raka želodca [11, 17-19]. The Met proto-onkogena kodira protein, znan kot hepatocitnega rastnega faktorja (HGF) receptorja, ki poseduje tirozin kinaze [18]. Mi običajno zdi, da je izražena le v matičnih celic, vendar so videli tudi svojo frakcijo v onkogenezo [18]. V tej študiji smo lahko potrdili, da je c-Met bistveno povezani z rakom želodca in njeno vlogo kot cilj miR-206 je ključnega pomena v onkogenezo.

napredovanje celičnega cikla je dysregulated pri raku želodca. Na podlagi prejšnjih poročilih, je ciklin D2 povišano raka želodca, ko je miR-206 prizadeta [10]. miR-206 je bilo dokazano, da je močan prognostični dvojno podajo [10]. Njena downregulation je povezana s krajšim celotnem preživetju. Obnova miR-206 vodi do G0 /G1 ustavitev celičnega cikla, kar potrjuje svojo vlogo zaviralnih. Naše delo je tudi pokazala, da so prizadete celični cikel disregulacijo s CDK4 in fosforiliranim-Rb. CDK4 je član cycline odvisne kinaze družine z ser /thr aktivnostjo protein kinaze. To vodi do G1 faze napredovanja. Poleg tega kinazo vodi fosforilacijo Rb, ki je tumorski supresor vključen v razvoj celičnega cikla.

Čeprav so bili podobni rezultati potrjena na želodca, jajčnikov in dojk raka, vloga miR-206 Zdi da imajo ravno nasproten učinek na raka na debelem črevesu [6, 20]. Obratno sorazmerje so opazili med miR-206 in KLF4 v senatu človekovih raka debelega [20]. KLF4, ki ima onkogenih lastnosti v drugih vrst raka, kot na dojki, koža in pljuča, deluje kot supresorski tumorja pri raku debelega črevesa [20]. Njegov promotor je hiper-metilirani s povišano ravnijo Mir-206, ki vodijo do downregulation od KLF4 [20]. Te ugotovitve kažejo, da miR-206 morda ne bo deloval podobno v vseh epitelijskih celic, ki zanika ena velikost ustreza vsem pristop kemoterapevtiki.

V tej študiji smo identificirali mehanizem za regulacijo c-Met genske ekspresije s pokoj-206 raka želodca. Zdi se, da je skupni vzrokov za patogenezi raka želodca v večini vzorcev obravnavanih v tej študiji c-Met prekomerno po miR-206 downregulation. V povzetku, smo dokazali, da miR-206 negativno modulira signalno pot c-Met vključeni v celično proliferacijo in migracije. Naše raziskave bo, upajmo, pomembne klinične posledice zdravljenja raka želodca. miR-206 je kandidat tako imunohistokemično ugotavljanje manjših tumorjev in možne tarče za biološkega zdravljenja.

Materiali in metode

celični kulturi

Človeško želodčni rak celična linija, AGS, kupljene iz ATCC (Manassas, VA), je zrasla v Ham je F-12 medij (Invitrogen, Carlsbad, CA) z dodatkom 10% fetalnega bovinega seruma. (FBS; Hycolne-a, Logan, UT)

etika izjava

Ta študija je bila izvedena v strogo v skladu s priporočili in odobritvijo Wenzhou Medical University Care živali in uporaba odbora (številka dovoljenja: WZMCOPT-043011). Štirideset tumorja želodca osebki in običajna donatorske želodčnih tkiva so bili pridobljeni iz drugega povezana bolnišnici Wenzhou Medical University (Wenzhou, Kitajska). Zbiranje vzorcev je odobril Odbor za etiko Medical University Wenzhou na raziskave, ki vključujejo ljudi predmete in pisno privolitev je bila pridobljena iz vsakega primera. Vse poskuse smo izvajali v skladu z določbami Helsinške deklaracije in nacionalno zakonodajo.

Kvantitativne RT-PCR

Total RNA je bila vzeta iz človeških vzorcev želodca tumorjev in običajnih kontrol z TRIzola reagenta (Invitrogen). 10 ng celotne RNA smo uporabili cDNA sintezo ga TaqMan MicroRNA reverzno transkripcijo Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), in miR-206 nivo ekspresije je količinsko ga je TaqMan MicroRNA Vsebnost (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR smo izvedli z uporabo Applied Biosystems VIIa 7 PCR v realnem času System (Applied Biosystems).

Imunohistokemijsko od c-met

oddelke formalinu fiksno parafin, vgrajeni človeške želodčne tumorske osebki (5 um) so bile nato de-paraffinized s ksilenom in etanola. Ploščice smo obdelali z 0,3% vodikovega peroksida in nato inkubiramo preko noči pri 4 ° C s c-Met protitelesa na 1: 300 redčenje (SU, Beverly, MA). Imunohistokemijsko smo izvedli s pomočjo predvidevamo HRP sistem /odkrivanja DAB (Dako, Glostrup, Danska).

Cell proliferacijo vsebnosti

AGS celice zasadimo pri 2000 celicami na vdolbino v 96-vdolbinami ( Costar, High Wycombe, Velika Britanija) za vsako transfekciji. Transfekcije smo izvedli z reagenta (Lipofectamine RNAiMAX; Invitrogen), v treh izvodih. Za vsako vdolbino smo uporabili 50 nM miR-206 posnema molekula (Ambion, Austin, TX) ali negativno kontrolo (Ambion) transfekciji. Po 72 urah kulture, je celična proliferacija ocenil MTS testom (CellTiter 96 vodnem, Promega, Madison, WI).

Transwell migracije testi

24 ur po transfekciji AGS celice požanjemo s trypsinization in izperemo enkrat z raztopino D-Hanks (Invitrogen). Za merjenje migracijo celic ali invazijo, 8-um velikost luknjic kulture ali Matrigel vložkov (Transwell; Costar) so bili postavljeni v breznih kulture plošče 24 vdolbinami. V spodnji komori, 400 u.l, F-12, ki vsebuje 10% FBS in dodali 20 ng /ml HGF. Nato smo 5x10 ^{4 celice dodali zgornjo komoro. Po 20 urah inkubacije, so bile celice, ki so prehajali skozi pore obarvali s kristal vijoličnim in opazili pod mikroskopom (Zeiss, Oberkochen, Nemčija) ob uporabi cilja 20x.}

Western blot analizo

AGS celice (1x10 ^{5) zasejemo v 6 vdolbinami in gojene v F-12, 24 ur pred transfekcijo. 72 ur po transfekciji celice speremo s hladnim PBS in podvržemo liznega pufra (35 mM Tris-Cl [pH 6,8], 20 g /l natrijevega dodecil sulfata [SDS], 100 mM ditiotreitola). Proteinske lizate (20 mikrogramov vsakega) ločimo z uporabo 8% SDS-poliakrilamidnem gelu elektroforeza, nato elektro-preneseno na nitrocelulozo filtrskih membran. Membrane smo blokirali s pufrom, ki vsebuje 5% nemastnega mleka v PBS z 0,05% Tween-20 za 2 uri in inkubiramo preko noči pri protitelesom pri 4 ° C. Po drugem izpiranju s PBS, ki vsebuje 0,05% Tween-20, smo membrane inkubirali s peroksidazo konjugiranih sekundarnih protiteles (Millipore, Darmstadt, Nemčija), ter razvili z izboljšano komplet za odkrivanje kemiluminescenca (Pierce, Rockford, IL). GAPDH smo uporabili kot kontrolo obremenitve. Protitelesa za CDK4, p-Rb, ERK, Akt, p-ERK, so bili p-Akt, c-Met in GAPDH od signalizacijo med celicami tehnologijo (Beverly, MA).}

siRNA testi

c-Met-specifična siRNA (Ambion) in negativni kontrolni siRNA (Ambion) so bili uporabljeni za upocasnjujejo c-Met ekspresijo v AGS celicah. 50 nM c-Met-specifične siRNA ali negativni kontrolni siRNA je transfektirali v AGS celic s Lipofectamine RNAiMAX. MTS test je bil izveden 72 ur po transfekciji, medtem ko so Transwell in Matrigel teste opravili 24 ur po transfekciji, kot je opisano zgoraj.

V vivo
rast tumorja test

pre-microRNA izraz gradi Lenti-miR-206 in pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP nadzor nad prenašalci so bile kupljene iz sistema Biosciences (Mountain View, CA). AGS celice so bile okužene z lentivirusom izražajo miR-206 ali negativno kontrolo. Samice golih miši, 6 tednov starosti, smo inokulirali z AGS celic (8x10 ^{6), ki izraža MIR-206 ali negativne kontrole v svojih bokov, nato pa žrtvoval po 8 tednih. velikost tumorja je bila izmerjena in volumen je bila izračunana po formuli: ( L
x W
2) x 0,5, ( L
, dolžine; W
, širina), v skladu z metodo prej poročali [21]. Vse študije in postopke je odobril odbor za oskrbo živali in uporabe Wenzhou Medical University.}

Statistična analiza

Vsi podatki so prikazani kot povprečje ± SEM. Prikazani rezultati so izraženi kot srednja vrednost ± SEM rezultatov, pridobljenih iz treh izvodih v enem poskusu. Rezultati predstavljajo tisti, pridobljeni v treh ločenih poskusih. Razlike med eksperimentalnimi skupinami in kontrolni skupini smo analizirali z uporabo Student je t
-test. Statistična značilnost je bila sprejeta na P
< 0.05.

Podpora Informacije
S1 Sl. FACS analizo AGS celic transficiranih z miR-206.
AGS celice zberemo 48 ur po transfekciji z miR-206 ali NC, obarvali s propidijevim jodidom in analiziramo s pretočno citometrijo. Deset tisoč celice so bili ocenjeni v vsakem vzorcu. Najbolj reprezentativne rezultate v treh neodvisnih poskusih so upodobljeni
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s001
(IOD)
S2 Sl. Tvorba kolonija test.
AGS celice transfektirane z miR-206 ali NC smo zasejali v nizko gostoto. Po 7 dneh smo tvorbe kolonij določimo z obarvanjem s kristalno vijolično. Značilni rezultati v treh neodvisnih poskusih so prikazani
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s002
(IOD)
S3 Sl. Učinki miR-206 na AGS celice so bile ocenjene z Transwell in Matrigel testov.
Število celic, ki so prešle skozi kulturo vstavite pore na (do) ali pa so vdrli skozi vložek pore Matrigel (navzdol), je bila fotografirana z uporabo 20X mikroskop cilj
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s003
(IOD)
S4 sl. . Downregulation c-Met ga siRNA
Western blot analiza je bila izvedena za potrditev zatiranje c-Met izražanja po Lipofectamine transfekciji AGS celic bodisi s c-Met siRNA ali negativno kontrolo (NC)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s004
(IOD)
S5 sl. Učinki c-Met siRNA o AGS celice so bile ocenjene z Transwell in Matrigel testov.
Število celic, ki so prešle skozi kulturo vstavite pore na (do) ali pa so vdrli skozi vložek pore Matrigel (navzdol), je bila fotografirana z uporabo 20x mikroskop cilj
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s005
(TIF)

• Plos ONE: Exosomal miRNAs od potrebušnice izpirku kot potencialne Prognostic biomarkerjev peritonealne metastaze želodčnega raka
• Plos ONE: Izboljšanje učinke sevanja, ki ga ursolna kisline v BGC-823 Human Adenokarcinom želodca Cancer Cell Line